本文介绍了一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。将自体软骨细胞接种于基质后进行植入，是目前广泛认可的关节软骨损伤修复与重建方法，可获得令人满意的长期疗效。基质辅助的自体软骨细胞移植（MACT）提供了一种标准化且已在临床广泛应用的植入技术。
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方法文章
基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
关节软骨缺损被认为是一个重要的健康问题，因为关节软骨的自我再生能力有限1。未经治疗的软骨损伤会导致持续性疼痛，对生活质量产生负面影响，并增加患骨关节炎的风险。在过去的几十年中，已开发出多种外科技术来治疗此类损伤。然而，迄今为止，尚无法实现完全修复，即无法以透明关节软骨覆盖缺损区域，也无法获得令人满意的长期功能恢复2-4。因此，关节软骨损伤仍然是组织工程等再生技术的主要目标。与其他常导致纤维组织或纤维软骨组织形成的外科技术不同，组织工程旨在利用移植细胞的软骨形成潜能，全面恢复原始关节软骨的复杂结构和功能特性。近年来的发展为软骨再生治疗带来了广阔的前景。
1994年，Lars Peterson 和 Mats Brittberg 首次开展了基于细胞的全层软骨或骨软骨缺损治疗方法，开创了临床自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI）技术5。如今，该技术已广泛应用于膝关节大面积透明软骨缺损的临床治疗，即使在移植后10至20年仍能保持良好的临床效果6。近年来，自体软骨细胞移植技术迅速发展，其中在人工三维胶原基质上进行细胞再移植的方法日益普及7-9。
MACT 包含两种外科手术步骤：首先，为了获取软骨细胞，需要从膝关节非负重区域的软骨处进行软骨活检；随后，从中提取、纯化软骨细胞，并扩增至足够的细胞数量 体外将软骨细胞接种至三维基质上，随后可重新植入体内。在制备组织工程化移植物时，细胞的增殖速率和分化能力对成功实现组织再生至关重要。 10使用三维基质作为细胞载体被认为有助于维持这些细胞特性 11.
以下方案将总结并演示一种从软骨活检组织中分离软骨细胞并促进其增殖的技术 体外 以及将其接种到三维基质上（Chondro-Gide，Geistlich Biomaterials，Wollhusen，瑞士）。最后，将描述将细胞-基质复合物植入兔膝关节人工软骨缺损的技术。该技术可作为软骨修复进一步实验的实验模型。
方案
A. 软骨活检（手术室；非无菌准备室中的步骤1-5）
- 对兔子（新西兰白兔，雌性，体重3.5–4.0 kg，6月龄）进行最终体重测定，以确保药物剂量的准确给药，并监测术后体重变化。
- 通过静脉注射 10 mg/kg 丙泊酚对兔进行麻醉诱导。
- 插管后，以静脉注射丙泊酚 1.5 mg/kg/min 和芬太尼 0.05 mg/kg 维持麻醉。通过二氧化碳图、脉搏血氧饱和度和脉率监测麻醉状态。
- 用电动剪毛器剃除待手术侧膝盖的毛发，并用吸尘器清理毛发。
- 彻底消毒剃毛后的膝关节，并用无菌敷料覆盖兔子的其余部位。
- 触诊髌骨，并在髌骨内侧做皮肤切口。
- 在无菌条件下，通过内侧髌旁关节切开术打开膝关节。尽量避免切断任何细小的浅表血管。
- 向外侧推移髌骨。
- 检查膝关节是否存在任何异常及肉眼可见的软骨病变。
- 用无菌手术刀小心地从股骨滑车处剥离出小块软骨（2-3 mm）图1).
- 立即将这些软骨活检组织放入含有完全培养基（DMEM + 10% 胎牛血清（FCS）+ 1% 青霉素/链霉素（Pen/Strep））的50 ml离心管中，以继续后续操作 体外 手术后立即进行培养。
- 清洁缺损并用无菌生理盐水冲洗。
- 将髌骨复位于滑车沟内。
- 逐层缝合伤口，使用单个纽扣缝线（4-0 Vicryl）和连续皮内缝线（4-0 Monocryl）。采用可吸收缝线材料。
- 最后，使用可透过水蒸气的喷雾敷料封闭伤口。
B. 体外 培养
- 手术后应尽快在无菌超净工作台中的组织培养罩内处理活检所得的软骨组织块。
- 用 PBS 将无菌收获的软骨洗涤 2 次，每次洗涤后在室温下以 500 × g 离心 3 分钟。
- 将软骨切成1 mm的碎片3转移至50 ml离心管中，加入10 ml胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和10 ml PBS，在摇床上消化30分钟
- 30分钟后，加入完全培养基终止胰蛋白酶消化。随后，在无血清培养基（DMEM + 1% 青霉素/链霉素）中加入胶原酶A（0.21 U/mg），继续振荡消化软骨组织12小时。
- 将所得溶液在室温下以170 × g离心3分钟。
- 将细胞沉淀重悬于5 ml完全培养基中。
- 将分离的软骨细胞接种到25 cm²培养瓶中2 在5 ml完全培养基中培养组织培养瓶，并置于37℃湿润的组织培养孵育箱中 °C，5% CO2.
- 将软骨细胞培养至80%密度。
- 用 PBS 洗涤细胞 2 次后，加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 处理 3 分钟，使细胞从培养瓶中脱落。软骨细胞脱落后，通过加入 10 μ完全培养基
- 将悬液在300 × g条件下离心（3分钟），并用完全培养基重悬沉淀。
- 组织培养瓶中的种子细胞（75 cm²）2）并以1:3的比例进行传代培养（∼5,000 个细胞/cm2每5th 第几天或细胞汇合度达到80%时
- 通过台盼蓝染色法测定细胞数量和存活率。
C. 基质的细胞接种
- 植入前，按照上述方法洗涤并重悬细胞。进行细胞计数，并转移 5 x 104 将细胞转入1.5 ml离心管中，室温下以500 × g离心5分钟。
- 将沉淀重悬于15 μl 完全培养基以充分饱和基质。
- 使用无菌活检打孔器将双层胶原支架切割至与滑车缺损完全匹配的尺寸。
- 将基质放入大小合适的组织培养皿中（例如 24孔板
- 将种子细胞接种至基质的多孔且具有细胞黏附性的表面，以防止细胞从基质迁移出去。
- 将接种细胞的基质置于培养箱中，无需添加额外的细胞培养基，孵育1小时，以确保软骨细胞完全贴壁。
- 然后，将细胞-基质-构建物放入培养容器中（例如 24孔板）中加入新鲜的完全培养基。即使细胞与基质黏附牢固，操作时也需小心避免将细胞从基质上冲洗下来。
- 现在，细胞-基质-构建物可被送至手术室进行再植入。
D. 基质辅助自体软骨细胞移植
- 进行髌旁关节切开术 对侧 膝关节，如上所述（A. 1-8）。
- 使用无菌气动骨钻（直径3.6 mm）在滑车沟内制备两个孤立的软骨缺损。
- 用无菌生理盐水清洗缺损并冲洗。
- 应注意切勿在任何时候开放骨髓腔。如有必要，可使用电灼法封闭缺损底部以防止出血。
- 将接种了培养软骨细胞的支架材料植入，多孔面朝下（图2然后压入钻孔，并冲洗周围表面。
- 用少量纤维蛋白胶（Tissucol Duo S）封闭植入的基质，以确保固定牢固。
- 凝固后，将髌骨复位至滑车沟内，并对膝关节进行数次全范围活动。
- 再次向外侧推移髌骨，检查是否存在任何不稳定固定的迹象或事件。基质必须保持稳定不动。
- 重新放置髌骨，并按上述方法逐层缝合伤口，最后进行喷雾敷料处理。
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结果
所述手术技术可成功分离自体软骨细胞并将其植入人工软骨缺损区域。实验结果显示，移植物与周围软骨组织实现了良好整合。
12 周后 体内，软骨缺损被修复组织填充，其表面均匀且完整，可降低剪切应力及对植入物的损伤（图4此外，未见植入物出现肥大或钙化现象。修复组织表现出坚硬且稳固的特性，与周围健康的软骨组织相似。这一点至关重要，因为若植入物的生物力学性能不足，可能导致邻近软骨承受额外负荷，从而增加早期退变的风险。同时，未发生移植物分层现象。术前将膜裁剪至与缺损相同大小，从而避免了植入物与周围软骨之间出现裂隙或裂口。
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讨论
本方案提供了一种已确立的9,12,13且易于重复的技术，用于分离自体软骨细胞，随后扩增并重新植入兔膝关节中人工制造的软骨缺损部位。利用自体软骨细胞对关节软骨损伤进行重塑与修复已在临床应用中取得令人满意的长期效果6。
第一代和第二代自体软骨细胞移植技术存在诸多主要问题，例如骨膜增生和钙化、移植物分层或供区并发症14。因此，研究人员开发了利用外源性可生物降解材料将软骨细胞递送至缺损部位的技术。三维培养系统在维持软骨细胞特性方面的积极作用已被反复证实，例如使用琼脂糖15、聚二氧杂环己酮和聚乳酸-羟基乙酸16、聚酯类如聚-L-乳酸（PLLA）和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)（PLGA）17、纤维蛋白12、透明质酸18、海藻酸盐19、胶原蛋白20或胶原基质9时。
本研究中使用的双层胶原膜Ch...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由德国研究基金会（DFG, HE 4578/3-1）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/设备名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| 胶原酶A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| 胎牛血清（FCS） | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| 丙泊酚 | Fresenius Kabi | ||
| 青霉素/链霉素 | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（1X） | Biochrom AG | L1815 | |
| 乙醇（70%） | Merck KgaA | 410230 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.25%/0.02% | Biochrom AG | L2163 | 溶于不含 Ca2+、Mg2+的PBS中 |
| 芬太尼 | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| 氯化钠溶液（0.9%） | Bbraun | 8333A193 | |
| 组织培养皿 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | 生长面积 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| 组织培养瓶 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2，75 mm2 |
| 离心管（50 ml） | TPP AG | 91050 | γ射线灭菌 |
| 血细胞计数板 | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| 台盼蓝溶液 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| 喷雾敷料（OpSite） | Smith&Nephew | 66004978 | 允许水蒸气透过 |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| 活检打孔器 | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
参考文献
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