我们描述了通过流式细胞术负向筛选快速分离原代小鼠II型肺泡上皮细胞（AECII）的方法。这些AECII具有高存活率和高纯度，适用于多种功能和分子研究，以探讨其在自身免疫性疾病或感染性疾病等呼吸系统疾病中的作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
近年来，肺泡II型上皮细胞（AECII）在肺部免疫调节中所起的多种作用日益受到关注。研究表明，AECII可参与炎症气道中的细胞因子产生，并且在感染以及T细胞介导的自身免疫反应中甚至可发挥抗原呈递细胞的功能1-8。因此，在临床背景下，例如气道对异源性和自身抗原的高反应性，以及直接或间接靶向AECII的感染性疾病中，这类细胞也具有重要意义。然而，目前对于AECII在健康肺组织以及炎症状态下所承担的具体免疫学功能仍缺乏系统性的认识。许多关于AECII功能的研究采用小鼠或人类肺泡上皮细胞系进行9-12。使用细胞系无疑具有一系列优势，例如可获得大量细胞用于深入分析。然而，我们认为使用原代小鼠AECII有助于更准确地理解这类细胞在感染或自身免疫性炎症等复杂过程中的作用。原代小鼠AECII可直接从患有上述呼吸系统疾病的动物体内分离获得，这意味着它们经历了分析环境中所有相关的外在因素影响。例如，可从经鼻腔感染甲型流感病毒的小鼠中分离出具有活性的AECII，该病毒主要靶向此类细胞进行复制13。更重要的是，通过对来自健康小鼠的AECII进行离体（ex vivo）感染，可进一步拓展对感染所诱导的细胞应答机制的研究。
我们分离原代小鼠AECII的方案基于对小鼠肺组织进行酶消化，随后用特异性抗体对所得的细胞悬液进行标记，这些抗体包括CD11c、CD11b、F4/80、CD19、CD45以及CD16/CD32。颗粒状AECII随后被鉴定为未标记且侧向散射强（SSChigh）的细胞群体，并通过荧光激活细胞分选技术进行分离3。
与从鼠肺中分离原代上皮细胞的其他方法相比，本方案通过负向筛选结合流式细胞术分离AECII，可在较短时间内获得未经干扰、高活性且高纯度的AECII。此外，与传统的贴壁法以及利用抗体偶联磁珠结合去除淋巴细胞的方法相比 14, 15流式细胞分选技术可通过细胞大小和颗粒度实现区分。只要有流式细胞分选仪器，所述操作流程即可以相对较低的成本实施。除用于肺组织解离的标准抗体和酶外，无需磁珠等额外试剂。所分离的细胞适用于多种功能和分子研究，包括 体外 培养与T细胞刺激实验，以及转录组、蛋白质组或分泌组分析 3, 4.
方案
所需试剂和材料的详细信息见下文方案末尾的表格。开始实验前，为每只小鼠准备一个含有4 ml分散酶的15 ml离心管，并将其置于水浴中预热至37 °C。在加热块中，将少量1%低熔点琼脂糖（溶于水）短暂加热至95 °C，直至完全溶解，随后冷却至45 °C备用。
1. 小鼠肺组织的制备
- 采用 CO2 窒息法处死小鼠。注意：不要进行颈椎脱臼，因为这会损伤气管，导致后续实验步骤（如向肺内灌注液体）无法成功进行。确保痛觉反射消失。
- 用乙醇喷洒小鼠，并沿腹侧中线做一长切口。拉开腹部毛皮和皮肤，随后小心切开并去除腹膜。
- 通过剪断左、右颈静脉（Vena jugularis）以及肾动脉（Arteria renalis）使小鼠放血。用纸巾吸除流出的血液。
- 小心穿刺并去除膈肌，通过剪除肋骨暴露心脏和肺。操作时需特别注意避免损伤肺组织。
- 使用连接10 ml注射器的26G套管针，注射器内装有预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS），穿刺右心室，用PBS灌注肺组织，直至肺中无血液残留。
- 剪除并移除唾液腺以暴露气管。同时小心剪开气管周围的肌肉组织。
- 将22G留置套管针插入气管，取出针芯，将塑料导管向肺部方向推进。用一小段纱线在气管和导管周围打结，固定导管。
2. 肺组织的酶消化
如有需要，可在下一步操作前通过插入气管的导管用PBS或培养基冲洗肺部，以制备支气管肺泡灌洗液样本。
- 使用 2 ml 注射器，通过导管将 4 ml 分装液中的最大 2 ml 链霉蛋白酶小心地注入肺部，使所有肺叶充分扩张。更换为含有 0.5 ml 液化琼脂糖的 1 ml 注射器，并同样注入肺部。
- 将注射器保留在导管上以防止琼脂糖回流，立即用实验室纸巾和冰块覆盖肺组织，静置数分钟使琼脂糖凝固。
- 移除纸巾、冰块、注射器和导管，剪断气管，将肺、心脏和胸腺从胸腔中完整取出。随后在培养皿中用 PBS 冲洗肺组织，并去除心脏、胸腺及残留的气管。
- 将肺组织放入剩余的 2 ml 链霉蛋白酶中，在室温下孵育 45 分钟。
3. 肺细胞悬液的制备
- 从dispase中取出肺组织，转移至含有7 ml抗CD16/32抗体（终浓度1 μg/ml）的DMEM培养基和100 μl DNase的培养皿中。
- 使用镊子将肺组织彻底撕碎，于室温下在200 rpm的摇床上轻轻摇动孵育10分钟。如有需要，可将细胞悬液在4 °C保存至下一步操作。
- 将细胞悬液依次通过孔径为100 μm、70 μm、48 μm和30 μm的尼龙滤网进行过滤。注意每次过滤后需用DMEM充分冲洗滤网以及试管和培养皿，以尽量减少细胞损失并提高得率。若需合并样本，可将同一组小鼠的细胞悬液依次通过同一滤网完成合并。若滤网堵塞，应及时更换。
- 根据体积将滤液转移至一个或多个50 ml离心管中，在4 °C条件下以160 × g离心15分钟，弃去上清液。
- 用2 ml红细胞裂解缓冲液（0.15 M NH4Cl，0.01 M KHCO3，0.1 mM EDTA，pH 7.2）重悬细胞沉淀，并加入13 ml DMEM培养基迅速终止裂解反应。将溶液转移至15 ml离心管中，在4 °C条件下以160 × g离心12分钟。
4. 用于流式细胞分选的抗体染色
- 用3 ml流式细胞术适用稀释度的DMEM培养基配制的一抗混合液重悬细胞。（抗体工作浓度的优化稀释度此前已通过在100 μl体积中染色1 × 106个脾细胞进行滴定确定。对于来自最多五只小鼠的混合细胞，使用含有各抗体最佳浓度的3 ml一抗混合液。若混合的小鼠数量超过五只，需相应调整体积）。
- 染色时，将细胞在4 °C避光孵育10分钟。
- 用DMEM培养基充满15 ml离心管，于160 × g、4 °C离心12分钟，洗涤细胞。
- 若在步骤4.1中使用了未偶联或生物素标记的抗体：弃去上清液，用2–3 ml二抗混合液重悬细胞，在4 °C避光染色10分钟。
- 用DMEM培养基充满离心管，于160 × g、4 °C离心12分钟，洗涤细胞。
- 用1 ml DMEM重悬细胞，并通过50 μm滤膜预过滤至用于细胞分选的离心管中。可选：计数细胞以获得肺细胞悬液中的总细胞数。
5. 细胞分选
- 分选前通过涡旋振荡混匀细胞。AECII 分选时使用 100 μm 喷嘴。鞘液压力、激光发射波长及检测波长取决于用于流式细胞分选的仪器以及抗体染色过程中所用的荧光染料。
- 根据散射特性设门，选择对染色所用荧光染料呈阴性且侧向散射（SSChigh）较强的细胞，并将其分选至含有 DMEM 的离心管中。利用前向散射高度（FSC-H）对面积（FSC-A）以及侧向散射高度（SSC-H）对面积（SSC-A）的散点图设门，排除双联体或细胞聚集体（设门策略详见图1a）。
- 为收集分选后的细胞，于 280 × g 离心 20 分钟，温度设为 4 °C。
- 根据后续分析需要，将细胞重悬于培养基或缓冲液中。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在分选来自健康小鼠的肺细胞悬液时，AECII门通常占所有事件的约42 ± 10%。当使用患有呼吸道疾病（如病毒感染）的小鼠时，该百分比可能明显降低，因为初始细胞悬液中含有更高比例的淋巴细胞和其他被募集至气道的免疫细胞。对于流感病毒（IAV）感染后第3天从小鼠肺部分离的AECII，我们观察到AECII门中细胞频率的降低幅度约为50%。
典型的分选以及分选后细胞的重新分析如图1b和图1c所示。如图所示，分离得到的细胞纯度约为92 ± 5%。在图2a中，我们通过表面活性蛋白C染色证明了纯化细胞群的成功分离，该蛋白仅由AECII表达16, 17。
我们观察到，每只动物分离得到的AECII数量在很大程度上取决于所使用的小鼠品系。BALB/c小鼠通常可获得约1 × 106 个AECII/只，而C57Bl/6品系仅能获得1 - 3 × 105 个AECII/只。因此，每个实验...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们通过流式细胞术分离小鼠AECII的方案为获取小鼠肺组织中的原代细胞提供了一种快速方法，适用于多种功能和分子研究。该操作流程可获得高活力和高纯度的AECII细胞群体，细胞数量足以直接进行后续分析，例如RNA提取（参见 图 2b）和转录组学研究。在功能应用方面，还可对分离的细胞进行培养，从而实现 例如 AECII条件培养基的制备或共培养实验。对于这些功能研究而言，采用本文所述的阴性筛选法分离原代细胞具有显著优势，该方法可获得未经抗体结合的未受干扰细胞。然而，尽管原代AECII相较于细胞系在研究中具有诸多优势，其实际应用仍存在若干限制。除细胞数量有限、可能无法满足需要大规模筛选的研究需求外，原代AECII在体外培养中的存活时间也较短，我们观察到其平均存活时间约为48小时。在这些短期培养实验中，我们根据后续实验中AECII条件培养基的具体用途选择培养基，并采用IMDM（IMDM Glutamax，Gibco货号31980）添加10%胎牛血清、标准抗生素及0.25 mM β-巯基乙醇的配方，获得了满意的结果。
本文所述方案展示了一种相对...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢 M. Höxter 在从生物安全二级样本中分选原代小鼠 AECII 方面提供的技术协助。
本工作获得了德国研究基金会（DFG）向 DB 提供的资助（SFB587，课题组 B12 和 BR2221/1-1）以及汉诺威生物医学研究生院（DFG GSC 108）向 AA 提供的奖学金。DB 还获得了德国研究中心联合会（HGF）主席倡议与网络基金的支持，合同编号为 W2/W3-029。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 留置导管 Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase，100 ml（5000 酪蛋白酶解单位） | BD Biosciences | 354235 | 分装至 15 ml 离心管中，每管 4 ml，于 -20 °C 保存 |
| Biozym 斑块琼脂糖 | Biozym | 840101 | 1% w/v 溶于 H2O |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I，2000 Kunitz 单位/瓶 | Sigma-Aldrich | D4263 | 将 1 瓶内容物新鲜溶解于 300 μl DMEM 中 |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | 按生产商提供形式使用（低葡萄糖、含丙酮酸、含 HEPES） |
| 细胞筛（100 μm，75 μm） | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| 尼龙网膜（48 μm，30 μm） | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm 滤膜 | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| 抗小鼠 CD16/CD32 抗体 | BioLegend | 101302 | 克隆号 93；纯化抗体 |
| 抗小鼠 F4/80 抗体 | BioLegend | 123116 | 克隆号 BM8；APC 标记 |
| 抗小鼠 CD11b 抗体 | BioLegend | 101208 | 克隆号 M1/70；PE 标记 |
| 抗小鼠 CD11c 抗体 | BioLegend | 117310 | 克隆号 N418；APC 标记 |
| 抗小鼠 CD45 抗体 | BioLegend | 103102 | 克隆号 30-F11；纯化抗体 |
| 抗小鼠 CD19 抗体 | eBioscience | 12-0193-83 | 克隆号 eBio 1D3；PE 标记 |
| 多克隆山羊抗大鼠 IgG 抗体 | BD Pharmingen | 550767 | 多克隆，PE 标记 |
可根据所用流式细胞仪及其激光配置，选用偶联不同荧光染料的抗体。 |
参考文献
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47(2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15(2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
