利用延时显微技术观察缺氧诱导的悬浮动画现象 秀丽隐杆线虫 胚胎

摘要

此处描述的是一个 体内 一种利用气体流经式微型培养室结合转盘共聚焦显微镜，对暴露于无氧环境的动物进行亚细胞结构成像的技术。该方法简便且具有足够的灵活性，可适应多种实验参数和模式系统。

摘要

秀丽隐杆线虫 在抗逆性研究中得到了广泛应用，这得益于其成体和胚胎阶段的透明特性，以及大量可获得的遗传突变体和表达多种融合蛋白的转基因品系。^1-4此外，通过使用荧光标记的报告蛋白，可以观察细胞分裂等动态过程。通过在包括完整生物体在内的多种系统中进行延时实验，可促进对有丝分裂的研究；因此，早期 秀丽隐杆线虫 胚胎非常适合本研究。本文介绍了一种方法，通过该方法 体内 缺氧条件下（99.999% N₂）亚细胞结构的成像₂; <2 ppm O₂) 应力可通过高倍显微镜下的简单气流装置实现。通过微培养室结合氮气流以及转盘共聚焦显微镜，可构建受控环境，用于对生物样本进行成像 体内利用GFP标记的γ-微管蛋白和组蛋白，可在缺氧环境暴露前、暴露期间及暴露后监测细胞分裂的动态过程和分裂停滞情况。该技术的结果为高分辨率、详细的视频和图像，呈现了暴露于缺氧环境的胚胎卵裂球内细胞结构的变化。

方案

1. 样品制备

1. 产生或获取合适的转基因生物 秀丽隐杆线虫 使用转基因方法或从感兴趣的菌株 秀丽隐杆线虫 遗传学菌种中心（CGC）或同事。本实验中我们使用的是品系 TH32（pie-1::tbg-1::GFP；pie-1::GFP::H2B)⁵ 以染色体和中心体作为细胞分裂的标记物进行可视化观察。
2. 通过以下三种方法之一生成同步化群体：1）用次氯酸盐溶液裂解怀卵成虫，利用残留的胚胎⁶，2）挑取带有卵的成虫至接种平板，让其产卵1-2小时，或3）从混合种群中挑取L4期幼虫，转移至新的接种平板。
3. 在20 °C下培养线虫至产卵前期成虫阶段，从孵化起约需96小时，从L1幼虫起约需72小时，或在L4蜕皮后约24小时。胚胎（2-20细胞） 在子宫内 含有较大的卵裂球和细胞核，分别适用于成像细胞内和核内的亚结构变化。该方法可提供一种手段，用于获得大量含有丰富早期胚胎的年轻成体群体。

2. 载玻片制备与缺氧室搭建

1. 通过在大型培养皿或带盖容器内放置一张湿润的纸巾，制备用于存放已准备好的载玻片的湿室。
2. 将去离子 H₂O 中的 2% 琼脂糖混合物置于玻璃器皿中，通过微波炉或水浴加热，制备熔融状态的琼脂糖溶液。
3. 在洁净的玻璃显微载玻片上滴加 1–3 滴温热的琼脂糖溶液。立即取另一张载玻片，倒置并垂直放置于琼脂糖液滴上方，轻轻按压，使形成的琼脂糖垫薄而无气泡。
4. 静置冷却后，小心分离两张载玻片，使琼脂糖垫完整保留在其中一张载玻片上。需确保琼脂糖垫足够薄，以免影响后续显微镜聚焦。样本的可视性还取决于所用物镜的特定光学工作距离，不同显微镜的该参数可能有所不同。
5. 使用洁净的刀片将琼脂糖垫修整成小正方形。将其存放于已准备好的湿室内，待用。
6. 使用同一把洁净刀片，小心地将琼脂糖垫从载玻片上取下，并转移至直径为 25 mm 的圆形盖玻片上，注意避免琼脂糖垫下方产生气泡。所选圆形盖玻片应能适配微孵育室。
7. 在琼脂糖垫上滴加一滴麻醉剂（0.5% 三卡因，0.05% 四咪唑溶于 M9 缓冲液），用于麻醉线虫。挑取 5–10 条线虫放入麻醉剂液滴中，静置 1–3 分钟，直至线虫停止运动。
8. 选择在成虫子宫内观察胚胎而非解剖后的胚胎，是为了最大限度减少胚胎因氮气流过而引起的脱水和移动风险。
9. 立即在虫体上方滴加一滴卤代烃油，以防止气体流经腔室时导致线虫脱水。由于卤代烃油黏稠，可使用移液器吸头或线虫挑取工具蘸取油滴并滴加至虫体上。
10. 当含有线虫的圆形盖玻片准备就绪后，将 Leiden 封闭式灌流微孵育室的两半分开，小心将盖玻片垂直放置于底部环上，然后将腔室两部分紧密闭合。
11. 通过柔性塑料管将腔室连接至氮气瓶，并将其置于显微镜载物台的指定位置（图 1C）。此时应仔细检查管路和微孵育室是否存在泄漏，确保管路连接牢固，腔室侧面的端口塞已紧密安装。也可在管路表面轻涂少量肥皂水，若有泄漏则会产生气泡。

3. 缺氧条件下的显微镜观察

1. 在低倍镜下定位动物，然后切换至合适的高倍镜（本应用使用64倍）以成像感兴趣的组织或细胞，例如胚胎卵裂球或成体中的卵母细胞。打开488 nm激光以观察GFP信号，并定位目标细胞中GFP融合蛋白。
2. 为了观察细胞周期特定阶段的阻滞现象（例如 晚前期）识别处于较早细胞分裂阶段的一个卵裂球例如 晚期间期或早期前期）。中心粒位置、染色体凝集的起始、染色体位置以及核膜的存在与否等细胞标志物将有助于鉴定细胞周期阶段（图2A).
3. 随后用氮气（99.999% N₂）对腔室进行灌注₂; <2 ppm O₂）。本实验中使用6 psi的压力，但根据每个微型培养箱的大小及所用管路的直径，可能需要调整和优化压力。在氮气填充腔室的过程中，持续观察卵裂球，并根据需要调整焦平面。
4. 此时，已开始进行延时成像。根据所需捕捉的目标现象（本实验中为前期停滞及染色体向核内膜的锚定）决定成像持续时间。每隔10秒采集一次图像，总时长不超过30分钟。图像采集频率以及增益、激光功率等参数应根据需要进行相应调整。
5. 胚胎对缺氧环境的响应时间可能因缺氧暴露时所处的细胞周期阶段而异。通常情况下，缺氧诱导的前期阻滞发生在开始通入氮气后的20至30分钟内。我们已观察到缺氧诱导的细胞周期阻滞发生于 <20 分钟内可获取图像，也可从延时成像序列中后期提取特定时间点的图像。另一种选择是使用视频显微镜观察胚胎中的亚细胞结构。
6. 为记录从缺氧诱导的停滞状态中恢复的过程，关闭气体供应，通过扩散使腔室恢复至常氧状态，同时采集延时成像序列。通常在关闭氮气后的5至20分钟内，细胞周期进程恢复，染色体解除锚定。
7. 注意，在单独的实验中，将缺氧指示剂刃天青（resazurin）置于流通式微型腔室中；结果确定，氮气开始通入后平均约19分钟，腔室达到缺氧状态。
8. 使用 Imaris、Image J 或 Photoshop 对图像和视频进行处理，并导入 QuickTime 中进行展示。

结果

秀丽隐杆线虫 遭受严重缺氧（无氧）的胚胎能够通过停止包括发育和细胞分裂在内的生物过程而存活⁷. 可通过微培养室结合氮气流与转盘共聚焦显微镜，在受控环境中对动物进行成像，从而在亚细胞水平上监测缺氧诱导的细胞分裂停滞 体内 (图1). 可在暴露于不同气体环境的胚胎中观察特定的细胞结构；本实验中，我们利用GFP标记的γ微管蛋白和组蛋白H2B来监测暴露于无氧环境胚胎中的染色体结构。

在暴露于无氧环境的胚胎中，前期卵裂球的染色体会发生凝集，并与核内膜边缘对齐，这一现象被称为“染色体锚定”（图2，视频1）。当重新供氧后，细胞周期进程将恢复，前期卵裂球的染色体会从核膜边缘移向赤道板，表明细胞进入中期（视频2）。该技术还可用于观察暴露于无氧环境的雌雄同体个体中，卵母细胞在减数分裂其他阶段的阻滞或二价染色体的状态⁸。

讨论

缺氧与悬浮动画

尽管某些生物暴露于严重缺氧环境可能致命，但有些生物却能够耐受缺氧环境并存活。以 秀丽隐杆线虫，缺氧暴露后的存活率取决于发育阶段，且对缺氧的响应是进入一种可逆的悬停状态，在此状态下多种可观察的生物学过程被抑制。细胞分裂、发育、运动、摄食和生殖过程均会停止，直至环境中重新引入氧气^7,9细胞周期在缺氧暴露的胚胎中可逆性地停滞于间期、晚前期或中期。在固定样品中使用免疫染色等细胞生物学技术 体内 GFP融合蛋白检测技术能够在无氧环境中对特定亚细胞结构进行成像，在识别和表征缺氧诱导的悬停生命状态特异性标志方面发挥了关键作用 秀丽隐杆线虫 ^8,10,11.

胚胎和卵母细胞在缺氧诱导的悬浮动画状态中均表现出显著特征，这些特征可通过荧光显微镜结合荧光标记蛋白或特异性蛋白抗体对固定胚胎进行分析而清晰观察到。处于缺氧条件下的胚胎间期卵裂球表现为染色质部分凝集以及细胞周期进程停滞，部分染色质排列于核膜边缘⁹。虽然核膜破...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备			成分
次氯酸盐溶液			0.7 g KOH，12 ml 5% NaOCl，用ddH2O定容至50 ml
M9缓冲液			3 g KH2PO4，11 g Na2HPO4，5 g NaCl，每1 L ddH2O中加入1 ml (1 M) MgSO4
玻璃显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-343	3"×1"×1.0 mm
圆形显微盖玻片	Electron Microscopy Sciences	72223-01	直径25 mm
卤碳油700	Sigma	H8898-100ml
麻醉剂			0.5% 三卡因，0.05% 四咪唑
Leiden封闭式灌流微型培养箱	Harvard Apparatus	650041
超高纯氮气	Calgaz (Air Liquide)		>99.9990% N2，<2 ppm O2
塑料管	VWR	89068-468	内径0.062" × 外径0.125"
转盘共聚焦显微镜	McBain Systems		蔡司倒置光学显微镜，落射荧光照明系统，Yokogawa CSU-10共聚焦扫描仪，Hamamatsu电子倍增CCD相机。