介绍了一种用于治疗兔膝关节骨软骨缺损的实验技术。将同种异体间充质干细胞植入骨软骨缺损部位，为组织工程领域提供了有前景的发展方向。体外制备纤维蛋白-细胞凝块为细胞植入提供了一种标准化的方法。
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方法文章
通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损
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摘要
摘要
多年来，骨软骨关节缺损的治疗一直困扰着临床医生。近年来，人们对关节软骨与软骨下骨之间相互作用的理解不断深入，促使医学界更加重视整个骨软骨结构的修复。与单纯的软骨损伤相比，骨软骨缺损的再生过程更为复杂，对外科手术和治疗手段提出了更高的挑战。受损组织不仅包括表层的软骨，还涉及其下方的软骨下骨。对于较深的骨软骨损伤，例如发生于剥脱性骨软骨炎的情况，必须替换缺损的全层组织，才能恢复关节面的完整性1。合适的治疗方案必须同时考虑这两种组织——它们具有不同的内在愈合能力2。在过去几十年中，多种外科治疗方法相继出现，并已在临床实践中得到确立3-6。
自体或同种异体骨软骨移植包含关节软骨和软骨下骨，可实现整个骨软骨单元的替换。通过圆柱形骨软骨移植物填充缺损，旨在提供一个连续的、由透明软骨覆盖的表面3,7,8。该方法的缺点包括可用移植物数量有限、供区并发症（针对自体移植）以及表面不匹配；因此，该技术尤其不适用于大范围缺损的治疗。
组织工程领域的新方法为再生性骨软骨治疗开辟了广阔的前景。自体软骨细胞移植标志着针对全层软骨缺损治疗的首个基于细胞的生物学方法，目前在全球范围内已得到广泛应用，即使在移植后10至20年仍表现出良好的临床效果9,10。然而，迄今为止，该技术尚不适用于所有类型的缺损治疗，例如累及软骨下骨的深层缺损11。
三明治技术 将骨移植与组织工程领域的现有方法相结合5,6。这种结合似乎能够克服单纯使用骨软骨移植所存在的局限性。在将自体骨移植至软骨下缺损区域后，将接种了自体软骨细胞的膜缝合于其上方，有助于使移植物的形态与损伤部位相匹配。当然，先前的骨重建需要额外的手术时间，甚至常常需要另一次手术。此外，迄今为止，尚缺乏长期随访数据12。
在不额外进行骨移植的情况下，组织工程旨在通过移植细胞的软骨生成和成骨潜能，恢复天然关节软骨的复杂结构与特性。然而，实际情况中通常仅有软骨组织得到不同程度的再生。对于合并的骨软骨损伤，则需要特定的进一步治疗。为了实现骨软骨缺损多层结构的再生，接种自体或异体细胞的三维组织工程产品可能具备良好的再生能力11。
除了自体软骨细胞外，间充质干细胞（MSC）似乎是构建全层软骨组织的一种有吸引力的替代选择。在大量临床前的体外（in vitro）和体内（in vivo）研究中，间充质干细胞已展现出优异的组织再生潜力13,14。间充质干细胞在治疗骨软骨缺损方面的一个重要优势在于，它们具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能，因此有望实现缺损区域的多层结构再生。
近年来，已开发出多种具有骨软骨再生潜力的支架材料，并获得了令人鼓舞的初步研究结果1,15-18。此外，纤维蛋白胶作为细胞载体已成为实验性软骨修复中的首选技术之一，并已在多项动物研究19-21以及早期人体试验中成功应用22。
以下方案将演示一种从兔骨髓中分离间充质干细胞的实验技术，随后进行细胞培养扩增，并制备标准化的 体外-用于纤维蛋白-细胞凝块的模型。最后，将描述一种将预先构建的纤维蛋白-细胞凝块植入兔膝关节人工骨软骨缺损的技术。
方案
A. 供体兔的准备以分离间充质干细胞（手术室）
- 从4月龄、体重约3 kg的雄性新西兰白兔（NZW）中分离细胞。
- 通过静脉注射丙泊酚（10 mg/kg 体重）诱导麻醉，并通过静脉注射戊巴比妥钠（100 mg/kg 体重）实施安乐死。
- 使用电动剪刀剃除后肢、背部和腹部的毛发，并用吸尘器清理毛发。
- 用70%乙醇彻底消毒剃毛区域。
- 使用钝头镊子、锐利剪刀（或手术刀）和骨剪处理组织和韧带。
- 沿腿部和小腿的颅侧表面做切口。
- 通过锐性或钝性分离法翻起皮肤及皮下组织。
- 将肌肉和韧带从胫骨和股骨上分离。切口应尽量贴近骨骼，以实现干净的解剖。此时不要将股骨与胫骨分离。
- 切断髋关节，使股骨头与髋臼分离。
- 抬起胫股复合体。
- 用手术刀片刮除骨骼上残留的软组织，或用无菌布巾擦拭骨骼。此时股骨与胫骨仍保持连接。
- 切断髌骨，随后切断膝关节韧带，最终将骨骼完全分离。
- 用70%乙醇喷洒分离后的骨骼，晾干后将每根骨骼放入含有细胞培养基（DMEM + 1%青霉素/链霉素（Pen/Strep））的50 ml离心管中，以保持湿润。
- 现在转移至无菌细胞培养超净工作台中操作。
B. 从兔骨中冲洗MSC并扩增（细胞培养操作台）
- 使用无菌镊子从试管中取出骨骼，并将其放入150 mm培养皿中。
- 使用无菌锯切除两端骨端，并将骨段转移至新的150 mm培养皿中。
- 用培养基（DMEM）填充10 ml注射器，安装18号针头，并插入骨髓腔开口处。
- 然后用培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养皿中。之后，若可能，从另一端再次冲洗。如有必要，可进一步锯除骨端。若骨骼断裂，只需冲洗骨内部即可。
- 将细胞悬液吸入注射器中，并反复冲洗骨髓，直至悬液能自由通过骨髓腔，且不再出现骨髓凝块。
- 当所有骨骼的骨髓收集完毕后，通过18号针头反复推注，以打散骨髓团块：将带针头的注射器吸入液体后，强力推出至培养基中。
- 随后，将悬液通过细胞滤器过滤至50 ml离心管中。为防止细胞损失，用10 ml培养基洗涤培养皿2次，并同样进行过滤。
- 在室温下以500 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml培养基（DMEM + 1% 青霉素/链霉素）中。
- 使用Biocoll分离液将血细胞与外周血单个核细胞（PBMC）及间充质干细胞（MSC）分离。
- 在15 ml离心管中加入5 ml Biocoll分离液，小心地在其上方叠加5 ml细胞悬液，并在室温下以800 × g离心20分钟（不启用刹车）。
- 可能的结果见图1：红细胞密度高于Biocoll，因此沉降至管底，而PBMC和间充质干细胞则停留在界面处。
- 小心吸取界面层至15 ml离心管中，加入5 ml PBS洗涤。
- 按步骤22所述条件离心，重悬于5 ml PBS中，并重复洗涤2–3次。
- 然后在室温下以350 × g离心10分钟（启用刹车）。
- 重悬于10 ml培养基中，使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 以初始接种密度约5 × 106个细胞接种于150 mm培养皿中。
- 2–3天后，去除未贴壁细胞。可能需要先用PBS冲洗以清除细胞碎片。随后加入新鲜完全培养基（DMEM + 10% 胎牛血清（FCS）+ 1% 青霉素/链霉素）。
- 每3–4天更换培养基一次（图2）。
- 5–10天后，首次传代细胞。
C. 体外纤维蛋白凝块的制备 in vitro
- 在移植当天，用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理培养瓶/培养皿中的贴壁细胞3分钟，使其脱离；随后加入完全培养基以终止消化。
- 将细胞分装至50 ml离心管中，用PBS洗涤两次。
- 通过台盼蓝染色法测定细胞活力和数量。
- 加入50,000个细胞至微量离心管中，于室温下以500 × g离心5分钟收集细胞沉淀。根据需要，制备足够用于至少一个额外凝块的预混液。
- 将细胞沉淀重悬于17 μl PBS中，并取25 μl TISSUCOL-Kit中的纤维蛋白原组分与该17 μl MSC悬液混合。
- 取一个带有预钻孔（3×3.6 mm）的无菌培养板，孔位需与钻孔位置对应 体内 (图3).
- 首先，将4 μl凝血酶溶液（500 IU/ml）加入一个孔中，立即加入42 μl纤维蛋白原-细胞悬液，并在顶部再加入4 μl凝血酶溶液。不要混合悬液，以避免在移液枪头内发生凝结。最初，移液加入的50 μl纤维蛋白原-细胞悬液会因表面张力而突出于预钻孔的边缘，不会塌陷。然而，在完全凝固后（60分钟后），凝块会收缩并完全嵌入预钻孔中。
- 用钝头镊子小心移除血凝块，并放入含有PBS的微量离心管中。每只动物准备2份血凝块。
- 将血凝块送至手术室。
D. 在纤维蛋白凝块中植入同种异体间充质干细胞
- 通过静脉注射丙泊酚（10 mg/kg 体重）对兔（新西兰白兔，雄性，体重 3.5–4.0 kg，5–6 月龄）实施麻醉。
- 使用电动剃毛器剃除手术侧膝关节部位的毛发，并用吸尘器清除毛发。上述所有操作均在手术准备室中进行，以避免污染手术室的无菌环境。
- 气管插管后，持续静脉输注丙泊酚（1.5 mg/kg/min）和芬太尼（0.05 mg/kg/min）以维持麻醉。通过二氧化碳波形图、脉搏血氧饱和度和脉率监测麻醉深度。
- 彻底消毒已剃毛的膝关节区域，并用无菌敷料覆盖兔体其余部分。
- 触诊髌骨，并在髌骨内侧做皮肤切口。
- 在无菌条件下，通过髌骨内侧关节囊切开术打开膝关节。操作时应尽量避免切断任何细小的浅表血管。
- 将髌骨向外侧移位（图 4）。
- 检查膝关节是否存在合并的软骨损伤或关节异常后，使用带有止动装置的无菌气动骨钻（直径 3.6 mm），在滑车沟内制备两个骨软骨缺损（深 3 mm，8 字形）（图 5）。
- 清洗缺损区域，并用无菌生理盐水冲洗。
- 植入前，将 20 μl 纤维蛋白胶注入缺损处，并均匀分布于缺损底部。
- 随后将凝块压入 8 字形缺损中，实现紧密贴合。
- 凝血完成后，将髌骨复位至滑车沟内，并反复屈伸膝关节数次。
- 再次将髌骨向外侧移位，检查纤维蛋白原-细胞凝块是否仍处于原位。
- 再次复位髌骨，逐层缝合伤口，使用单个结节缝合（4-0 Vicryl）和连续皮内缝合（4-0 Monocryl）（均采用可吸收缝线材料）完成手术。
- 最后，使用允许水蒸气透过喷雾敷料封闭伤口。
- 术后护理期间，每日检查伤口，持续 7 天。术后镇痛给予卡洛芬 4 mg/kg 皮下注射，每 24 小时一次（共 4 天），以及布托啡诺 0.03 mg/kg 皮下注射，每 12 小时一次（共 2.5 天）。无需对膝关节进行固定（例如 敷料）。
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结果
所述手术技术可成功分离异体间充质干细胞并将其植入人工骨软骨缺损区域。实验设置实现了移植物与周围软骨的成功整合。
缺损处被修复组织填充，其生物力学特性和耐久性与周围软骨相似。纤维蛋白-细胞凝块已制备完成 体外 在无菌培养皿上预先钻好与骨软骨缺损相同尺寸的孔图3）。因此，植入的纤维蛋白凝块与周围软骨之间无裂隙，而裂隙是导致过早退变或分层的危险因素（图6）。通过穿透软骨下骨，确保了修复组织的基底愈合，从而抵抗剪切力。另一个重要方面是修复组织的刚度，其应与周围健康的软骨组织相匹配，以避免对周围组织造成额外负荷及可能的过早退变。在我们的初步实验中（数据未显示），我们发现术后12周已可达到足够的刚性。此外，移植组织表面完整且均一，有助于降低剪切应力及可能的移植物损伤。图6).
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讨论
近年来，利用组织工程技术治疗复杂的关节骨软骨缺损——例如由剥脱性骨软骨炎、骨坏死和创伤引起的缺损——变得越来越具有吸引力。在上述病理情况下，组织损伤累及软骨下骨，并涉及两种具有不同内在愈合能力的组织1。目前对软骨下骨在骨软骨关节损伤致病过程中的作用日益受到关注11,23。关节软骨的功能状态与其下方支撑骨密切相关。任一组织的损伤都会对整个关节的力学环境和稳态平衡产生不利影响24。骨软骨单元的改变，如关节运动的机械性破坏、游离体形成、受累区域的机械磨损以及对侧关节面的磨耗，可能导致骨关节炎更早发生和发展1,11。因此，为了增强与周围宿主组织的有效整合，针对骨软骨缺损的组织工程修复策略应同时实现对下方软骨下骨的充分重建2。间充质干细胞似乎是满足骨软骨修复特定需求的理想细胞来源。本方案重点在于通过促进移植的间充质干细胞向成骨和软骨细胞谱系的选择性分化，从而推动骨与软骨组织的再生修复。
与软骨细胞相比，间充质干细胞具有多项主要优势：它们可轻松从骨髓、滑膜和脂肪组织中分离获得，且不会...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由德国研究联合会（资助号 HE 4578/3-1）资助，并由欧盟第七框架计划项目“GAMBA”（NMP3-SL-2010-245993）提供部分资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| 胎牛血清（FCS） | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| 丙泊酚（Propofol） | Fresenius Kabi | ||
| 青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin） | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 单位/10 μg/μl，溶于 0.9% NaCl |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS Dulbecco，1×） | Biochrom AG | L1815 | |
| 乙醇（70%） | Merck KGaA | 410230 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll 分离液 | Biochrom AG | L6115 | 等渗溶液，密度：1.077 g/ml |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| 芬太尼（Fentanyl） | DeltaSelect GmbH | 1819340 | |
| 氯化钠溶液（0.9%） | BBraun | 8333A193 | |
| 注射器（Injekt） | BBraun | 4606108V | |
| 针头（Sterican） | BBraun | 4657519 | |
| 镊子（钝头/锐头） | Aesculap | ||
| 剪刀 | Aesculap | ||
| 手术刀 | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| 科研用移液器 | Eppendorf | ||
| 骨剪 | Aesculap | ||
| 组织培养皿（100 mm/150 mm） | TPP AG | 93100/93150 | 生长面积：60.1 mm2/147.8 mm2 |
| 组织培养瓶（25/75 mm2） | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2，75 mm2 |
| 离心管（50 ml） | TPP AG | 91050 | γ射线灭菌 |
| CO2 培养箱 | Forma Scientific Inc. | ||
| 细胞培养超净工作台 Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| 无菌锯 | Aesculap | ||
| 离心机 Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| 血细胞计数板 | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer 型 |
| 气动骨钻 | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| 缝线（4-0 Monocryl，4-0 Vicryl） | Ethicon | ||
| 喷雾敷料（OpSite） | Smith&Nephew | 66004978 | 允许水蒸气透过 |
参考文献
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