此处描述的是一个 体内 一种利用气体流经式微型培养室结合转盘共聚焦显微镜，对暴露于无氧环境的动物进行亚细胞结构成像的技术。该方法简便且具有足够的灵活性，可适应多种实验参数和模式系统。
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本文内容
摘要
摘要
秀丽隐杆线虫 在抗逆性研究中得到了广泛应用，这得益于其成体和胚胎阶段的透明特性，以及大量可获得的遗传突变体和表达多种融合蛋白的转基因品系。1-4此外，通过使用荧光标记的报告蛋白，可以观察细胞分裂等动态过程。通过在包括完整生物体在内的多种系统中进行延时实验，可促进对有丝分裂的研究；因此，早期 秀丽隐杆线虫 胚胎非常适合本研究。本文介绍了一种方法，通过该方法 体内 缺氧条件下（99.999% N₂）亚细胞结构的成像2; <2 ppm O2) 应力可通过高倍显微镜下的简单气流装置实现。通过微培养室结合氮气流以及转盘共聚焦显微镜，可构建受控环境，用于对生物样本进行成像 体内利用GFP标记的γ-微管蛋白和组蛋白，可在缺氧环境暴露前、暴露期间及暴露后监测细胞分裂的动态过程和分裂停滞情况。该技术的结果为高分辨率、详细的视频和图像，呈现了暴露于缺氧环境的胚胎卵裂球内细胞结构的变化。
方案
1. 样品制备
- 产生或获取合适的转基因生物 秀丽隐杆线虫 使用转基因方法或从感兴趣的菌株 秀丽隐杆线虫 遗传学菌种中心（CGC）或同事。本实验中我们使用的是品系 TH32（pie-1::tbg-1::GFP；pie-1::GFP::H2B)5 以染色体和中心体作为细胞分裂的标记物进行可视化观察。
- 通过以下三种方法之一生成同步化群体：1）用次氯酸盐溶液裂解怀卵成虫，利用残留的胚胎6，2）挑取带有卵的成虫至接种平板，让其产卵1-2小时，或3）从混合种群中挑取L4期幼虫，转移至新的接种平板。
- 在20 °C下培养线虫至产卵前期成虫阶段，从孵化起约需96小时，从L1幼虫起约需72小时，或在L4蜕皮后约24小时。胚胎（2-20细胞） 在子宫内 含有较大的卵裂球和细胞核，分别适用于成像细胞内和核内的亚结构变化。该方法可提供一种手段，用于获得大量含有丰富早期胚胎的年轻成体群体。
2. 载玻片制备与缺氧室搭建
- 通过在大型培养皿或带盖容器内放置一张湿润的纸巾，制备用于存放已准备好的载玻片的湿室。
- 将去离子 H2O 中的 2% 琼脂糖混合物置于玻璃器皿中，通过微波炉或水浴加热，制备熔融状态的琼脂糖溶液。
- 在洁....
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结果
秀丽隐杆线虫 遭受严重缺氧（无氧）的胚胎能够通过停止包括发育和细胞分裂在内的生物过程而存活7. 可通过微培养室结合氮气流与转盘共聚焦显微镜，在受控环境中对动物进行成像，从而在亚细胞水平上监测缺氧诱导的细胞分裂停滞 体内 (图1). 可在暴露于不同气体环境的胚胎中观察特定的细胞结构；本实验中，我们利用GFP标记的γ微管蛋白和组蛋白H2B来监测暴露于无氧环境胚胎中的染色体结构。
在暴露于无氧环境的胚胎中，前期卵裂球的染色体会发生凝集，并与核内膜边缘对齐，这一现象被称为“染色体锚定”（图2，视频1）。当重新供氧后，细胞周期进程将恢复，前期卵裂球的染色体会从核膜边缘移向赤道板，表明细胞进入中期（视频2）。该技术还可用于观察暴露于无氧环境的雌雄同体个体中，卵母细胞在减数分裂其他阶段的阻滞或二价染色体的状态8。
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讨论
缺氧与悬浮动画
尽管某些生物暴露于严重缺氧环境可能致命，但有些生物却能够耐受缺氧环境并存活。以 秀丽隐杆线虫，缺氧暴露后的存活率取决于发育阶段，且对缺氧的响应是进入一种可逆的悬停状态，在此状态下多种可观察的生物学过程被抑制。细胞分裂、发育、运动、摄食和生殖过程均会停止，直至环境中重新引入氧气7,9细胞周期在缺氧暴露的胚胎中可逆性地停滞于间期、晚前期或中期。在固定样品中使用免疫染色等细胞生物学技术 体内 GFP融合蛋白检测技术能够在无氧环境中对特定亚细胞结构进行成像，在识别和表征缺氧诱导的悬停生命状态特异性标志方面发挥了关键作用 秀丽隐杆线虫 8,10,11.
胚胎和卵母细胞在缺氧诱导的悬浮动画状态中均表现出显著特征，这些特征可通过荧光显微镜结合荧光标记蛋白或特异性蛋白抗体对固定胚胎进行分析而清晰观察到。处于缺氧条件下的胚胎间期卵裂球表现为染色质部分凝集以及细胞周期进程停滞，部分染色质排列于核膜边缘9。虽然核膜破.......
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致谢
我们谨向Padilla实验室成员提供的意见和建议表示感谢。本研究所用的线虫品系由秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供，该中心由美国国立卫生研究院研究资源国家中心（NIH National Center for Research Resources，NCRR）资助。我们感谢Lon Turnbull博士在共聚焦显微镜技术方面的协助。本研究得到了美国国家科学基金会（National Science Foundation，NSF-IOS，CAREER）向P.A.P.提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/设备 | 成分 | ||
| 次氯酸盐溶液 | 0.7 g KOH，12 ml 5% NaOCl，用ddH2O定容至50 ml | ||
| M9缓冲液 | 3 g KH2PO4，11 g Na2HPO4，5 g NaCl，每1 L ddH2O中加入1 ml (1 M) MgSO4 | ||
| 玻璃显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"×1"×1.0 mm |
| 圆形显微盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 直径25 mm |
| 卤碳油700 | Sigma | H8898-100ml | |
| 麻醉剂 | 0.5% 三卡因，0.05% 四咪唑 | ||
| Leiden封闭式灌流微型培养箱 | Harvard Apparatus | 650041 | |
| 超高纯氮气 | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2，<2 ppm O2 | |
| 塑料管 | VWR | 89068-468 | 内径0.062" × 外径0.125" |
| 转盘共聚焦显微镜 | McBain Systems | 蔡司倒置光学显微镜，落射荧光照明系统，Yokogawa CSU-10共聚焦扫描仪，Hamamatsu电子倍增CCD相机。 |
参考文献
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11<....
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