血管内灌注碳素墨水可实现脑血管的可靠可视化

摘要

啮齿类动物脑血管解剖结构的分析在实验性脑卒中研究中具有重要作用。在此领域，血管内灌注彩色乳胶多年来被视为一种标准技术。然而，该技术存在明显的技术局限性，影响其可重复性。本文介绍一种简单且可重复的方法，用于可视化脑血管。通过左心室注射两种市售碳黑墨水的混合物，可实现脑血管的良好充填，并获得高对比度的显影效果。我们已成功应用该技术识别了不同遗传背景小鼠脑血管区域之间的吻合点。最后，我们证实这种新颖且简便的血管染色方法可与三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色相结合——后者是观察和分析小鼠脑梗死体积的常用工具。

摘要

脑血管的解剖结构是决定脑血流动力学以及缺血性损伤后损伤严重程度的关键因素。脑血管会动态响应多种病理生理状态，并且在不同品系以及遗传操作条件下表现出显著差异。因此，一种可靠的颅内血管染色技术对于研究缺血性脑卒中的发病机制至关重要。迄今为止，已有多种技术被用于可视化脑血管系统，包括注射低黏度树脂、Araldite F、混有不同染料¹（例如胭脂红、印度墨汁）或含²或不含³炭黑的乳胶。通过升主动脉灌注白色乳胶化合物的方法最早由Coyle和Jokelainen³报道。Maeda 等²对这一方案进行了改进，通过在乳胶中添加炭黑墨汁，以提高脑组织经生理盐水灌注后血管的对比度和可视性。然而，由于乳胶化合物黏度过高，常出现灌注效率低下和血管填充不充分的问题⁴。因此，我们描述了一种简单且经济有效的技术，使用两种市售炭黑墨水（CB1和CB2）的混合物，以可重复的方式显示脑血管结构⁵。我们已证明，在小鼠中使用CB1+CB2进行灌注，相较于乳胶灌注，能够更密集地染色更细小的脑血管⁵。在此，我们介绍我们的实验方案，用于识别前 cerebral 动脉（ACA）与中 cerebral 动脉（MCA）之间的吻合点，以研究不同遗传背景小鼠的血管变异情况。最后，我们通过将CB1+CB2介导的血管染色与TTC染色相结合，在小鼠短暂性局灶性脑缺血模型中验证了该技术在不同程度缺血损伤下的可行性。

方案

1. 动物

1. 实验根据美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的指南进行，并经当地主管部门批准。所有实验均使用C57Bl6/J野生型小鼠、载脂蛋白E^-/-（ApoE KO）小鼠和SV129小鼠（12-16周龄，体重26-30 g，每实验组5-6只动物）。

2. 使用彩色乳胶对脑血管进行染色

1. 在EP管中将25 μl碳黑墨水（Herlitz，德国）与0.5 ml乳胶化合物（Pebeo，法国）按1:20的比例混合，并在37 °C水浴中预热。在麻醉动物前，将混合物吸入带有28-30G针头的2 ml注射器中。
2. 将50 mg盐酸罂粟碱粉末溶于1 ml无菌生理盐水中。将溶液吸入胰岛素注射器中。取另一支无菌胰岛素注射器，折断其针头，将该针头连接至一段20 cm长的PE10管末端。然后将此PE10管连接至含有盐酸罂粟碱溶液的胰岛素注射器针头上，以便通过股静脉注射，确保血管扩张及血管充分充盈。
3. 另准备两支各含1 ml生理盐水的胰岛素注射器。胰岛素注射器可实现液体在精确位置的平稳输送。然而，由于乳胶黏度较高，应使用其他带有可拆卸较宽针头的1 ml注射器。
4. 将所有注射器及灭菌解剖器械置于手术台附近。在手术区域周围铺上手术巾。手术台应具备充足照明，必要时可使用手术显微镜。
5. 称量C57Bl6/J小鼠的体重，随后使用70% N_....

结果

本文所述方案克服了传统基于乳胶的啮齿类动物脑血管可视化技术的局限性。图1A显示，在灌注彩色乳胶后，仅脑腹侧表面的大血管被染色，而整个背侧表面均未着色，且结果重复性差。在六只动物中，仅有一只显示出大脑背侧表面的前脑动脉（ACA）和中脑动脉（MCA）部分染色（数据未显示）。相反，CB1+CB2灌注可均匀且充分地填充大小血管（图1B），染色效果在7天内保持稳定，质量无任何变化。我们使用ImageJ程序定量分析了野生型C57Bl6/J小鼠前脑动脉（ACA）与中脑动脉（MCA）吻合点距中线的距离（图1C），并将其与ApoE基因敲除（KO）小鼠进行比较，以观察基因修饰是否影响局部脑血管解剖结构（图1D）。尽管ApoE基因敲除未影响C57Bl6/J小鼠脑血管的解剖结构，但在C57bl/6J与SV129品系之间观察到显著差异（图1E, F）。因此，我们证实了该染色方案可用于评估因基因或品系差异导致的小鼠脑血管解剖结构差异。

在实验.......

讨论

通过手动注射进行CB1+CB2的灌注无需 intensive 培训即可成功完成，因为该方法不涉及任何需要施加特定压力的专用设备^2,3。在我们的方案中，灌注结果的异质性也可忽略不计。在16只非缺血动物中仅有1只、20只缺血动物中有3只出现灌注不完全。这些情况下，最可能的原因是在生理盐水灌注过程中引入气泡，导致血管阻塞，从而造成灌注失败。

尽管最初通过升主动脉灌注乳胶^2,3，但也有报道采用其他灌注途径，包括左心室^7,8或颈总动脉⁹。我们发现通过升主动脉或左心室进行灌注后，结果之间无显著差异（未发表观察）。因此，由于左心室更易于接近，故选择该途径。

在选择本研究中提及的特定碳素墨水之前，我们已评估了多种市售碳素墨水在血管内灌注中的效果。CB1 和 CB2 因其灌注效率和染色稳定性而被选用。CB1 黏度极低（1.1 mPa·s），含 2.1% 碳黑；CB2 原为书法墨水，含 2.5% 碳黑，黏度较高（10–50 mPa/s）。单独使用这两种墨水.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
斯克里布托尔 黑色（CB2）	Pelican，德国	221 135
印台墨水（CB1）	Herlitz PBS AG，德国	10417202
格德奥 乳胶颜料	Pebeo，法国	13042B