方法文章

染色体复制时间分析与荧光原位杂交相结合

13.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/4400

⸱

2012年12月10日

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

本文内容

摘要

一种用于分析染色体复制时间的定量方法。该方法利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入与荧光 原位 杂交（FISH）来评估哺乳动物染色体的复制时序。该技术可在同一细胞内直接比较发生重排与未发生重排的染色体。

摘要

哺乳动物的DNA复制在S期的不同时间沿染色体上的多个位点启动，遵循一种时序性的复制程序。复制时序的确定被认为是一个动态过程，受到组织特异性和发育信号的调控，这些信号对表观遗传修饰具有响应性。然而，调控DNA复制在染色体上启动位置和时间的机制仍知之甚少。同源染色体通常同步复制，但这一规则存在显著例外。例如，在雌性哺乳动物细胞中，两条X染色体中的一条通过一种称为X染色体失活的过程变为晚期复制1。伴随着这种复制时序的延迟（估计为2-3小时），其中一条X染色体上的大多数基因发生转录沉默。此外，一个被称为X失活中心的特定顺式作用位点调控这一X染色体失活过程，包括诱导整个失活X染色体的复制时序延迟。此外，在癌细胞以及暴露于电离辐射的细胞中发现的某些染色体重排，表现出显著的复制时序延迟（>3小时），并影响整条染色体2,3。我们实验室近期的研究表明，破坏特定的常染色体顺式作用位点会导致整条染色体出现极晚期复制的表型4。其他“染色体工程”研究也表明，影响多种不同染色体的某些染色体重排会导致这种异常的复制时序表型，提示所有哺乳动物染色体均含有控制各条染色体正常复制时序的特定顺式作用位点5。

本文介绍了一种将染色体复制时间的定量分析与荧光原位杂交相结合的方法。该方法可在同一细胞内直接比较同源染色体之间的复制时间，其改编自文献6。此外，该方法能够明确识别与影响整条染色体复制时间变化相关的染色体结构重排。相较于近期开发的高通量微阵列或测序技术，本方法具有优势，后者无法区分存在于结构重排与未重排染色体上的同源等位基因。此外，由于本方法针对单个细胞进行分析，因此能够检测到仅在细胞群体中部分细胞存在的染色体结构重排所引发的染色体复制时间变化。

方案

1. BrdU 掺入（末端标记）

  1. 在添加 BrdU 前 24 小时，将细胞接种于 150 mm 组织培养皿中，使其贴壁至约 70% 汇合度。
  2. 在收获前的适当时间点，更换为含 20 μg/ml BrdU（Sigma）的新鲜完全培养基。细胞在含 BrdU 培养基中培养的时间因细胞类型和物种而异，通常 G2 期持续 2 至 5 小时（图 1）。

2. 单层细胞培养物的染色体收获

  1. 从培养板中移除培养基，并收集 10 ml 至 15 ml 锥形离心管中。弃去剩余培养基。
  2. 用 10 ml Versine [或 HBSS (Sigma)] 将细胞冲洗一次。
  3. 向培养板中加入 5 ml 含 0.25% 胰蛋白酶的 Versine（或 HBSS）。于室温孵育，直至细胞从培养板上脱落。
  4. 将胰蛋白酶消化后的细胞悬液加入步骤 2.1 中含有 10 ml 培养基的离心管中。
  5. 以 400 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，保留 0.5 ml 培养基及细胞沉淀。
  6. 用巴斯德移液管充分重悬细胞。
  7. 加入 3 滴低渗溶液（0.075 M KCl (Sigma)，预热至 37 °C）；用巴斯德移液管混匀细胞悬液。再加入 0.5 ml 低渗溶液，再次用巴斯德移液管混匀。将低渗溶液体积补至 5 ml，再用巴斯德移液管混匀一次。根据细胞类型，在 37 °C 孵育 20–45 分钟。
  8. 以 400 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，保留 0.5 ml 培养基及细胞沉淀。
  9. 通过轻轻弹击离心管使细胞沉淀重悬。此时细胞因渗透压膨胀而较为脆弱，因此需小心操作，避免破坏细胞膜。
  10. 加入 3 滴卡诺氏固定液（冰醋酸:甲醇 = 1:3）；用巴斯德移液管轻轻吹打混匀。再加入 0.5 ml 固定液，再次用巴斯德移液管轻轻吹打混匀。将固定液体积补至 5 ml，再用巴斯德移液管轻轻吹打混匀。固定后的细胞可在避光条件下于 -20 °C 保存数月。
  11. 参照步骤 2.8 进行离心和吸除上清。
  12. 将细胞沉淀用新鲜固定液重悬；估计沉淀体积，并加入约 10 倍体积的卡诺氏固定液。
  13. 将细胞悬液逐滴加至湿润且预冷的载玻片上；手持载玻片呈约 45° 角，使细胞悬液沿玻片表面流动。将玻片平放于纸巾上，用固定液充分覆盖玻片并自然晾干。使用倒置显微镜检查玻片上是否存在有丝分裂展片。

3. RNase 处理与乙醇脱水

  1. 向每张载玻片加入 200 μl 含 10 μg/ml RNase A（Sigma）的 2x SSC 溶液；在 37 °C 下孵育 1 小时。
  2. 在室温下用 2x SSC（pH 7.0）洗涤载玻片 3 次，每次 3 分钟。
  3. 将载玻片在室温下依次经乙醇（Sigma）系列（70%、90% 和 100%）脱水处理，每步 3 分钟。
  4. 在室温下将载玻片空气干燥。

4. 用于BAC加染色体特异性着丝粒计数探针（CEP）或全染色体涂染原位杂交的探针混合物的制备

  1. 对于 BAC/CEP 同时杂交，需分别配制两种不同的探针混合液用于预杂交。我们发现，在不同杂交强度条件下分别对 BAC 和 CEP 探针进行预杂交，可降低背景信号并提高信号强度。此外，我们还发现单个 Fosmid 可替代 BAC 克隆使用。以下所述的混合液配制方案适用于单张载玻片；若使用相同探针对多张载玻片进行处理，可按比例相应增加体积。

    *BAC DNA 探针混合液：
    11.5 μl 杂交缓冲液（50% 甲酰胺（Sigma）/2x SSC /硫酸葡聚糖（Sigma）） 2 μl dH2O

    2.5 μl BAC/Cot1 DNA 溶于 dH2O 中（标记方案见下文） 总体积 15 μl


    *CEP 探针混合液：
    7 μl CEP 杂交缓冲液（65% 甲酰胺/2x SSC/硫酸葡聚糖） 2 μl dH2O

    1 μl CEP/Cot1 DNA（购自商业来源，已预先标记为 Spectrum Orange/Cy3/德克萨斯红） 总体积 10 μl

    *在变性及预杂交（步骤 5.1）后，按 3:2 的比例混合 BAC 探针与 CEP 探针，每张载玻片加入 25 μl，并充分混匀探针混合液。


    或者
  2. 将 20 μl/张的全染色体涂染探针（Cy3/德克萨斯红）分装至离心管中。随后进行变性及预杂交步骤。

5. 载玻片与探针变性及 原位 杂交

  1. 将探针混合物在 75 °C 下变性 10 分钟。在 37 °C 下预杂交 30 分钟，使 Cot1 DNA 与重复序列结合，防止其后续与中期染色体发生杂交。
  2. 将载玻片置于 Coplin 染色缸中的 70% 甲酰胺/2x SSC（pH 7.0）溶液中，在 72 °C 下变性 3 分钟。
  3. 立即在 4 °C 的 Coplin 染色缸中依次通过乙醇系列（70%、90% 和 100%）进行脱水处理，每步 3 分钟。
  4. 让载玻片在室温下自然干燥。
  5. 在探针预杂交步骤（步骤 5.1）的最后 10 分钟内，将载玻片在载玻片加热板上预热至 45 °C。根据需要混合预杂交后的探针混合物，每张载玻片加入 25 µl；轻轻盖上盖玻片，并用橡胶胶水密封所有边缘。置于湿化 chamber 中 37 °C 过夜孵育，防止蒸发。

6. 杂交后洗涤

  1. 在 Coplin 染色缸中用 50% 甲酰胺/2x SSC（pH 7.0）溶液于 38–40 °C 下洗涤载玻片，每次 3 分钟，共洗涤 3 次。不同探针的洗涤温度可能有所不同。如果杂交背景较高，可适当提高洗涤温度；反之，若信号微弱且无背景，则可降低洗涤温度。
  2. 在室温下用 PN 缓冲液洗涤载玻片 1 次，每次 3 分钟，随后进入 BrdU 检测步骤。

7. BrdU 检测

  1. 在室温避光条件下，用 PNM 缓冲液封闭载玻片 10 分钟（每张载玻片 200 μl）。
  2. 将载玻片边缘朝下置于纸巾上以沥干；每张载玻片加入 100 μl 抗 BrdU-FITC 抗体（Roche 或 Millipore，50 μg/ml）溶于 PNM 缓冲液中，37 °C 下孵育 30 分钟。
  3. 用 PN 缓冲液在室温下洗涤载玻片 3 次，每次 3 分钟。
  4. 逐张将载玻片边缘朝下置于纸巾上，去除多余的 PN 缓冲液；每张载玻片加入 20 μl DAPI/抗荧光淬灭封片液（Invitrogen）。盖上纸巾后轻压盖玻片，以排出气泡和多余封片液。随后进行图像分析。

8. 捕获图像并定量分析 BrdU 掺入

  1. 使用 Olympus BX61 荧光显微镜、Olympus CCD 相机、100 倍物镜、自动滤光轮和 Cytovision 软件（Applied Imaging）采集图像。BrdU 使用 FITC 滤光片采集；染色体涂染探针（Texas Red，Metasystems 或 Cytocell）、BAC 探针（Cy3）和 CEP 探针（Vysis Spectrum Orange）使用 Texas Red 或 Cy3 滤光片采集；DAPI 使用 DAPI 滤光片采集（参见 图2和图3).
  2. 感兴趣的单个染色体通过 BAC/CEP 或染色体特异性着色探针进行鉴定（图2B和图3B）。利用 Cytovision 软件，将每条感兴趣的染色体作为一个整体从中期 spreads 中“剪切”出来，并沿染色体从短臂到长臂的全长画一条线图2C和图3C）。使用Cytovision软件对每条染色体全长上的像素强度分布进行定量分析。Cytovision软件计算像素所占据的面积，并量化每条分离染色体上由BrdU或DAPI信号所代表的像素强度。随后，将每条染色体所代表的平均像素强度乘以这些像素所占据的面积，以获得总像素数（表1和图4。此外，本方案还可用于可视化染色体上最晚复制的区域。因此，通过BrdU掺入的条带模式可检测染色体的活跃复制区域，而染色体对之间复制时间的差异则表现为条带模式的差异。图2和图3最后，可将这些结合模式的差异与各染色体已知的复制时间图谱进行比较6,7，可用于估算同源染色体或染色体臂之间的复制时间差异4例如，两条6号染色体中的 图3A 显示带型模式的差异 >与6号染色体正常的复制时间相比延迟2小时4.
    此外，类似于此处所述的方法已成功用于研究失活与活性X染色体之间的异步复制时序8,9使用X染色体荧光涂染法鉴定活性与非活性X染色体。采用Quips mFISH软件（Vysis）采集图像，随后利用NIH Image软件计算X染色体所占像素数以及荧光标记的BrdU所占像素数。http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html).

9. BAC DNA 的荧光标记缺口平移法（Vysis）

  1. 向一个预冷的微量离心管中加入以下探针混合物：
    70 μl（4 μg DNA）dH2O
    10 μl 0.2 mM dUTP-Orange 或 Green
    20 μl 0.1 mM dTTP
    20 μl 10x Nick Translation Buffer
    40 μl NT dNTP（不含dTTP）
    40 μl nick Translation酶
    总体积200 μl
    在16 °C下孵育过夜。于70 °C加热10分钟以终止反应。冰上冷却5分钟。
  2. 通过向探针混合物中加入以下成分进行DNA乙醇沉淀：
    200 μl探针溶液
    48 μl 3 M NaOAc
    160 μl Cot1DNA（0.25 μg/μl）
    1,200 μl 100% EtOH
  3. 在-80 °C下保存10分钟至过夜。
  4. 在4 °C下以12,000 × g离心20分钟。倾去上清EtOH。用70% EtOH洗涤一次。按前述条件再次离心。倾去EtOH。风干至乙醇完全挥发。用40 μl dH2O重悬，得到BAC DNA终浓度为100 ng/μl。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

人类6号染色体复制时间分析的一个示例如下所示 图2. 缺失 ASAR6 基因的细胞4位于6q16.1的染色体区域经BrdU处理5小时后，收集有丝分裂细胞，并使用染色体6全涂探针（Vysis）进行FISH检测及BrdU掺入分析。请注意，两条6号染色体之间的BrdU带型存在显著差异，这与复制时间延迟的现象一致 >2 小时，针对 6 号染色体中的一个 [参见4 染色体6在缺失前的复制时间带型。此外，与DAPI染色的类似分析相比，BrdU掺入总量（像素）存在显著差异。图 2D).

人类6号染色体复制时间分析的另一个示例如下所示 图3. 含有 ASAR6 基因相同缺失的细胞4 显示如果 图2 暴露于BrdU中5小时，收集有丝分裂细胞，并使用染色体6着丝粒探针及包含ASAR6基因的BAC探针进行FISH处理，同时检测BrdU掺入情况。注意，缺失的染色体6（Δ6）显示出比未缺失的染色体6更高...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

制备染色体铺展是本文所述复制时序检测成功的关键步骤。在低渗处理前加入秋水仙胺预处理步骤，可能有助于提高有丝分裂细胞的出现频率及其铺展效果。我们通常在收获细胞前用秋水仙胺处理1–3小时，终浓度为10 µg/mL。然而，加入秋水仙胺预处理步骤可能改变G2期的长度，从而可能影响染色体的表观复制时序及其凝缩状态3。

通过调整 BrdU 孵育时间（取决于细胞周期持续时间），该方法可应用于多种不同细胞类型和物种。对于大多数人和小鼠细胞系，G2 期通常为 3–6 小时；因此，BrdU 处理时间通常在此范围内。另一种替代 BrdU 的试剂是 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU），其后续检测可通过荧光叠氮化物与“点击化学”反应实现10。EdU 检测方法相较于 BrdU 检测具有多项优势。例如，EdU 检测无需样本固定或 DNA 变性。因此，使用 EdU 评估复制时序时，可结合简单的 G 显带技术而非荧光原位杂交（FISH）来鉴定目标染色体。

本文所述的复制时间程序专门设计用于检测晚S期以及延伸至G...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

本工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 CA131967 的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗-BrdU-FITCRoche Millipore11202593001 MAB326F50 μ克/升μl
缺口平移试剂盒Abbott Molecular (Vysis)07J00-0001
Spectrum Orange dUTPAbbott Molecular (Vysis)02N33-050
着丝粒探针Abbott Molecular (Vysis)不同
LSI/WCP 杂交缓冲液Abbott Molecular (Vysis)06J67-011
CEP杂交缓冲液Abbott Molecular (Vysis)07J36-001
染色体涂染MetaSystems 集团D-14NN-050-TR
奥林巴斯BX61荧光显微镜OlympusBX61TRF-1-5
显微镜成像软件系统应用成像Cytovision 3.93.1
数码相机OlympusUCMAD3

原位 杂交反应配方
甲酰胺溶液
70% 甲酰胺/2x SSC

35 ml 甲酰胺*（Sigma）
10 ml 10x SSC
5 ml d2H20
用 HCl（Sigma）调节 pH 至 7.0

* 必须使用储存在 -20℃ 的甲酰胺 °C. 长时间室温储存会产生甲酸，导致pH过低。

50% 甲酰胺/2x SSC

25 ml 甲酰胺（Sigma）
10 ml 10× SSC
15 ml dH₂O2O
用 HCl（Sigma）调节 pH 至 7.0

20x SSC，4 L

702 g NaCl (Sigma)
358 g 柠檬酸钠（Sigma）
dH2O至体积

PN缓冲液 [0.1 M NaP04 0.1% NP-40 （Sigma）]

配制 0.1 M 的磷酸钠溶液 （经滤膜除菌后，分装保存于500 ml等分试样中）。

0.1 M NaH2P04 ，1 L

13.8 g NaH2P04 （Sigma）：
dH2O至体积

0.1 M NaH2P04 1 L

14.2 g NaH2P04 (Sigma)
dH2O至体积。

PN：调节 0.1 M Na 的 pH 值2HP04 用0.1 M NaH调至pH 8.02P04过滤除菌后加入1 ml NP-40。

PNM 50 ml

1.25 g 脱脂奶粉（Sigma）
25 ml PN缓冲液（见上文配方）

持续搅拌混合15-20分钟。以400 × g离心两次，每次10分钟。取上清液使用，并注意不要扰动已沉淀的牛奶蛋白。

参考文献

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
  3. Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
  4. Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
  5. Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
  6. Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
  7. Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
  8. Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
  9. Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  11. Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
  12. Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
  13. Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Chromosome Replication TimingBRDU IncorporationMetaphase Chromosome AnalysisDNA FISH ProtocolCyto Vision SoftwareHomologous Chromosome ComparisonChromosomal Rearrangement DetectionReplication Timing QuantificationSingle Cell Analysis

相关文章