我们介绍一种利用培养皿和培养基固定植物子叶的方法，以便在数天的发育过程中对表皮进行共聚焦成像，记录气孔分化过程。通过荧光蛋白标记，可动态追踪蛋白的表达及其亚细胞定位，从而加深对其在细胞分裂和细胞类型分化过程中可能作用的理解。
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本文内容
摘要
摘要
成像 体内 在发育序列过程中研究细胞行为的动态变化，是理解组织模式形成机制的一种有力技术。在动物发育过程中，关键的细胞增殖和模式形成事件发生得非常迅速。例如，在 秀丽隐杆线虫 受精后六小时内完成幼虫体轴构建所需的所有细胞分裂，共经历七次有丝分裂周期1；十六次或更多的有丝分裂 果蝇 胚胎发生发生在24小时以内2相比之下，植物发育过程中的细胞分裂较为缓慢，通常需要一天左右的时间 3,4,5 这为记录植物器官发生过程中细胞分裂和分化动态行为带来了独特的挑战，需要进行长期活体成像。 拟南芥 表皮是研究植物信号传导、细胞命运决定和发育过程的优良模型系统。在子叶中，该组织由抗空气和抗水分的铺面细胞构成，其间均匀分布着气孔，气孔作为可开闭的阀门，调控气体交换和水分流失。气孔的合理间距对其功能至关重要，其发育经历一系列不对称分裂和细胞分化步骤，最终形成有序的表皮结构。图1).
该方案允许在数天的发育过程中对表皮中的细胞和蛋白质进行观察。这一时间范围可实现对干细胞分裂及表皮细胞分化（包括气孔和表皮铺地细胞）的精确记录。可通过将荧光蛋白与目标蛋白融合，以评估其在细胞分裂和分化过程中的动态变化。该技术有助于我们理解一种新型蛋白POLAR的定位6气孔谱系细胞增殖阶段期间 拟南芥 子叶表皮中，该蛋白在不对称分裂事件前的细胞中表达，并在分裂发生前短暂地移向细胞皮层的特定区域。可利用公共领域软件对图像进行配准并生成简洁的视频，以可视化蛋白质动态定位及随时间变化的细胞类型。
方案
1. 种子灭菌
- 配制种子消毒液：33% 家用漂白剂，0.1% Triton X-100。
- 将携带目标荧光报告基因构建体及基因型的种子放入 1.7 ml 离心管中，加入 1 ml 消毒液。在摇床上孵育 15 分钟。
- 在无菌操作台中，使用移液器将消毒液从管中吸出，保留种子；加入 1 ml 无菌水进行清洗。重复清洗四次。
- 在 4 °C 下孵育两天或更长时间。
2. 培养皿培养基的制备
- 在200 ml的烧瓶中混合20 ml的0.5% Bacto琼脂溶液（非纯琼脂糖）与水，微波加热至完全溶解。煮沸时需小心操作。
- 将溶液冷却至约60 °C。
- 用移液器吸取1 ml琼脂溶液，缓慢滴加至腔室载玻片（Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System）内的盖玻片上。若溶液温度过高或添加过快，可能导致胶体熔化或玻璃破裂。
- 立即加入第二毫升琼脂溶液。此时琼脂培养基应完全覆盖载玻片腔室的底部。这种极简培养基足以维持植物子叶在四到五天内的发育，因其含有储存的营养物质，同时可保持湿度并允许气体扩散。
- 将载玻片置于实验台面上冷却，并用盖子覆盖腔室。若烧瓶密封良好，剩余溶液可保存并在后续使用时重新加热。
3. 种子解剖
- 从4 °C保存环境中取出无菌种子管。
- 将一张纸巾置于解剖显微镜载物台上，并用水润湿。调整纸巾使其表面平整。纸巾用于固定种子，便于解剖操作。
- 用移液器将20–30粒种子从管中转移至纸巾上，注意将其放置在解剖显微镜的视野范围内。
- 使用尖头镊子（Roboz，#5生物尖头）小心去除种子内部幼苗的种皮。必须去除外种皮和内种皮。
- 在对子叶进行成像时，建议同时去除下胚轴和胚根。子叶含有足够的营养物质，可在本实验方案下维持发育数天。若保留完整，下胚轴会显著伸长并变直，导致子叶移出延时成像的视野范围。使用解剖刀将子叶与下胚轴分离。
- 将解剖后的子叶浸没于水中，保存在微量离心管或其他类似容器中。
- 重复步骤3.4–3.6，直至获得所需数量的子叶。建议在装片前完成15–20个成功的解剖样本。
4. 将子叶装入载玻片腔室
- 使用小尺寸（18 mm2）盖玻片，切穿琼脂培养基，并将整个琼脂层从载玻片腔室的玻璃基底上轻轻抬起。
- 用移液管将保存管中带有少量水的子叶样本转移至腔室载玻片内，置于抬起的琼脂层下方。
- 轻柔地将琼脂层放回覆盖在子叶上。若存在多余水分，可用纸巾小心吸除，注意不要扰动子叶。封片完成后，样本不应再轻易移动。
- 盖上腔室盖片，将载玻片移至显微镜载物台上。
5. 时间序列成像
- 设置倒置共聚焦显微镜以成像所需的荧光团。LSM700 参数设置如下：GFP 采用 488 nm 激发，使用 440-530 nm 带通滤光片收集信号；RFP 采用 555 nm 激发，使用 570-610 nm 带通滤光片收集信号。
- 检查已封片的样品是否受损。将完整且正确安装的子叶位置编程输入显微镜软件。在 Zen 2009 中：使用 20 倍物镜对准一个子叶，并将物镜移至腔室载玻片中心。在采集模式下，将缩放设为 0.5，帧大小设为 48×48 像素。选中位置复选框，并点击位置下的扫描概览图像...按钮，然后将水平和垂直拼图数量增加至 30-35。扫描完成后，点击维度选项卡下的位置按钮，并在每个子叶处放置十字光标进行观察。
- 为所有样品设置涵盖子叶表皮的 z 序列。在 Zen 2009 中：点击Z-Stack复选框。在位置列表中选择每个位置，点击移至按钮。聚焦于子叶表皮最上层平面，并点击Z-Stack下的设为第一层按钮。然后聚焦至表皮仍可清晰可见的最底层平面，点击设为最后一层按钮。点击最优旁的按钮（显示最佳 z 层厚度）以确认设置。检查每个子叶，确保这些参数覆盖所有样品；注意在 Zen 2009 中无法为各个位置单独设置 z 参数。
- 按所需分辨率和时长设置时间序列。对于表皮细胞分裂中的蛋白质动态研究，连续三天、每 15-30 分钟采集一次图像效果良好。可根据需要调整该时间间隔。在 Zen 2009 中：点击时间序列复选框。在时间序列下，通过滑块或直接输入文本框的方式设置循环次数以确定所需图像数量。将间隔设为 30，并通过下拉菜单选择min（分钟）。
- 开始 xyzt 多位置扫描。请注意，扫描位置的数量必须受扫描参数限制；如果总扫描时间超过设定的时间间隔，则时间点将不准确。在本系统中，当以 30 分钟间隔、59 个 z 层同时成像 GFP 和 RFP 时，最多可支持六个位置同时扫描。在 Zen 2009 中：将帧大小调整至所需分辨率，然后点击开始实验。
6. 视频编辑
- 从共聚焦数据文件中，对每个时间点/位置组合生成最大强度Z轴投影，并以无损格式（如TIFF）导出为图像文件。文件名应按每个位置分别编号为一个序列例如，POLAR-GFP_pos1_0001、POLAR-GFP_pos1_0002 等（而非 POLAR-GFP_0001_pos1）命名文件，以便软件将其合并为视频。在 Zen 2009 中：使用 复制：子集 在……之下 处理 选项卡将位置拆分为单独的文件，然后 最大强度投影最后，导出为 TIFF 格式（文件：导出，全分辨率图像窗口 - 系列).
- 使用 FIJI7,8 通过运行 bUnwarpJ 宏来对齐连续图像9(插件：配准：bUnwarpJ）。将配准模式更改为单通道（Mono）。所有高级选项均可使用默认值。对于长时间延时序列，请下载并安装宏“Affine + Consistent Elastic 2D Image Registration”，该宏将自动对一系列图像应用 bUnwarpJ，并使用该宏打开您的数据 文件：导入：图像序列 以使用它。取消选中 MOPS 特征点提取 并运行。
- 使用 FIJI/ImageJ 或 Quicktime Pro 打开对齐后的图像序列，并以所需的视频格式保存（AVI 是一种较好的选择）。
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结果
通过该方法采集的一组具有信息意义的时间点如图3所示。细胞膜以RFP（pm-rb）标记，GFP在天然启动子驱动下与POLAR蛋白融合（POLAR::POLAR-GFP）6。在30分钟的时间尺度上，可观察到细胞分裂过程以及分裂前蛋白质定位的变化。气孔谱系中的不对称细胞分裂产生具有干细胞特性的气孔前体细胞，称为分生组织样细胞（meristemoids），其保留进一步进行不对称分裂的能力；同时产生其姐妹细胞，即气孔谱系基底细胞（SLGCs）。SLGCs不会发育为气孔前体细胞，通常会转分化为铺板细胞，但随着叶片扩展，也可能重新获得不对称分裂能力，从而产生另一个与初始分生组织样细胞相隔一定距离的新分生组织样细胞。所有这些细胞命运均反映在POLAR::POLAR-GFP的表达与定位中（图3，视频1）。
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讨论
这种延时共聚焦技术可实现对单个细胞中荧光标记蛋白表达及定位的长期研究 拟南芥 子叶表皮，对于POLAR及其他动态变化的蛋白质而言，这是正确理解其功能的关键。此前，持续的时间推移成像已被用于研究 拟南芥 根部真菌感染11 和分生组织生长5,12但添加子叶表皮可扩展该技术的适用性，使其可用于更多蛋白质的研究，尤其有助于气孔发育这一不断拓展的研究领域。
该方案的主要局限性在于目前仅限于子叶，而子叶含有其早期发育所需的营养物质。此外，由于凝胶培养基限制了气体交换，子叶的发育过程与在空气中发生的发育并不完全相同。扫描激光照射和室内光照足以支持光形态建成，诱导子叶展开和叶绿体成熟，但由于CO2浓度较低，气孔偶尔会成对发育。按照本方案所述，仅使用薄层培养基和最少的封片用水，可降低这种倾向。
荧光染料的选择对于该技术的成功也至关重要。绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）均表现良好，可用于双重标记以观察细胞边缘或评估蛋白质的共定位。定...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢Amanda Rychel在制定延时成像方案过程中提供的帮助，以及Lynn Pillitteri构建POLAR::POLAR-eGFP。我们还感谢ABRC提供pm-rb载体。本方案的开发得到了日本科学技术振兴机构（JST）PRESTO项目资助。对POLAR的研究还获得了华盛顿大学专利研究基金（RRF-4098）和美国国家科学基金会（MCB-0855659）的支持。KMP是美国国家科学基金会研究生研究学者（DGE-0718124），KUT是霍华德·休斯医学研究所GBMF项目研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌琼脂 | BD | 214010 | |
| 单室载玻片 | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | 或双室载玻片（155379） |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 软件 |
| 20倍物镜 | Zeiss | 420650-9901 | 数值孔径 0.8，平场复消色差物镜 |
| 解剖显微镜 | Benz (National) | 431TBL | 底部照明 |
| #5 镊子，生物尖头 | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | 极细的尖端至关重要 |
参考文献
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