制造和使用Piggy-back多管电极 在体 神经反应的药理学调控

摘要

在细胞外在体记录过程中，通过离子电泳施加神经激动剂和拮抗剂是调控神经元微环境的一种强有力方法。此类操作最简便的方式是使用并联多管电极。本文将介绍如何制备此类电极，并将其应用于听觉记录实验中。

摘要

体内单个神经元的记录使研究者能够检测神经元的放电特性，例如其对感觉刺激的反应。神经元通常接收多个兴奋性和抑制性传入和/或传出输入，这些输入相互整合，而最终测得的神经元反应特性正是由这些输入的神经整合所决定的。为了研究神经系统中的信息处理机制，有必要了解某一神经元或神经系统的各种输入及其特定性质。评估特定神经元所接收输入功能作用的一种强大且技术上相对简单的方法是动态且可逆地抑制或消除这些输入，并测量该操作引起的神经元输出变化。这一目标可通过使用“背负式”多管电极药物改变神经元的局部微环境来实现。这些电极由一根单管记录电极和一个可携带最多4种不同突触激动剂或拮抗剂的多管给药电极组成。药理学试剂可在实验过程中按需通过离子电渗法施加，从而实现时间可控的药物递送以及突触输入的可逆性重构。因此，对微环境进行药理学操控是一种强大且无与伦比的方法，可用于检验关于神经环路功能的特定假设。

在此我们介绍piggy-back电极的制造方法及其在实验中的使用方式 体内 实验。piggy-back 系统允许研究者将具有任意特性的单管记录电极（如阻抗、尖端尺寸、形状等）与多管给药电极组合使用。这相较于标准的多管电极具有显著优势，因为在标准多管电极中，所有管的形状和特性大致相似。多管电极最早在40多年前被引入 ^1-3，并经历了多次设计改进 ^2,3 直到20世纪80年代背驮式结构被引入 ^4,5. 本文介绍了一组对piggy-back电极实验室制备方法的重要改进，可实现对完整脑组织的深部穿透 体内 由于电极轴相对较细，可造成最小损伤，因此适用于动物制备。此外，这些电极具有低噪声记录特性，并配备低电阻药物储液管，可高效进行所需药理学物质的离子电渗。

方案

1. 拉制玻璃电极

1. 拉制单管电极。 使用带丝的单管玻璃毛细管，将其尖端拉至直径约1-2微米，杆部长度为10-12毫米，在0.9% NaCl溶液中测得的电极电阻约为12 MΩ（范围为5-20 MΩ）。电极电阻过低会导致背景活动增加，从而更难分离出单个神经元的单细胞放电活动。拉制该电极时，可使用水平或垂直拉制仪，加热方式可选择加热丝或加热圈。
2. 拉制多管电极。 由于多管玻璃管直径较大，且需要在整个多管周围实现均匀加热，因此必须使用配备大直径加热圈（而非加热丝）的高功率拉制仪。多管移液管必须置于加热丝中心位置，且不得与加热圈接触。请注意，除本文所述的5管移液管外，市售的3管或7管移液管也可作为替代选择。将玻璃管拉至总尖端直径约10微米或更小。在下一步中将通过断开尖端来调整至合适直径，因此在拉制过程中，精确的尖端尺寸不如电极尖端的整体形状重要，理想形状应为细长型。理想的电极尖端形状可参考图1C。短而粗的电极形状（图1B）在插入脑组织时会造成显著的组织损伤，而过长且过细的电极形状（图1A）则容易弯曲，从而难以将尖端折断至合适直径（见步骤2）。

2. 修饰电极尖端

在将两个电极粘合在一起之前，必须对它们进行改装。单电极的电极杆需要先弯曲，然后再连接到多管电极上，以确保组装完成的背负式电极整体电极杆尽可能细。此外，还需将多管电极的尖端折断，以确保离子电渗时具有较低的电阻。

1. 将单管电极的电极杆弯曲约20度。 使用尽可能小的本生灯火焰。标准实验室供应商提供的典型“小型”本生灯所产生的火焰对此应用而言过大。为解决此问题，应使用最小的商用本生灯，并将一根注射针头（约18号）固定在灯口顶部，用牙科水泥密封连接处。点燃后，火焰应难以看见，直径约为5 mm或更小，高度约8 mm。由于室内任何气流都可能熄灭该火焰，因此建议在密闭房间内操作，或使用防风罩。将单管电极穿过火焰，使其弯曲约20度。目标是使火焰在距离电极尖端约10毫米的过渡区域熔化玻璃。为避免熔化电极尖端，建议将电极以约45度角持握，尖端朝下，并快速通过火焰移动电极。
2. 折断多管电极的尖端。 为确保在折断电极尖端时具有良好的视觉控制，需使用配备至少10倍物镜和10倍目镜的显微镜。还需在目镜中插入测量标尺以测量尖端尺寸。将一块有机玻璃固定在显微镜上，使其末端在显微镜视野中占据约三分之一至二分之一范围。在本例中，有机玻璃尺寸约为25 × 70 mm，厚5 mm，通过螺丝固定于显微镜载物台特制螺纹中。设计时应确保有机玻璃可独立于载玻片移动。将多管电极置于载玻片上的模型粘土槽中，并将载有电极的载玻片插入显微镜载物台的玻片夹持器内。利用载物台的xy轴操纵装置，轻柔地将电极尖端推向有机玻璃边缘，并通过显微镜目镜观察尖端断裂过程。力求将多管电极尖端整齐折断至总直径约为25–35微米。对于断裂后尖端直径过大或断裂不平整的移液管应予以弃用。由于尖端形状不理想，我们大约会弃用30%的多管电极。

3. 组装Piggy-back电极

1. 放置电极。 从显微镜载物台上取下步骤2.2中使用的有机玻璃片。将制备好的多管电极固定在玻璃载片的模型粘土上，电极尖端略微向上倾斜。向上倾斜对于步骤3.2中的电极粘合至关重要：尖端朝上可使胶水从尖端处流开，避免将电极尖端粘连在一起。将弯曲的单管电极插入自制显微操作器的电极夹持器中（图2）。先通过肉眼引导，再借助显微镜观察，将单管电极缓慢下放至多管电极上。单管电极应准确放入由五根管状结构形成的凹槽中，其尖端应比多管电极的尖端突出约5–10微米。下放单管电极时，需密切观察两根电极之间形成的角度。为获得最佳效果，应避免两根电极尖端相互分离的角度，而应尽量使单管电极与多管电极完全平行地下降，或使其尖端先接触多管电极，形成一个极轻微的“楔形”结构。由于单管电极尖端具有高度柔韧性，当其尖端接触多管电极顶部表面后继续轻微下压时，单管电极会发生弯曲，从而形成一个结构清晰的复合尖端，并具备一定的弹性作用，有助于保持两个尖端紧密贴合。然而，若单管电极与多管电极之间的角度过陡（楔形过大），则弹性作用过强，会导致整个电极结构向下弯曲。
2. 将电极杆部粘合在一起。 使用氰基丙烯酸酯（速干胶）将两根电极的杆部粘合。用扁头牙签的小端蘸取少量胶水，轻轻触碰电极组件。从远离尖端的最远端位置开始，缓慢沿电极杆部向电极尖端方向移动牙签并施加胶水。若使用过多胶水，或在过于靠近电极尖端的位置施加胶水，可能导致电极开口被堵塞，从而使电极至少部分失去功能。
3. 用牙科水泥加固连接处。 在一次性小型塑料培养皿或称量舟中，使用扁头牙签混合少量牙科水泥与牙科丙烯酸树脂。待水泥变为可塑状态后，取少量涂抹于两根电极的连接处以加固结合部位（图3中的粉红色材料）。静置约15分钟使其干燥。
4. 取下并保存电极。 小心地将完成的背负式电极先从显微操作器夹持器中取出，然后从玻璃载片上分离，并存放于防尘容器中。

4. 准备电极填充液

配制电极填充液。由于离子电渗需要带电分子，大多数试剂必须溶解在酸性或碱性环境中（通常pH约为3-4，或pH约为8-10）。常用于离子电渗的多种化学物质列于表1中。对于表中未列出的试剂，应根据其pKa值判断在酸性或碱性环境中更易保持分子带电状态，并据此进行溶解。为获得最佳效果，建议每天新鲜配制所有溶液。

5. 填充并准备电极

使用电极前，用连接有注射器滤器的碳纤维28-34号针头，将每种药物分别注入对应的套管中。在五套管配置中，将四种选定药物填充至四个外周套管，中心套管则填充3M NaCl作为平衡套管。单套管记录电极也需填充3M NaCl。在NaCl溶液中加入染料（如快绿或酚红）有助于在将电极放置于脑表面时更清晰地观察电极尖端。将电极插入记录装置的电极夹持器中，并将所有导线插入相应的玻璃套管内。使用绝缘银线，其尖端约1 cm处已去除绝缘层。多套管电极应有5根导线（对应4个药物套管和1个平衡套管），此外还需一根放大器导线插入单套管记录电极中。

6. 开启离子电渗泵模块

打开离子电渗泵模块并测试所有桶道。每个泵模块的电极测试功能有助于确定电极桶道是否正常工作。为防止在不使用时药物从桶道中泄漏，需施加与分子电荷极性相反的保留电压。

结果

在本实验中，通过离子电泳施加了甘氨酸受体拮抗剂盐酸士的宁。阻断甘氨酸能抑制作用通常会增加神经元的放电活动。图4展示了记录自一个听觉神经元的示例数据，该神经元对施加于动物耳部的强度递增的正弦声刺激产生反应。此类实验被称为神经元的放电率-强度函数。 louder sounds resulted in higher spike rates (黑色曲线)。本实验中初始使用的离子电泳电流为15 nA。当电流开启、放电率-强度函数的变化稳定在新水平后（深蓝色曲线），逐次将推出电流增加至30、45和60 nA（分别为橙色、绿色和浅蓝色曲线）。在每次改变推出电流后，待放电率-强度函数的响应稳定，均记录了该神经元在相同声强范围内的反应。本示例中最合适的推出电流为45 nA至60 nA，因为在此电流水平下，神经元的反应不再发生进一步改变。该结果提示，在45 nA电流时，该神经元的所有甘氨酸受体已被盐酸士的宁完全阻断。进一步增加推出电流并释放更多士的宁，并未引起神经元放电率-强度函数的进一步变化。在实验方案完成后，关闭推出电流。约25分钟后，神经元反应恢复至基线水平（红线）。恢复时间可能因所施加药物的种类和剂量不同，从数秒至数十分钟不等。

药物	浓度	溶液 pH 值	溶剂	公司	货号	典型保持电流	典型喷射电流
GABA	500 mM	3.5-4.0	dH2O	Sigma	A-2129	-15 nA	+5 nA 至 +100 nA
甘氨酸	100 mM	3.5-4.0	dH2O	Sigma	G-7126	-15 nA	+5 nA 至 +100 nA
荷包牡丹碱甲碘化物	10 mM	3.0	dH2O 中含 0.165 M NaCl	Sigma	B-6889	-15 nA	+5 nA 至 +60 nA
盐酸番木鳖碱	10 mM	3.0	dH2O 中含 0.165 M NaCl	Sigma	S-8753	-15 nA	+5 nA 至 +80 nA
L-谷氨酸	500 mM	8.0	dH2O	Sigma	G-1251	+30 nA	-10 nA 至 -150 nA
L-天冬氨酸	500 mM	8.0	dH2O	Sigma	A-8949	+30 nA	-10 nA 至 -150 nA
红藻氨酸	1 mM	9.0	dH2O	Sigma	K-0250	+30 nA	-10 nA 至 -100 nA

表1. 常用药物及其溶解所需的pH值和浓度。该表格列出了离子电泳实验中最常用的突触激动剂和拮抗剂。所列pH环境考虑了这些试剂需要极化的特性，而建议浓度则反映了不同药物之间在有效性上的差异。

图1. 三种不同尖端长度的多通道移液管。 A：该5通道电极的尖端拉得过长且过细。注意其尖端已弯曲且非常柔软。此类尖端极难折断至理想直径。B：该电极的尖端过短且粗钝。当插入脑部较深区域时，由于尖端后数毫米处电极迅速变粗，会造成不必要的脑组织损伤。C：尖端拉制恰当的电极示例。该尖端虽长而细，但仍保持坚固，可轻易折断至所需尖端直径。

图 2. 电极操作器组件示意图。该操作器组件与显微镜配合使用，用于组装背靠背电极。灰色标记的项目为市售产品，列于表 2中。蓝色标记的部件由本机构机加工车间定制加工，分别为：1）尺寸为 43×26 cm 的 1/4 英寸钢板，根据 Newport 公司提供的孔位模式，在其上钻孔以适配 Newport 423 型平台；2）可倾斜平台，用于使组件在任意角度下倾斜；3）连接器，用于将电极夹持器安装至顶部平移平台。

图3. 样品背负式电极照片。一个组装完成的五通道电极与单通道记录电极结合。注意长约7 mm的长轴，可用于深部脑区记录。

图 4. 推注电流的滴定。 该图显示了在动物耳朵受到不同强度纯音刺激时，单个听觉神经元记录到的放电率-强度函数。声音越强，引发的放电率越高。在给药前，该神经元的放电率-强度函数表现出最低的脉冲频率（黑色曲线）。逐步增加推注电流会逐步阻断该神经元上更多的甘氨酸受体，从而导致放电率逐步升高。该神经元的最佳推注电流为 45–60 nA。在此推注电流下，可实现对该神经元所有甘氨酸受体的完全阻断。实验方案完成后，终止离子电渗给药，并允许神经元恢复。当恢复后的放电率-强度函数与初始给药前的函数一致时，即实现完全恢复。经美国生理学会许可，引自 Klug et al，1995。

讨论

我们介绍一种可在活体（in vivo）条件下操控单个神经元微环路的技术，同时能够在实验操控过程中记录该神经元的反应。神经环路通过离子电渗法施加突触激动剂和拮抗剂进行操控。与压力喷射法相比，离子电渗法的主要优势在于其无需将液体从电极物理性地注入神经组织，因此不存在因施加压力或液体体积而造成组织损伤的风险。该技术的主要局限性在于无法获知药物在组织中的绝对浓度以及受药物影响的组织体积。然而，由于离子电渗法所释放的药剂量远小于压力喷射法，且更易于精确控制，因此药物作用后的恢复通常更快且更完全。微离子电渗法已成功应用于多种感觉及其他神经系统，并在固有信息处理较少或没有的脑区应用效果最佳。其原因是部分喷射出的药理学物质可能从施加部位扩散至邻近神经元，从而影响邻近神经元的反应特性。

单管和多管电极的独立制造，使得可以组合具有任意且互不相关特性的电极。若将电极管拉制在一起，并将其中一些用于记录、另一些用于离子电泳，则所产生的电极尖端特性会非常相似，导致电极尖端要么太大而不适合单细胞记录，要么太小而无法用于药物施加。此外，使单管电极尖端比多管电极尖端长约20微米，可显著降低记录中的噪声，并消除保持或推出电流对神经元放电可能产生的干扰电流效应³。

Piggy-back 多管电极最早在 30 多年前被描述 ^4-6 并已成功用于解析神经回路 ^{7-18 19-29}因此，该方法 本身 并不新颖或独特。然而，多年来电极制备和使用的具体细节已有所改进，本文所述的操作步骤被证明尤为简便且成功率高，其详细内容尚未在其他文献中公开发表。特别是，单管电极尖端的弯曲设计使得背负式电极的最终尖端相对较为纤细（图3）因此可以在对脑组织损伤最小的情况下记录深部核团的信号；单管电极突出于多管电极的设计几乎完全消除了电流干扰，而电流干扰过去常被视为该技术的缺点 ³此处呈现的新细节，例如在粘合过程中使电极尖端向上，并将单管电极放置于多管电极的凹槽中，可确保制备背驮式电极时获得高成功率。该技术相对简单，初学者通常可在数天内掌握。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
本生灯		17928-027	<强>可从以下获取VWR
<强>双组分牙科水泥： "低温固化" 牙科材料	Co-oral-ite Dental Mfg. Co	525000	<强>可从...获取A-M Systems, Inc
<强>双组分牙科水泥： 义齿材料交联液 化合物	Co-oral-ite Dental Mfg. Co	525000	<强>可从以下渠道获取A-M Systems, Inc
液体胶水	亨克尔	01-06849	<强>可从以下渠道获取：乐泰超强胶水
微离子电渗仪：Neurophore BH-2	哈佛仪器	65-0200 & 65-0203	<强>可从...获取哈佛仪器公司
绝缘银线	AM-Systems	785500	<强>可从...获取AM-Systems
水平拉制仪	Zeitz DMZ-通用型拉制仪	NA	<强>可从以下渠道获取AutoMate Scientific
<强>显微操作仪组件： 电极夹	WPI	M3301EH	<强>可从...获取WPI
<强>显微操作仪组件： 线性平台	Newport 423 系列	423	<强>可从以下渠道获取纽波特
<强>显微操作仪组件： 旋转台	Newport RSP-2	RSP-2	<强>可从以下渠道获取纽波特
<强>显微操作仪组件： z 翻译	Newport 433 系列	433	<强>可从以下渠道获取纽波特
<强>显微操作仪组件： 90度角括号 ° 组装 z 轴和 xy 轴	Newport 360-90	360-90	<强>可从以下渠道获取纽波特
<强>显微操作仪组件： x 轴平移 / 线性平台	Newport 423 系列	423	<强>可从以下渠道获取纽波特
<强>显微操作仪组件： y轴平移 / 线性平台	Newport 423	423	<强>可从以下渠道获取纽波特系列
<强>显微镜	Leitz Laborlux 11
<强>显微镜 目的	Leitz Wetzlar 10x，NA 0.25	519760
<强>显微镜 目镜	Leitz Wetzlar，Periplan 10x/18	519748
<强>显微镜 阶段	Leitz Wetzlar	513544
多通道毛细管	N/A	612000	<强>可从以下来源获取A-M 系统公司
单管毛细管（GC 150F-10）	哈佛仪器	30-0057	<强>可从以下渠道获取哈佛仪器公司
垂直拉制仪	Narishige 型号 PE-2
显微操作仪的定制部件（图中以浅蓝色标记） <强>图1)
钢板
倾斜底座
电极夹持器附件
<强>表2. 实验所用全部设备和耗材的生产厂家及货号。