人工抗原呈递细胞（aAPC）介导的自然杀伤T细胞活化与扩增

摘要

本文介绍了一种利用人工抗原呈递细胞（aAPC）从大量T细胞群体中激活并扩增人源NKT细胞的方法。采用基于CD1d的aAPC可提供一种标准化的方法，用于大量生成具有功能活性的NKT细胞。

摘要

自然杀伤T（NKT）细胞是一类独特的T细胞亚群，同时具有自然杀伤（NK）细胞和T细胞的特征性标志物¹与经典的T细胞不同，NKT细胞在CD1分子的呈递下识别脂类抗原²NKT细胞表达一种不变的TCRα链重排：小鼠为Vα14Jα18，人类为Vα24Jα18，其与多样性有限的Vβ链配对^3-6，被称为经典或不变的NKT（iNKT细胞。与传统T细胞类似，NKT细胞由CD4-CD8-胸腺前体T细胞在CD1d介导的适当信号刺激下发育而来。 ⁷利用NKT细胞进行治疗的潜力已显著增强，这得益于使用α-半乳糖基神经酰胺（α-GalCer）和多种细胞因子刺激并扩增人源NKT细胞的技术进步。⁸重要的是，这些细胞保持了其原始表型，能够分泌细胞因子，并对肿瘤细胞系表现出细胞毒性功能。因此， 离体 扩增的NKT细胞仍具有功能，可用于过继性免疫治疗。然而，基于NKT细胞的免疫治疗受限于使用自体抗原呈递细胞，且这些刺激细胞的数量和质量可能存在显著差异。已有报道指出，来自癌症患者的单核细胞来源树突状细胞表达的共刺激分子水平降低，并产生较少的炎症性细胞因子。^9,10事实上，已有研究采用小鼠树突状细胞（DC）而非同源抗原提呈细胞（APC）来检测慢性髓性白血病（CML）患者NKT细胞的功能。¹¹然而，该系统仅可用于 体外 由于NKT细胞无法通过小鼠树突状细胞（DC）扩增并用于过继性免疫治疗，因此依赖人工抗原呈递细胞（aAPC）的标准化系统可产生类似DC的刺激效应，同时避免同种异体或异种细胞带来的缺陷。^{12, 13}在此，我们描述了一种生成基于CD1d的抗原呈递细胞（aAPC）的方法。由于CD1d-抗原复合物对T细胞受体（TCR）的结合是NKT细胞活化的基本要求，抗原：CD1d-Ig复合物提供了一种可靠的方法，用于分离、活化和扩增效应性NKT细胞群体。

方案

1. 可溶性抗原呈递细胞的制备

1. 在将蛋白质加入磁珠前，准备好所有试剂和缓冲液：0.1 M 硼酸盐缓冲液；1× D-PBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）；磁珠洗涤缓冲液（1× PBS + 5% 人AB血清 + 0.02% 叠氮化钠）；完全培养基（RPMI 培养基 + 100 mM 丙酮酸钠，10 mM 非必需维生素溶液，100 mM MEM 维生素溶液，1% 2-巯基乙醇，10 μM 环丙沙星，5% 人AB血清）；MACS 缓冲液（1 L 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS，5 g BSA，2 mmol EDTA）。
2. 在5 ml透明螺口硼硅酸盐玻璃小瓶中，用3 ml无菌0.1 M 硼酸盐缓冲液（硼酸与水，pH 7.0–7.4）冲洗1 ml Dynabeads M-450 Epoxy 磁珠。
3. 在另一个1.5 ml微量离心管中，将100 μg hCD1d-Ig 二聚体和20 μg 共刺激分子（例如：抗CD28单克隆抗体）加入1 ml 不含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS 中。
4. 将装有磁珠的玻璃小瓶置于磁力架上，吸除硼酸盐缓冲液。将步骤3中的蛋白混合物加入该玻璃小瓶中，并盖上盖子。立即通过反复倒置混匀，用封口膜封住瓶盖，置于旋转仪上，4 °C孵育过夜。
5. 次日，将玻璃小瓶置于磁力架上，小心移除蛋白混合液，避免扰动磁珠。加入3 ml 磁珠洗涤缓冲液（含5% AB血清和0.02% 叠氮化钠的PBS），在4 °C旋转孵育5分钟。重复洗涤两次。
6. 磁珠可保存于该磁珠洗涤液中。如需制备功能性aAPC，取出少量磁珠 aliquot，使用血细胞计数板计数。通过抗体染色（例如：PE标记的抗小鼠IgG1抗体）并进行流式细胞术分析，检测蛋白是否稳定结合至磁珠表面。
7. 为将抗原负载至磁珠，取5 × 10⁷ 个磁珠，转移至一个小的1.5 ml玻璃小瓶中，用1 ml无菌PBS冲洗磁珠。将洗涤后的磁珠重悬于1 ml无菌PBS中，并加入抗原；例如：加入α-GalCer/KRN7000（5 mg/ml）。* 注意：尽管我们未观察到脂质溶解性或胶束形成的明显问题，但仍应按照生产商建议操作处理脂质。具体而言，本研究中KRN7000以DMSO（1 mg/ml）重悬。其他糖脂抗原如KRN7000也可溶解于含0.5% Tween-20的0.2 mg/ml PBS中（37 °C超声处理2小时）。重要提示：aAPC必须在使用前至少负载48–72小时。

2. CD161⁺CD3⁺ 细胞的分离

1. 采集外周血单个核细胞（PBMC）。若通过Ficoll密度梯度离心法从血沉棕黄层或白细胞分离包中分离淋巴细胞，首先在室温下用等体积的1×PBS稀释肝素抗凝血。
2. 将15 ml Ficoll（预热至室温）加入50 ml锥形管中。缓慢将25 ml稀释后的血液混合液叠加于Ficoll液面上方。在室温下以2,000 rpm离心30分钟，关闭刹车。
3. 用巴斯德吸管小心吸取淋巴细胞界面层（培养基与Ficoll之间的白色环状层），转移至新的50 ml锥形管中。
4. 用PBS将管内液体补至50 ml，以1,500 rpm离心5分钟洗涤细胞。弃去上清液，将同一供体的所有管合并至一个管中，再用20 ml PBS对外周血单个核细胞（PBMC）洗涤一次。随后计数PBMC，并以5 × 10⁷ 个细胞/ml的浓度重悬于MACS缓冲液中（1 L不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS，加入5 g BSA和2 mmol EDTA）。
5. 为分离T细胞组分，取2 ml PBMC（10⁸个细胞），加入EasySep人T细胞富集试剂盒中的100 μl全T细胞富集溶液。室温孵育10分钟。
6. 向溶液中加入100 μl磁性颗粒，再于室温孵育10分钟。将溶液体积调至终体积2.5 ml，将管置于紫色磁铁中5分钟。迅速将CD3⁺组分倾入15 ml锥形管中。
7. 加入5 ml冷的MACS缓冲液洗涤细胞，计数活细胞数量，并取部分细胞用于FACS染色。
8. 为筛选CD161⁺细胞，首先将富集的T细胞重悬于980 μl冰MACS缓冲液中，加入10 μg抗CD161单克隆抗体（mAb），在冰箱中孵育10分钟。
9. 在4 °C下以1,500 rpm离心细胞5分钟。然后将细胞沉淀重悬于800 μl MACS缓冲液中。加入200 μl抗小鼠IgG1微珠，于4 °C孵育10分钟。
10. 在该孵育期间，用3 ml MACS缓冲液平衡LS柱。
11. 接着，在4 °C下以1,500 rpm离心洗涤细胞5分钟。将细胞重悬于3 ml MACS缓冲液中。用移液器将细胞缓慢加入LS MACS分离柱中，注意避免产生气泡。用3 ml MACS缓冲液冲洗柱子，重复两次。
12. 加入3 ml新鲜MACS缓冲液，将柱子从磁铁上取下，放入15 ml锥形管中。插入推杆并推出内容物，以获得纯化的CD161⁺CD3⁺细胞。计数富集后的NKT细胞组分，预期可获得200万至400万个细胞。

3. aAPC介导的NKT细胞扩增

1. 通过加入10设立共培养体系⁶ 富集的 CD161⁺CD3⁺ T 细胞和 10⁶ aAPC 加入 16 ml 完全培养基（完全培养基 + IL-2，100 U/ml）中。将该混合液以每孔终体积 160 μl 接种至 96 孔组织培养处理的聚苯乙烯 U 型底板（带低蒸发盖）。每 7 天更换培养基^th 每天加入 80 μl 新鲜培养基。
2. 收获细胞，计数，并在第12-14天进行FACS染色。
3. 扩增后的NKT细胞可按照上述步骤3.1所述重新铺板，具体为：重悬10⁶ 扩增的T细胞和10⁶ aAPC 加入 16 ml 完全培养基中，将该混合液以每孔 160 μl 接种至 96 孔圆底培养板中。此后每 7 天更换一次共培养培养基^th 每天加入 80 μl 新鲜培养基。
4. 最好在第二轮扩增后冻存多余的NKT细胞（1 x10⁶/1 mL 冻存管，含 5% DMSO / 95% FBS。

4. 功能检测：aAPC介导的NKT细胞刺激

1. 在96孔圆底板中，每孔加入终体积为200 μl的完全培养基，其中包含5×10⁴个NKT细胞和5×10⁵个aAPC。
2. 培养24–48小时后，收集细胞培养上清液用于ELISA检测。

结果

本文描述了一种基于CD1d-Ig的类抗原呈递细胞（aAPC）的制备方法，该方法通过将CD1d-Ig与抗CD28单克隆抗体共价偶联至磁珠表面，用于刺激自然杀伤T细胞（NKT细胞），从而建立一种标准化的NKT细胞扩增方法（图1）。首先，需验证CD1d-Ig融合蛋白是否稳定地固定在磁珠表面。如图2A所示，CD1d-Ig和抗CD28抗体均成功表达于磁珠表面。为评估aAPC的刺激能力，我们将NKT细胞杂交瘤与aAPC共培养过夜，收集培养上清液，并通过ELISA检测IL-2的产生水平。结果表明，基于CD1d-Ig的aAPC对NKT细胞杂交瘤的刺激能力等于甚至高于相应的细胞型APC（图3，数据未显示）。有趣的是，我们发现小鼠NKT细胞杂交瘤可被人类CD1d构建的aAPC所激活（图2B），这为每批aAPC的功能检测提供了一种简便的方法。

接下来，我们旨在验证aAPC的扩增潜能，因此从外周血中分离了人T细胞。首先分离CD161⁺CD3⁺ 通过磁珠分离法富集T细胞组分。随后，使用负载α-GalCer的aAPC每两周刺激T细胞一次。值得注意的是，即使初始NKT细胞比例相对较低（0.03%），我们仍能将其扩增至约67%的Vα24阳性细胞⁺Vβ11⁺ (图3）。我们已从多名健康志愿者和癌症患者的外周血单个核细胞（PBMC）中扩增了NKT细胞，发现负载α-GalCer的aAPC能够在这两组样本中均有效扩增NKT细胞群体。值得注意的是，扩增效率高度依赖于供体个体。正如预期，初始Vα24⁺ 细胞数量越多，扩增百分比越高。此外，当起始细胞数量为200万时，CD161⁺CD3⁺T细胞，可以获得 >10⁷ 经过两轮扩增后的细胞（表1。大约80-90%的扩增后的NKT细胞为CD4⁺，约5% CD8⁺，其余的可能是CD4-CD8-双阴性NKT细胞。这些扩增的NKT细胞可用于功能研究，如所示 图4A-C我们发现，我们的 离体 扩增后的NKT细胞仍能对α-GalCer刺激产生应答，并可高效分泌IL-17A、TNF-α和IFN-γ。需要注意的是，如果初始T细胞富集群体比例较低，且无法进行第二次CD161富集步骤，则aAPC介导的扩增可能无法获得预期结果（参见 图 4D，供体1）。然而，如果循环NKT细胞的比例高于0.1%，仍应能够获得显著的扩增 iNKT细胞。总体而言，这些数据表明，基于CD1d的aAPC可用于有效扩增和刺激原代人NKT细胞。

图1. 基于CD1d:Ig的aAPC示意图 CD1d分子的胞外部分通过一段短的氨基酸连接子与免疫球蛋白重链蛋白的恒定区融合。这些分子可通过与过量目标脂质抗原（如α-GalCer）共孵育而轻松加载脂质抗原。aAPC通过将CD1d-Ig和抗-CD抗体偶联至磁珠制备而成。在此系统中，CD1d-Ig通过TCR提供同源抗原特异性信号，而抗-CD28单克隆抗体提供共刺激信号。

图 2. aAPC 表面蛋白的 FACS 染色结果。A) 通过 PE 标记的抗小鼠 IgG1 抗体染色检测 aAPC 是否表达 CD1d:IgG 二聚体，以及通过 FITC 标记的抗小鼠 IgG2a 抗体检测抗 CD28 抗体的表达。空心直方图为同型对照，实心直方图代表相应抗体染色结果。表达 CD1d-Ig 的 aAPC 可激活 NKT 细胞产生 IL-2。B) 将 Vα14⁺ 小鼠 NKT 细胞杂交瘤 DN32.D3 与培养基、可溶性抗原（α-GalCer）、未负载抗原的 aAPC 或负载 α-GalCer 的 aAPC 共同培养。收集培养上清，采用标准夹心 ELISA 法检测 IL-2 的产生水平。

图 3. 通过CD1d-Ig包被的人工抗原呈递细胞扩增NKT细胞。（A）使用磁分离法从外周血单个核细胞（PBMC）中分离出初级CD3⁺CD161⁺双阳性细胞。分选后的细胞用负载α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）并包被CD1d-Ig的人工抗原呈递细胞（aAPC）刺激培养14天。在aAPC刺激后，对细胞进行Vα24和Vβ11染色。（B）原代人NKT细胞对B细胞淋巴瘤细胞系的杀伤作用。将C1R-CD1d细胞与NKT细胞以指定比例共孵育，存在或不存在抗原α-GalCer（100 ng/ml），在96孔U型底板中孵育20–24小时。通过标准的51Cr释放实验评估NKT细胞介导的细胞裂解。

图4. aAPC扩增的NKT细胞的细胞因子谱。 将扩增后的NKT细胞（1×10⁵/孔）用负载α-GalCer的aAPC刺激两周后，再与可溶性α-GalCer、PMA/离子霉素、抗CD3/28微珠或负载α-GalCer的aAPC（2×10⁵/孔）共培养48小时。（A）IL-17A、（B）TNF-α 和（C）IFN-γ 的产生量通过标准细胞因子ELISA法测定。所示数据为减去阴性对照（培养基和空珠）后的净细胞因子产量。（D）使用磁珠分离法从外周血单个核细胞（PBMC）中分离初始T细胞。分选后的细胞用负载a-GalCer的aAPC刺激两周。随后用特异性识别Vα24⁺ 和 Vβ11⁺ 的抗体进行染色，并通过流式细胞术分析。

讨论

aAPC可用于研究NKT细胞活化的基本需求，并具有潜在的临床应用价值 离体 用于过继性免疫治疗的NKT细胞扩增。Mescher 等 描述了一种最早的基于微珠的系统，其中生物素化的鼠源MHC I类分子-肽-单链构建体通过链霉亲和素与生物素化的共刺激分子B7.1和B7.2结合至乳胶微球表面 ^{14, 15}该方法已成功用于刺激转基因小鼠中抗原特异性T细胞。此外，由于该方法使用单链MHC-肽复合物以确保MHC分子的均一负载，每种目标肽抗原都需要重新转染以表达所需的单链MHC-肽复合物，从而限制了该方法的通用性。重要的是，Schneck博士的研究团队开创了基于微珠的aAPC技术，开发了另一种非细胞型基于微珠的aAPC，通过将HLA-Ig（信号1）和抗CD28抗体（信号2）偶联至磁性微珠而制备。HLA-Ig是一种独特的多聚体形式的HLA，与免疫球蛋白分子支架相融合 ^{16, 17} 由他的研究团队开发。随后，他们开发了基于MHC-Ig的人工抗原呈递细胞（aAPC），已被证明可有效扩增针对CMV和MART-1特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL） ¹⁸在此，我们已证明基于CD1d-Ig的aAPC可用于扩增功能性NKT细胞。一项研究曾使用类似系统来检测NK细胞与CD1d之间的物理相互作用 ¹⁹.

值得注意的是，我们设计了一种人工抗原呈递细胞（aAPC），可根据优化NKT细胞增殖所需的任何条件进行调整。该aAPC扩增方法为扩增和富集人源NKT细胞提供了一种简单且可靠的手段。我们的aAPC可被改造，用于系统性评估一系列潜在共刺激分子的作用，并分析其对NKT细胞增殖和功能的影响。因此，aAPC是一种强大且多功能的技术，适用于诱导和扩增NKT细胞。aAPC的制备耗时不到一周，适合大量微珠的生产。然而，制备aAPC的关键步骤是确认CD1d-Ig已稳定固定在微珠表面，并评估其功能性，以确保批次间的一致性。该系统的一个潜在局限性在于，除机械去除微珠外，尚无机制可关闭刺激信号。具体而言，T细胞受体（TCR）与抗原：CD1d/MHC复合物的结合通常在辅助/黏附分子的协同下形成免疫突触，可能诱导T细胞和抗原呈递细胞上抑制性或抑制因子的表达。在aAPC系统中，这些因子可能被T细胞上调，但微珠不会表达这些受体的相应配体。

此外，已有研究表明，CD4⁺ NKT细胞在小鼠和人类中均能抑制抗肿瘤免疫应答，因此非特异性地激活所有NKT细胞（即使用α-GalCer进行全局性刺激）或激活错误的NKT细胞亚群可能导致不良的免疫学后果。因此，必须对经aAPC扩增的NKT细胞群体进行表型和功能特征分析。如图4所示，我们发现，使用负载α-GalCer并表达抗CD28分子的aAPC进行刺激，可诱导NKT细胞产生Th1、Th2和Th17型细胞因子。小鼠研究表明，给予IL-33（一种新近发现的细胞因子）刺激后，循环中炎症性细胞因子如IL-5和IL-13的水平升高。用IL-33处理NKT细胞可增强其细胞因子的产生²⁰。IL-33是ST2的特异性配体，已有研究显示，可溶性ST2能够阻断IL-33信号通路。因此，作为未来应用的一个示例，可构建表达ST2的aAPC，用于探究是否可以选择性抑制Th2型细胞因子的产生，同时促进NKT细胞分泌Th1型细胞因子。另有报道指出，在C57BL/6小鼠中静脉注射表达Kb的aAPC可减少肿瘤肺转移²¹。重要的是，这些数据表明aAPC能够归巢至肺部，并可激活效应T细胞亚群。因此，可构建多种类型的aAPC，以研究抗原特异性T细胞亚群之间的相互作用。综上所述，这些研究证明基于CD1d-Ig的aAPC可用于替代传统的细胞型抗原呈递细胞，并有望增强当前基于NKT细胞的过继性免疫治疗的临床策略。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PLUS	GE生命科学	17-1440
EasySep 人T细胞富集试剂盒	StemCell Technologies	19051
别藻蓝蛋白 CD161 人单克隆抗体	Pharmingen	550968
EasySep 磁力架	StemCell Technologies	18002
抗小鼠 IgG1 微珠	Miltenyi Biotec	130-047-101
可溶性二聚体小鼠 CD1d:IG 融合蛋白 Dimer XI 重组蛋白	BD 生物科学	557599
抗CD28单克隆抗体	Biolegend	302914
M-450 环氧珠	Life Technologies	150-11
α-半乳糖基神经酰胺（KRN7000）	Axxora, LLC	BML-SL232-0100
RPMI 1640培养基	Sigma Aldrich	R 0883
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
非必需氨基酸	Gibco	11140-050
维生素溶液	Gibco	11120-052
2-巯基–乙醇	Gibco
环丙沙星	Alexis 生物化学公司	380-288-G025
PE-Vα24Jα18	Biolegend	342904
PE-Vα24（克隆 C15）	贝克曼库尔特	A66907
FITC-Vβ11（克隆 C21）	贝克曼库尔特	A66905
PE-CD1d	Biolegend	123510
PE 抗小鼠 IgG1	BD 生物科学	556650
FITC 抗小鼠 IgG2a	Biolegend	407105
不含钙、镁的DPBS	Life Technologies	14190250
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S8032
牛血清白蛋白	American Bioanalytical	AB00440-00100
EDTA	Sigma Aldrich	431788
IL-2（Proleukin）	BD 生物科学	354043
人AB型血清	Atlanta Biologicals	S40110
Labquake 试管旋转混匀仪	Fisher Scientific	13-687-10Q
BD Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底管	Fisher Scientific	14-959-1A
带盖 Wheaton 玻璃样品瓶	Fisher Scientific	小号 (03-343-6A) 大号 (03-343-6E)