利用RNA介导的干扰喂养策略筛选参与线虫 C. elegans 体型调控的基因

摘要

我们演示了如何利用RNAi饲喂技术在C. elegans中敲低目标基因，并评估其体长表型。该方法可用于大规模筛选，以鉴定潜在的感兴趣遗传组分，例如参与DBL-1/TGF-β信号通路调控体长的基因。

摘要

双链RNA介导的干扰（RNAi）是一种有效敲低目标基因表达的策略^1-3已将其应用于多种模式生物系统，包括植物、无脊椎动物和脊椎动物。实现RNAi的方法有多种 体内^4,5例如，可将目的基因插入RNAi载体中，随后将其稳定或瞬时转染至细胞系或原代细胞，以实现基因敲低效果；或者，可将针对特定目的基因合成的双链寡核苷酸（RNAi寡核苷酸）瞬时转染至细胞系或原代细胞，以沉默目的基因；亦或可将合成的双链RNA分子显微注射到生物体内。由于线虫 秀丽隐杆线虫 以细菌作为食物来源，通过喂食表达针对目标基因的双链RNA的细菌，提供了一种可行的策略⁶在此，我们介绍一种通过RNAi饲喂法来评估体型表型的方法。体型在 秀丽隐杆线虫 主要由类似TGF-β的配体DBL-1调控，因此该检测适用于鉴定TGF-β信号通路组分⁷我们使用了不同品系，包括两种RNAi超敏感品系，重复了RNAi饲喂实验。结果显示 rrf-3 该品系产生了最符合预期的RNAi表型。该方法操作简便、可重复性强，且易于量化。此外，我们的实验方案最大限度地减少了对专用设备的依赖，因此适用于规模较小的实验室或以本科生为主的教学科研机构。

方案

1. 准备含有靶基因序列的RNAi饲喂平板

1. 若使用市售的RNAi文库（例如 来自 Source BioScience LifeSciences），进行步骤 1.4。或者，将目标基因序列克隆至载体 L4440，一种常用的线虫 RNAi 质粒⁸，按照标准克隆方案。
2. 将重组质粒转化至HT115(DE3)菌株中，在含有25 μg/ml羧苄青霉素和12.5 μg/ml四环素的LB琼脂平板上培养，并挑取单克隆用于后续实验。
3. 同时，将空载体L4440转化至细菌菌株HT115中，作为实验的对照。
4. 在含有100 μg/ml氨苄青霉素的1 ml LB液体培养基中，于37 °C过夜培养携带重组L4440质粒和空L4440质粒的细菌。不添加四环素，因为四环素会降低RNAi效率。
5. 加入5 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基至过夜培养物中，于37 °C继续孵育4–6小时。
6. 将0.5 ml携带重组或空L4440质粒的细菌培养物接种至RNAi线虫培养板上。用克隆名称标记所有培养板。
7. 标记培养皿，并在37 °C下过夜培养以形成细菌菌苔；这些为含有或不含目标基因序列的RNAi培养皿。每种条件至少应准备2个培养皿。

2. 在RNAi喂养平板上培养线虫

1. 用火焰灭菌铂金丝接种针的尖端。使用该接种针将6-10条第四幼虫期（L4）的雌雄同体线虫转移至每个RNAi平板，平板中应含有重组质粒或空载体L4440；线虫将以平板上的细菌作为食物来源。
2. 将雌雄同体线虫在20 °C（C. elegans的标准培养条件）下培养过夜，次日它们将发育为年轻成虫。
3. 将6-10条年轻成虫转移至新制备且标记对应的RNAi平板中。
4. 让成虫产卵4-6小时，随后将所有成虫从平板中移除；此步骤用于同步子代发育。一旦母本被移除，即开始计时，此时间为零时（time zero）。
5. 将平板在20 °C下继续培养，使线虫发育至特定的发育阶段；本实验方案选择年轻成虫进行表型分析。对于发育速率正常的基因敲低个体，培养72小时足以使其发育至年轻成虫阶段。然而，不同基因对线虫发育的影响各异。若RNAi导致线虫发育速率改变，年轻成虫可定义为：处于L4期后不超过24小时、阴门发育完全、子宫内含有2-6个胚胎（若具有生育能力）的个体。若需鉴定其他发育阶段，研究者应以性腺和阴门的发育情况作为判断依据。

3. 评分RNAi处理蠕虫的体型表型

1. 在载玻片上放置两层彩色标签胶带。制作两张这样的载玻片。然后将一张新的载玻片插入两张带胶带的载玻片之间。将2%琼脂糖溶于水中，在新载玻片中央滴加一滴；然后将第二张载玻片盖在上面，形成一层薄薄的2%琼脂糖，具体操作如前所述⁹。
2. 待琼脂糖凝固后，移除顶部的载玻片；带有琼脂糖垫的载玻片即可用于加样线虫。用克隆名称标记载玻片。
3. 向琼脂糖垫上加入10 μl 25 mM NaN₃；挑取30–40只线虫进入NaN₃溶液以使其固定；然后盖上盖玻片；对携带重组RNAi和空L4440载体的RNAi处理线虫均重复此步骤。
4. 使用解剖显微镜和2.5倍物镜观察线虫；此处我们使用Leica数码相机及配套软件Qcapture进行成像。
5. 进行校准：首先拍摄标准微米尺的图像。然后在Image-Pro软件中打开该图像，点击“测量”并选择“校准”，再选择“空间校准向导”。在选中“校准当前图像”的情况下，点击“下一步”。输入校准名称，并确保空间参考单位设置为微米。然后勾选“创建参考校准”按钮，点击“下一步”。点击“绘制参考线”，将出现一条参考标尺。调整标尺位置使其与微米尺的两端对齐，然后指定该参考长度为1,000单位。点击“确定”、“下一步”和“完成”。
6. 软件校准完成后，打开一张线虫图像。在“测量”菜单下选择“校准”，然后点击“选择空间校准”。在下拉菜单中选择之前为微米尺校准创建的文件名。然后在“测量”菜单下选择“测量”。在弹出的窗口中选择自由绘制工具，使用计算机鼠标沿动物体中央从头部到尾部画一条线（图1）。长度将在窗口中显示。此时您已获得两组数据：经目标基因RNAi处理的线虫体长和经空L4440载体处理的对照组线虫体长。
7. 将长度测量数据导出至Microsoft Excel文件或其他合适的统计软件中。通过计算各样本的均值和标准差来分析数据，然后使用Student t检验比较样本间差异。

结果

在我们的研究中，我们关注 DBL-1/TGF-β 信号通路对体型大小的调控作用。DBL-1 通路功能缺失会导致体型变小，表现为与野生型动物相比体长显著缩短^7,10,11。因此，对 C. elegans 体型大小突变体的筛选能够用于鉴定 TGF-β 信号通路中的组分及其调控因子。DBL-1 信号通过一条保守的 TGF-β 信号转导通路传递，该通路包括细胞表面受体和细胞内 Smad 信号转导蛋白¹²。为了检验通过喂养方式进行 RNAi 干扰在鉴定体型大小突变体中的有效性，我们利用该技术敲低了 DBL-1 通路的关键组分：dbl-1/配体；sma-2、sma-3、sma-4/Smad 蛋白；以及 sma-6/受体。在本研究中，我们采用了两种不同的 RNAi 超敏感 C. elegans 品系进行实验：eri-1;lin-15b 和 rrf-3^13,14。同时，我们也使用了 N2（标准野生型）品系以及 lin-36 品系——后者是 lin-15

讨论

在本实验方案中，我们描述了利用RNAi饲喂法鉴定C. elegans体长缺陷突变体的方法。该方法适用于TGF-β信号通路组分的鉴定。由于这些组分在进化过程中高度保守¹⁵，此类筛选对于阐明所有后生动物中TGF-β信号转导的分子机制具有重要意义。设计此类筛选实验时需考虑的一个重要因素是起始菌株的选择。我们已证实，eri-1;lin-15b和rrf-3菌株对RNAi饲喂的敏感性均高于对照菌株，这与先前的研究结果一致^12,13。然而，尽管eri-1;lin-15b表现出最显著的表型，但其动物生长状况较差且子代数量较少。因此，在大规模筛选中，该菌株无法提供足够数量的个体用于表型评分。基于此，我们倾向于选用rrf-3菌株，将其应用于体长调控相关的RNAi饲喂实验。选择起始菌株时还需考虑的第二个因素是：应使用DBL-1通路完整的菌株进行筛选，还是采用DBL-1通路功能受损或过度激活的致敏菌株作为起始材料。这两种不同的起始策略可能有助于鉴定出部分重叠但又各自独特的信号通路组分。本实验方案也可经适当修改后用于其他胚后表型的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick