基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

摘要

本文介绍了一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。将自体软骨细胞接种于基质后进行植入，是目前广泛认可的关节软骨损伤修复与重建方法，可获得令人满意的长期疗效。基质辅助的自体软骨细胞移植（MACT）提供了一种标准化且已在临床广泛应用的植入技术。

摘要

关节软骨缺损被认为是一个重要的健康问题，因为关节软骨的自我再生能力有限¹。未经治疗的软骨损伤会导致持续性疼痛，对生活质量产生负面影响，并增加患骨关节炎的风险。在过去的几十年中，已开发出多种外科技术来治疗此类损伤。然而，迄今为止，尚无法实现完全修复，即无法以透明关节软骨覆盖缺损区域，也无法获得令人满意的长期功能恢复^2-4。因此，关节软骨损伤仍然是组织工程等再生技术的主要目标。与其他常导致纤维组织或纤维软骨组织形成的外科技术不同，组织工程旨在利用移植细胞的软骨形成潜能，全面恢复原始关节软骨的复杂结构和功能特性。近年来的发展为软骨再生治疗带来了广阔的前景。

1994年，Lars Peterson 和 Mats Brittberg 首次开展了基于细胞的全层软骨或骨软骨缺损治疗方法，开创了临床自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI）技术⁵。如今，该技术已广泛应用于膝关节大面积透明软骨缺损的临床治疗，即使在移植后10至20年仍能保持良好的临床效果⁶。近年来，自体软骨细胞移植技术迅速发展，其中在人工三维胶原基质上进行细胞再移植的方法日益普及^7-9。

MACT 包含两种外科手术步骤：首先，为了获取软骨细胞，需要从膝关节非负重区域的软骨处进行软骨活检；随后，从中提取、纯化软骨细胞，并扩增至足够的细胞数量 体外将软骨细胞接种至三维基质上，随后可重新植入体内。在制备组织工程化移植物时，细胞的增殖速率和分化能力对成功实现组织再生至关重要。 ¹⁰使用三维基质作为细胞载体被认为有助于维持这些细胞特性 ¹¹.

以下方案将总结并演示一种从软骨活检组织中分离软骨细胞并促进其增殖的技术 体外 以及将其接种到三维基质上（Chondro-Gide，Geistlich Biomaterials，Wollhusen，瑞士）。最后，将描述将细胞-基质复合物植入兔膝关节人工软骨缺损的技术。该技术可作为软骨修复进一步实验的实验模型。

方案

A. 软骨活检（手术室；非无菌准备室中的步骤1-5）

1. 对兔子（新西兰白兔，雌性，体重3.5–4.0 kg，6月龄）进行最终体重测定，以确保药物剂量的准确给药，并监测术后体重变化。
2. 通过静脉注射 10 mg/kg 丙泊酚对兔进行麻醉诱导。
3. 插管后，以静脉注射丙泊酚 1.5 mg/kg/min 和芬太尼 0.05 mg/kg 维持麻醉。通过二氧化碳图、脉搏血氧饱和度和脉率监测麻醉状态。
4. 用电动剪毛器剃除待手术侧膝盖的毛发，并用吸尘器清理毛发。
5. 彻底消毒剃毛后的膝关节，并用无菌敷料覆盖兔子的其余部位。
6. 触诊髌骨，并在髌骨内侧做皮肤切口。
7. 在无菌条件下，通过内侧髌旁关节切开术打开膝关节。尽量避免切断任何细小的浅表血管。
8. 向外侧推移髌骨。
9. 检查膝关节是否存在任何异常及肉眼可见的软骨病变。
10. 用无菌手术刀小心地从股骨滑车处剥离出小块软骨（2-3 mm）图1).
11. 立即将这些软骨活检组织放入含有完全培养基（DMEM + 10% 胎牛血清（FCS）+ 1% 青霉素/链霉素（Pen/Strep））的50 ml离心管中，以继续后续操作 体外 手术后立即进行培养。
12. 清洁缺损并用无菌生理盐水冲洗。
13. 将髌骨复位于滑车沟内。
14. 逐层缝....

结果

所述手术技术可成功分离自体软骨细胞并将其植入人工软骨缺损区域。实验结果显示，移植物与周围软骨组织实现了良好整合。

12 周后 体内，软骨缺损被修复组织填充，其表面均匀且完整，可降低剪切应力及对植入物的损伤（图4此外，未见植入物出现肥大或钙化现象。修复组织表现出坚硬且稳固的特性，与周围健康的软骨组织相似。这一点至关重要，因为若植入物的生物力学性能不足，可能导致邻近软骨承受额外负荷，从而增加早期退变的风险。同时，未发生移植物分层现象。术前将膜裁剪至与缺损相同大小，从而避免了植入物与周围软骨之间出现裂隙或裂口。

.......

讨论

本方案提供了一种已确立的^9,12,13且易于重复的技术，用于分离自体软骨细胞，随后扩增并重新植入兔膝关节中人工制造的软骨缺损部位。利用自体软骨细胞对关节软骨损伤进行重塑与修复已在临床应用中取得令人满意的长期效果⁶。

第一代和第二代自体软骨细胞移植技术存在诸多主要问题，例如骨膜增生和钙化、移植物分层或供区并发症¹⁴。因此，研究人员开发了利用外源性可生物降解材料将软骨细胞递送至缺损部位的技术。三维培养系统在维持软骨细胞特性方面的积极作用已被反复证实，例如使用琼脂糖¹⁵、聚二氧杂环己酮和聚乳酸-羟基乙酸¹⁶、聚酯类如聚-L-乳酸（PLLA）和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)（PLGA）¹⁷、纤维蛋白¹²、透明质酸¹⁸、海藻酸盐¹⁹、胶原蛋白²⁰或胶原基质⁹时。

本研究中使用的双层胶原膜Ch.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备名称	公司	目录编号	备注
DMEM	Biochrom AG	F 0415
胶原酶A	Roche	10 103 586 001	0.21 U/mg
胎牛血清（FCS）	PAN Biotech GmbH	3702-P103009
丙泊酚	Fresenius Kabi
青霉素/链霉素	Biochrom AG	A 2213	10,000 U/ml/10,000 μg/ml
杜氏磷酸盐缓冲液（1X）	Biochrom AG	L1815
乙醇（70%）	Merck KgaA	410230
胰蛋白酶-EDTA 0.25%/0.02%	Biochrom AG	L2163	溶于不含 Ca2+、Mg2+的PBS中
芬太尼	Delta Select GmBH	1819340
氯化钠溶液（0.9%）	Bbraun	8333A193
组织培养皿 100 mm/150 mm	TPP AG	93100/93150	生长面积 60.1 mm2/147.8 mm2
组织培养瓶 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2，75 mm2
离心管（50 ml）	TPP AG	91050	γ射线灭菌
血细胞计数板	Brand GmbH+Co KG	717810	Neubauer
台盼蓝溶液 0.4%	Sigma-Aldrich	L8154
喷雾敷料（OpSite）	Smith&Nephew	66004978	允许水蒸气透过
Chondro-GideÒ	Geistlich Pharma AG	30915.5
活检打孔器	pfm medical ag	48351
Tissucol Duo S	Baxter	3419627	0.5 ml