啮齿类动物脑血管解剖结构的分析在实验性脑卒中研究中具有重要作用。在此领域，血管内灌注彩色乳胶多年来被视为一种标准技术。然而，该技术存在明显的技术局限性，影响其可重复性。本文介绍一种简单且可重复的方法，用于可视化脑血管。通过左心室注射两种市售碳黑墨水的混合物，可实现脑血管的良好充填，并获得高对比度的显影效果。我们已成功应用该技术识别了不同遗传背景小鼠脑血管区域之间的吻合点。最后，我们证实这种新颖且简便的血管染色方法可与三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色相结合——后者是观察和分析小鼠脑梗死体积的常用工具。
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摘要
摘要
脑血管的解剖结构是决定脑血流动力学以及缺血性损伤后损伤严重程度的关键因素。脑血管会动态响应多种病理生理状态，并且在不同品系以及遗传操作条件下表现出显著差异。因此，一种可靠的颅内血管染色技术对于研究缺血性脑卒中的发病机制至关重要。迄今为止，已有多种技术被用于可视化脑血管系统，包括注射低黏度树脂、Araldite F、混有不同染料1（例如胭脂红、印度墨汁）或含2或不含3炭黑的乳胶。通过升主动脉灌注白色乳胶化合物的方法最早由Coyle和Jokelainen3报道。Maeda 等2对这一方案进行了改进，通过在乳胶中添加炭黑墨汁，以提高脑组织经生理盐水灌注后血管的对比度和可视性。然而，由于乳胶化合物黏度过高，常出现灌注效率低下和血管填充不充分的问题4。因此，我们描述了一种简单且经济有效的技术，使用两种市售炭黑墨水（CB1和CB2）的混合物，以可重复的方式显示脑血管结构5。我们已证明，在小鼠中使用CB1+CB2进行灌注，相较于乳胶灌注，能够更密集地染色更细小的脑血管5。在此，我们介绍我们的实验方案，用于识别前 cerebral 动脉（ACA）与中 cerebral 动脉（MCA）之间的吻合点，以研究不同遗传背景小鼠的血管变异情况。最后，我们通过将CB1+CB2介导的血管染色与TTC染色相结合，在小鼠短暂性局灶性脑缺血模型中验证了该技术在不同程度缺血损伤下的可行性。
方案
1. 动物
- 实验根据美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的指南进行，并经当地主管部门批准。所有实验均使用C57Bl6/J野生型小鼠、载脂蛋白E-/-（ApoE KO）小鼠和SV129小鼠（12-16周龄，体重26-30 g，每实验组5-6只动物）。
2. 使用彩色乳胶对脑血管进行染色
- 在EP管中将25 μl碳黑墨水（Herlitz，德国）与0.5 ml乳胶化合物（Pebeo，法国）按1:20的比例混合，并在37 °C水浴中预热。在麻醉动物前，将混合物吸入带有28-30G针头的2 ml注射器中。
- 将50 mg盐酸罂粟碱粉末溶于1 ml无菌生理盐水中。将溶液吸入胰岛素注射器中。取另一支无菌胰岛素注射器，折断其针头，将该针头连接至一段20 cm长的PE10管末端。然后将此PE10管连接至含有盐酸罂粟碱溶液的胰岛素注射器针头上，以便通过股静脉注射，确保血管扩张及血管充分充盈。
- 另准备两支各含1 ml生理盐水的胰岛素注射器。胰岛素注射器可实现液体在精确位置的平稳输送。然而，由于乳胶黏度较高，应使用其他带有可拆卸较宽针头的1 ml注射器。
- 将所有注射器及灭菌解剖器械置于手术台附近。在手术区域周围铺上手术巾。手术台应具备充足照明，必要时可使用手术显微镜。
- 称量C57Bl6/J小鼠的体重，随后使用70% N2O和30% O2混合气体中含5%气化异氟烷进行麻醉诱导，并以1%气化异氟烷维持麻醉。将小鼠仰卧位固定，四肢固定后评估麻醉深度。切开左侧股静脉上方皮肤，暴露股静脉。插入连接于PE10管的针头尖端，以每分钟100 μl的速度缓慢注射盐酸罂粟碱溶液（剂量为50 mg/kg体重）。
- 注射完成后，切开腹腔并穿刺膈肌。剪开肋骨以暴露心脏，注意避免损伤或挫伤心脏。用动脉钳夹闭降主动脉。在右心房处做一锐性切口，使静脉血充分流出。经左心室注入2 ml生理盐水，随后在18-20秒内手动施加轻微压力注入染色乳胶。依次使用预先填充的注射器，避免注入气泡。
- 乳胶灌注后，静置动物5分钟。断头处死动物，小心取出完整脑组织。在去除颅骨和脑膜时，注意保护血管结构和皮层不受损伤。将脑组织置于含6-8 ml 4%多聚甲醛的60 mm细胞培养皿中进行拍照。在透明培养皿下方放置刻度尺，使用连接手术显微镜的相机在25倍放大倍数下拍摄脑组织背侧和腹侧表面图像。为准确量化原始距离，拍摄时应确保培养皿与显微镜物镜成90°角。
- 在另外4-5只动物中重复上述操作。
3. 使用碳黑墨水混合物对脑血管进行染色
- 为了比较基于乳胶的脑血管染色与本方案的效果，取100 μl Herlitz Stempelfarbe墨水（CB1）与900 μl Pelican Scribtol Schwarz墨水（CB2）在1.5 ml EP管中混合。准备两个EP管，共配制2 ml CB1与CB2按1:9比例混合的溶液。将混合液分别收集到两个独立的胰岛素注射器（每支1 ml）中。盖上注射器帽，并将其置于水浴中加热至37 °C。另取两个胰岛素注射器收集2 ml生理盐水，同样置于水浴中预热。
- 麻醉动物，并重复上述操作步骤，但不注射盐酸罂粟碱。在向左心室注射2 ml生理盐水后，改用2 ml碳黑墨水混合液代替彩色乳胶进行灌注。手动注射，每毫升注射施加轻微压力，持续18–20秒。在注射前夹闭降胸主动脉。
- 处死动物，取出脑组织并拍照。
- 如需长期保存脑组织，将脑置于4%多聚甲醛中固定过夜，随后在蔗糖溶液中孵育，蔗糖浓度逐步升高直至脑组织完全沉降（依次为5%、15%和30%）。经彩色乳胶灌注的动物脑组织也可采用相同方法保存。
- 在另外4–5只动物中重复该操作。为比较不同遗传背景或品系对脑血管解剖结构的影响，分别在相同数量的ApoE基因敲除小鼠和SV129小鼠中重复本方案。
- 为研究缺血条件下的血管解剖结构，根据标准的血管内闭塞方法，在深度麻醉下诱导短暂性局灶性脑缺血，持续45分钟或90分钟（手术的详细描述不在本文范围内，可参考Doeppner等，2010年的文献）。在预定的再灌注期结束时（1天或5天），仅使用CB1+CB2墨水进行血管染色，并将整个脑组织在37 °C下用2% TTC溶液染色5–10分钟，以确定梗死体积。TTC被线粒体酶（特别是琥珀酸脱氢酶）还原为红色的甲臜。TTC染色后，代谢活跃的组织呈深红色，而梗死组织因线粒体酶功能障碍和变性而不着色，呈现白色。图像采集方法同上所述。
4. 脑血管分布区域的研究
- 为分析脑血管的大体解剖结构，可使用 ImageJ 软件（一种基于 Java 的公共领域图像处理与分析软件）对经彩色乳胶或 CB1+CB2 墨水灌注后的大脑背侧表面图像进行分析。经彩色乳胶灌注的脑组织样本中，背侧表面血管染色程度可能存在变异；而经 CB1+CB2 灌注的样本则可使腹侧和背侧表面的所有血管均被染色。
- 使用 ImageJ 软件打开图像文件。识别大脑前动脉（ACA）与大脑中动脉（MCA）之间的所有吻合点。吻合点定义为血管直径最窄的部位，或分别为 ACA 与 MCA 分支最近分支点之间距离的中点。2. 使用绘图分段线工具及插件“Dotted Line”，通过标记吻合点绘制一条假想线（吻合线）。
- 将比例尺设为毫米。使用直线绘制工具和“测量”工具，测量脑额极后方4 mm处吻合线与中线之间的距离。同样方法测量额极后方6 mm处的距离。每只动物分析3-4张图像，并计算平均值。比较不同动物组间的数值，以识别脑血管解剖结构的差异。在C57Bl6/J动物中，大脑前动脉（ACA）与大脑中动脉（MCA）之间的吻合线在额极后方4 mm处较6 mm处更靠近中线。ApoE基因敲除小鼠在该指标上无显著差异。相反，在SV129小鼠中，吻合线在额极后方4 mm和6 mm处均位于更远离中线且与中线平行的位置。
- 为了分析缺血条件下的血管解剖结构，执行上述相同的计算。将梗死边界识别为红色与白色组织交界处的边缘，分别代表代谢活跃的组织和未染色的坏死组织。在距脑额极尾侧4 mm和6 mm处，测量梗死边界至中线的距离。每只动物采集3-4张图像的平均值。比较不同缺血及再灌注时间段之间的结果。
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结果
本文所述方案克服了传统基于乳胶的啮齿类动物脑血管可视化技术的局限性。图1A显示，在灌注彩色乳胶后，仅脑腹侧表面的大血管被染色，而整个背侧表面均未着色，且结果重复性差。在六只动物中，仅有一只显示出大脑背侧表面的前脑动脉（ACA）和中脑动脉（MCA）部分染色（数据未显示）。相反，CB1+CB2灌注可均匀且充分地填充大小血管（图1B），染色效果在7天内保持稳定，质量无任何变化。我们使用ImageJ程序定量分析了野生型C57Bl6/J小鼠前脑动脉（ACA）与中脑动脉（MCA）吻合点距中线的距离（图1C），并将其与ApoE基因敲除（KO）小鼠进行比较，以观察基因修饰是否影响局部脑血管解剖结构（图1D）。尽管ApoE基因敲除未影响C57Bl6/J小鼠脑血管的解剖结构，但在C57bl/6J与SV129品系之间观察到显著差异（图1E, F）。因此，我们证实了该染色方案可用于评估因基因或品系差异导致的小鼠脑血管解剖结构差异。
在实验...
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讨论
通过手动注射进行CB1+CB2的灌注无需 intensive 培训即可成功完成，因为该方法不涉及任何需要施加特定压力的专用设备2,3。在我们的方案中，灌注结果的异质性也可忽略不计。在16只非缺血动物中仅有1只、20只缺血动物中有3只出现灌注不完全。这些情况下，最可能的原因是在生理盐水灌注过程中引入气泡，导致血管阻塞，从而造成灌注失败。
尽管最初通过升主动脉灌注乳胶2,3，但也有报道采用其他灌注途径，包括左心室7,8或颈总动脉9。我们发现通过升主动脉或左心室进行灌注后，结果之间无显著差异（未发表观察）。因此，由于左心室更易于接近，故选择该途径。
在选择本研究中提及的特定碳素墨水之前，我们已评估了多种市售碳素墨水在血管内灌注中的效果。CB1 和 CB2 因其灌注效率和染色稳定性而被选用。CB1 黏度极低（1.1 mPa·s），含 2.1% 碳黑；CB2 原为书法墨水，含 2.5% 碳黑，黏度较高（10–50 mPa/s）。单独使用这两种墨水...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Britta Kaltwasser提供的出色技术协助，以及Mahesh Kumar Teli在视频拍摄准备工作中的组织工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 斯克里布托尔 黑色（CB2） | Pelican，德国 | 221 135 | |
| 印台墨水（CB1） | Herlitz PBS AG，德国 | 10417202 | |
| 格德奥 乳胶颜料 | Pebeo，法国 | 13042B |
参考文献
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重印与许可
