本文描述了从一种常见的市售I型胶原单体出发，制备三种结构不同的胶原组装体的简单且可重复的方法。通过改变长度为300 nm、直径为1.4 nm的单体构建单元所暴露的条件，可分别形成天然型、纤维长间距或节段性长间距胶原。
本文内容
摘要
摘要
胶原纤维存在于动物组织的细胞外基质中，为组织提供结构支架和机械强度。这些天然胶原纤维具有约67 nm的特征性周期性条带结构，并由三股螺旋的原胶原分子自组装形成。 体内 通过I型胶原单体的分级组装，这些单体长度为300 nm，直径为1.4 nm。 体外通过调控单体结构单元所暴露的条件，可构建出长度尺度达50微米的多种独特结构，不仅包括天然型原纤维，还包括纤维长间距和节段性长间距胶原。本文介绍了利用一种常见的商业化胶原单体形成这三种不同胶原结构的实验步骤。我们及他人以往发表的方案在制备这三种结构时通常会得到混合产物。特别是制备天然型胶原时常出现无带状原纤维，而在制备纤维长间距胶原时又常混有天然原纤维。这些新方案的优势在于几乎 exclusively 地生成目标类型的胶原原纤维。目标结构的形成通过原子力显微镜成像予以验证。
引言
胶原蛋白是一类具有三股螺旋结构的结构蛋白，由三条多肽链组成。这些三股螺旋单体进一步以层级方式组装，形成逐渐增大的结构。目前已鉴定出至少28种遗传上不同的胶原蛋白类型1。胶原蛋白 collectively 占动物体内总蛋白质的30%，其中I型胶原蛋白为主要形式，占所有胶原蛋白的90%2。I型胶原蛋白以纤维状结构存在于皮肤、韧带、肌腱和骨骼中。I型天然胶原纤维的原子力显微镜（AFM）和电子显微镜（EM）图像通常显示出周期约为67 nm的条带结构（常称为D-条带）3-5。
I型胶原单体是一种由两条相同的α1(I)链和一条α2(I)链组成的三股螺旋异源三聚体，每条链均超过一千个氨基酸残基。其形态细长，长约300 nm，直径为1.4 nm。I型胶原单体可通过降解天然形成的高级结构而 readily 获得 6。我们 7 以及其他许多人 8-10 已表明这些可溶性单体结构单元可用于重建具有D带状结构的原纤维 体外 (图1).
除了天然胶原原纤维外，还发现有两种其他高级结构的胶原结构能够形成 体外 使用相同的单体结构单元。这两种结构是纤维长间距（FLS）和节段性长间距（SLS）胶原图1FLS 胶原是一种类似天然胶原的纤维状结构，但其条带周期性较天然胶原更大。 11. 体外，FLS 胶原在胶原单体与 α1-酸性糖蛋白结合时形成 12已观察到FLS胶原 体内 同样，尽管很少见 13SLS胶原被描述为晶粒，因为其单体像晶体晶格一样有序排列。 14SLS 胶原在胶原单体与三磷酸腺苷（ATP）结合时形成 15天然存在的SLS胶原已在成纤维细胞的培养基中被观察到，但在提取的组织样本中未发现，这可能与其分子尺寸较小且缺乏可辨识的拓扑特征有关。 16.
本文的目标是提供详细的实验方案，用于制备天然胶原原纤维以及 FLS 和 SLS 胶原，即使经验最少的研究人员也能成功重复。我们采用市售的高级起始材料，力求使实验流程尽可能简化，同时确保结果的可靠性。此外，我们还详细描述了如何使用原子力显微镜（AFM）对所制备的不同胶原结构进行表征。本研究将有助于希望研究这些高级胶原结构中的一种或多种，或将其作为前体用于其他应用但目前缺乏相关技术经验或不愿直接处理组织样本的研究人员。
方案
注意：所有实验方案中使用的水的电阻率 >18 MΩ·cm。
1. 天然胶原原纤维
- 在微量离心管中加入 6 μl 水、20 μl 用 HCl 调节至 pH 7 的 200 mM Na2HPO4 溶液和 10 μl 400 mM KCl，混匀。
- 向该微量离心管中加入 4 μl 胶原蛋白单体（约 3 mg/ml，溶于 0.01 N HCl），混匀。溶液应呈澄清无色。
- 将含有反应混合物的微量离心管置于已预热至 37 °C 的加热块中，孵育 3 至 4 小时。此时溶液应略显浑浊，且主要含有天然胶原纤维。
2. 纤维长间距胶原
- 使用12-14 kDa截留分子量（MWCO）透析膜，将1 ml胶原单体（约3 mg/ml，溶于0.01 N HCl中）在400 ml水中进行透析，室温下24小时内换水四次。未立即使用的透析后胶原单体可在4 °C保存以备后续使用。
- 在微量离心管中混合20 μl水、20 μl溶于水中的3 mg/ml α1-酸性糖蛋白以及20 μl透析后的胶原单体。所得溶液应澄清无色。
- 将含有反应混合物的微量离心管在室温下静置30分钟。此时溶液应变得浑浊，并主要含有FLS型胶原原纤维。
3. 节段性长间距胶原
- 在微量离心管中加入 67 μl 水、60 μl pH 3.3 的 100 mM 甘氨酸-盐酸缓冲液和 40 μl 水中配制的 10 mg/ml ATP，混匀。
- 向微量离心管中加入 33 μl 胶原单体（约 3 mg/ml，溶于 0.01 N HCl），混匀。溶液应呈澄清无色。
- 将含有反应混合物的微量离心管在室温下静置 2 小时。此时溶液外观仍为澄清，但应主要含有 SLS 胶原。
4. 原子力显微镜表征
- 用胶带覆盖附着在原子力显微镜（AFM）基底上的云母片表面，然后将胶带剥离，以剥离云母表面。之后检查胶带，确认已剥离掉一整层云母，从而减少表面不规则性；若重复使用云母片，此步骤还可确保去除旧样品。
- 将 20 μl 胶原原纤维溶液滴加到新剥离的云母基底上，静置 5 分钟。
- 用去离子水轻轻冲洗云母基底上的胶原原纤维溶液。建议不要将水直接冲在云母基底中心，而应从边缘冲洗，使水流自然流过样品表面。
- 用温和的氮气气流吹干表面。建议将气流对准云母基底边缘而非中心，以避免样品损伤。
- 在 200× 放大倍数的光学显微镜下观察，天然胶原和 FLS 胶原样品应可见原纤维聚集体，而 SLS 胶原则不可见。
- 三种不同胶原结构的独特特征可通过原子力显微镜（AFM）观察。通常，我们采用硅制 AFM 探针在间歇接触模式下对天然胶原原纤维进行成像；而对于 FLS 和 SLS 胶原原纤维，则通常使用氮化硅 AFM 探针在接触模式下成像。这一选择主要基于时间和成本的考虑。硅制 AFM 探针通常比氮化硅探针更尖锐，因此更适合分辨天然胶原原纤维较细的条带结构。然而，硅制探针比氮化硅探针更容易被胶原样品污染，需频繁更换。因此，我们主要将硅制 AFM 探针保留用于对分辨率要求更高的天然胶原原纤维成像，并采用间歇接触模式以延长其使用寿命。
建议首先进行100 × 100 μm2的扫描，应至少观察到几个胶原结构。随后逐步缩小扫描范围至10 × 10 μm2，再至2 × 2 μm2，以观察天然胶原和FLS胶原的条带周期性，或SLS胶原的更精细特征。此外，建议至少在胶原样品的另外两个区域进行检测，以确认初始扫描结果具有代表性。
结果
天然胶原蛋白
将浓度约为 0.3 mg/ml 的胶原单体溶于 pH 7 的 100 mM 磷酸盐缓冲液和 100 mM KCl 中，在 37 °C 下孵育 3–4 小时，可得到含有天然型胶原原纤维的溶液，其具有清晰的约 67 nm 的 D 带周期性结构，且无非带状原纤维存在。
在200倍放大的光学显微镜下，通常可以在云母基底上观察到多个纤维聚集成簇的现象，尤其是在使用微分干涉差（DIC）显微镜观察时（图2）。在典型的样品中，通过原子力显微镜（AFM）对100 × 100 μm2区域进行扫描，通常可观察到数条长度为5–50微米的纤维（图3a-c）。在此阶段，可轻松识别出独立且分离的胶原纤维。当采用512 × 512像素2图像扫描，并将扫描范围缩小至10 × 10 μm2时，可观察到所有纤维均呈现条带结构（图3d-f）。为了准确测量条带周期性，最佳方式是进一步缩小至2 × 2 μm2的扫描范围（图3g-i）。
条带周期性可通过简单测量并计算多个峰或谷之间的纵向距离的平均值来确定。或者，如果原子力显微镜（AFM）软件支持，也可沿纵向截面进行一维傅里叶变换来分析。图4展示了一根原纤维的AFM高度图像及其相应的纵向截面图。
FLS 胶原蛋白
将1 mg/ml的μ1-酸性糖蛋白和约1 mg/ml的胶原单体水溶液在室温下放置30分钟，即可得到FLS胶原原纤维溶液。
在200倍光学显微镜下，可在云母基底上清晰观察到成簇的原纤维，其形态与天然胶原蛋白中的情况相似。在典型样品中，原子力显微镜对随机选取的100 × 100 μm2区域进行扫描时，通常至少可观察到几根原纤维。当采用512 × 512像素2的图像扫描尺寸时，可通过放大10 × 10 μm2扫描区域（图5a）测量条带周期性，或更精确地采用2 × 2 μm2扫描区域进行测量（图5b）。图5c显示了一根FLS原纤维的纵向截面。
SLS 胶原蛋白
将2 mg/ml ATP和约0.5 mg/ml胶原单体溶于pH 3.3的100 mM甘氨酸-HCl缓冲液中，室温下静置2小时，即可得到SLS胶原溶液。
通常情况下，SLS 结晶在光学显微镜下不可见，需要使用原子力显微镜（AFM）来确认 SLS 结晶的存在。在典型样品中，AFM 对随机选取的 100 × 100 μm2 区域进行扫描通常会显示多个点状物。进一步放大至 10 × 10 μm2 扫描区域，通常可观察到多个 SLS 结晶（图 6a）。而 2 × 2 μm2 的扫描区域（图 6b）则可显示 SLS 结晶的精细结构。
图1. 可形成的三种结构不同的胶原原纤维形式 体外 来自胶原单体。原子力显微镜图像展示了胶原单体及三种更高级的胶原结构，所有图像均在同一尺寸尺度下（2 × 2 μm2).
图 2. 以光学微分干涉差（DIC）显微镜在约200倍放大下拍摄的云母表面天然胶原纤维的数字图像：（a）未经处理；（b）经过阈值处理和锐化以突出纤维结构。
图3. 云母表面天然胶原原纤维的原子力显微镜（AFM）图像。显示的是间歇接触模式AFM振幅图像。
图 4. (a) 0.5 × 1 μm2 间歇接触模式原子力显微镜高度图像（垂直尺度 = 100 nm）和 (b) 天然胶原原纤维的纵向截面图。
图 5. FLS 胶原原纤维在云母表面的原子力显微镜（AFM）图像。（a）10 × 10 μm2 接触模式 AFM 偏转图像，（b）2 × 2 μm2 接触模式 AFM 偏转图像，以及（c）FLS 胶原原纤维的纵向截面图。
图 6. 云母表面SLS胶原的原子力显微镜图像。显示的是间歇接触模式原子力显微镜的振幅图像。
讨论
纯化的胶原蛋白单体在低pH值和低温条件下稳定，而天然胶原纤维的形成本质上需要提高胶原单体溶液的pH值和温度。从单体重构带状胶原纤维的方法已有50多年的历史。15年前我们的实验室在最初研究胶原蛋白时所采用的方案7，是基于Chapman及其同事在1986年总结的方法10。早期工作中胶原纤维形成的条件为：在Na2HPO4/KH2PO4缓冲液（I = 0.2，pH 7.4）中，胶原单体浓度为0.18 mg/ml，反应温度为34 °C。该方法以及我们尝试过的其他方法的一个缺点是，总会伴随生成非带状纤维，与目标的带状纤维同时存在。我们新的实验条件为：在pH 7的100 mM磷酸盐缓冲液和100 mM KCl中，胶原单体浓度约为0.3 mg/ml，37 °C下孵育3-4小时。本文所述方法在各个方面均不同于早期制备天然胶原纤维的方案。其中最显著的区别是，我们通过提高缓冲液浓度并添加100 mM KCl，使离子强度增加了一倍。离子强度的提高使得仅形成带状胶原纤维的结果更加一致和可靠。
根据我们的经验，该实验步骤未能生成天然型胶原蛋白的唯一情况是胶原蛋白单体溶液已超过制造商推荐的使用期限。当发生这种情况时，观察结果可能从完全无带状结构且纤维数量较少，到仍可见大量纤维但主要为无带状结构不等。需要注意的是，过期的胶原蛋白单体通常仍可成功用于制备天然胶原蛋白，但一旦失败，必须购买新的胶原蛋白单体。
FLS 最初由 Highberger 鉴定发现 等 17 在Orekhovich归功的胶原蛋白制备方法中 等 18进一步的研究使 Highberger 和 Schmitt 得出结论，即α1-酸性糖蛋白可促进 FLS 的形成 12随后，我们通过将市售的胶原单体与α1-酸性糖蛋白在低pH条件下混合，并将混合物对水透析24小时，使pH缓慢升高，成功地重复了制备FLS胶原的步骤。 11我们现介绍对该方法的一种改进：首先将胶原单体对水进行透析，然后直接将其与水中的α1-酸性糖蛋白混合，以形成FLS胶原。本文所述的FLS胶原组装条件耗时显著缩短。胶原单体仍需预先对水透析，但可批量处理后稳定储存在4 °C，待使用时取出。该新方法主要生成带状FLS胶原原纤维。
根据我们的经验，α1-酸性糖蛋白的结合蛋白和水含量较低（即糖含量较高），这对于成功制备 FLS 原纤维至关重要。我们通常会向生产商确认所使用的 α1-酸性糖蛋白批次的蛋白与水总含量不超过 82%。此外，与天然胶原蛋白合成方法类似，过于陈旧的胶原蛋白单体也可能导致无法生成 FLS 胶原蛋白。同时，透析过程中所用水的纯度在本实验中也极为关键。例如，若将胶原蛋白单体透析所用的水由 >18 MΩ.cm 改为约 8 MΩ.cm，所得胶原蛋白溶液将无法形成 FLS 胶原蛋白。
在三种胶原原纤维中，最易于制备的是SLS胶原。最早的SLS制备方法由Schmitt及其同事描述15。12年前，我们发表了一种该方法的改进方案，用于使用市售胶原制备SLS胶原14。该方法仅需将2 mg/ml ATP与0.5 mg/ml胶原单体溶于pH 3.5的0.05%（v/v）乙酸溶液中，浓度分别为，混合后于室温下静置过夜即可。
根据我们的经验，SLS 组装过程中必须控制的关键因素是反应溶液的 pH 值。在较偏碱性的条件下（~pH 3.6–3.9）组装 SLS 会导致结晶体聚集成块；而在较偏酸性的条件下（~pH 2.9–3.2）所形成的结晶体则比在理想 pH 条件（pH 3.3–3.5）下组装的更薄且更分散。超出该范围的反应 pH 值（< 2.8 和 > 4）则无法生成任何 SLS 胶原。过去，我们通过添加乙酸来调节反应混合物的 pH 值。为了进一步简化操作步骤，本文中我们引入了甘氨酸-盐酸缓冲液以控制 pH 值。
上述方案形成的三种不同胶原结构具有特征性特点，只能通过具备纳米级分辨率的仪器加以识别。天然胶原和FLS胶原的特征是具有约67 nm和约270 nm的条带周期性。SLS胶原的最大尺寸仅为约360 nm。我们已具体描述了如何使用原子力显微镜（AFM）来表征这三种不同的胶原结构。然而，任何在接触模式或间歇接触模式下运行、且探针半径<10 nm的AFM也均应能够成像这些胶原结构。此外，透射电子显微镜或扫描电子显微镜亦可并已被用于表征这些胶原结构19。
这些实验步骤的主要优势在于能够主要生成所需的胶原结构。反应中唯一存在的其他形式的胶原是起始单体，通常在原子力显微镜（AFM）图像背景中可见。对于天然胶原和FLS胶原，可通过反复离心，并用水洗涤所得的天然胶原或FLS胶原沉淀，从而将其与大部分未反应的单体有效分离。
我们介绍了使用先进的商业化起始材料制备天然胶原蛋白、纤维状胶原蛋白（FLS）和丝状胶原蛋白（SLS）的简单且可靠的步骤。所有这些步骤中使用的胶原蛋白单体均可从商业途径获得纯化形式。α1-酸性糖蛋白和ATP也均可通过商业途径获得。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们谨向所有曾为本实验室胶原蛋白纤维生成研究贡献时间和精力的历届本科、研究生及博士后学生致以诚挚的感谢。加拿大自然科学与工程研究理事会持续为我们的胶原蛋白研究提供了经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ⅰ型胶原单体 (约 3 mg/ml，溶于 0.01 N HCl) | Inamed Advanced Biomatrix | 5409 5005-B | 批号 1261443（2.9 mg/ml，pH 2.1） 批号 1629346（3.2 mg/ml，pH 2.1） 批号 6006（3.2 mg/ml，pH 2.1） |
| ATP | Research Biochemicals International | A-141 | 批号 FBJ-1194A |
| α1-酸性糖蛋白（来源于牛血浆） | Sigma-Aldrich | G3643 | 批号 051K7440（89.8%） 批号 011K7410（82%） 批号 065K7405（71.2%） 批号 063K7495（71.9%） 批号 117K7535（75.9%） （蛋白质 + 水含量） |
| 人血浆来源的 a1-酸性糖蛋白 | Sigma-Aldrich | G9885 | 批号 128H7606（70.9%） 批号 049K7565V（68%） （蛋白质 + 水含量） |
| 云母 | Ted Pella | 53 | |
| Pointprobe - 硅基 SPM 传感器 | Nanoworld | NHC | 用于间歇接触模式的硅基原子力显微镜探针 |
| Veeco Nanoprobe 探针 | Veeco （现为 Bruker AFM 探针） | NP-S | 用于接触模式的氮化硅原子力显微镜探针 |
参考文献
- Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. Collagen at a glance. J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).
- Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. Guide to Collagen Characterization for Bio Studies. J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).
- Baselt, D. R., Revel, J. -P., Baldeschwieler, J. D. Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy. Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).
- Petruska, J. A., Hodge, A. J. A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).
- Smith, J. W. Molecular Pattern in Native Collagen. Nature. 219, 157-158 (1968).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions. PNAS. 41, 1-7 (1955).
- Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy. Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).
- Wood, G. C., Keech, M. K. The formation of fibrils from collagen solutions. Biochem. J. 75, 588-597 (1960).
- Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen Fibril formation. J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).
- Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure. Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).
- Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).
- Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study. PNAS. 37, 286-291 (1951).
- Ghadially, F. N. Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , 3rd Edition, Butterworths. London. (1988).
- Paige, M. F., Goh, M. C. Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy. Micron. 74, 355-361 (2001).
- Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. A new particle type in certain connective tissue extracts. PNAS. 39, 459-470 (1953).
- Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis. PNAS. 76, 313-317 (1979).
- Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts. JACS. 72, 3321-3322 (1950).
- Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. O prokollagene kohzi. Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).
- Lin, A. C., Goh, M. C. Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy. Proteins. 49, 378-384 (2002).
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