使用Xenopus卵提取物研究DNA损伤检查点

摘要

Xenopus 卵提取物是研究DNA损伤检查点的一个有用模型系统。本方案介绍了Xenopus 卵提取物及DNA损伤检查点诱导试剂的制备方法。这些技术可适用于多种DNA损伤方法，用于研究DNA损伤检查点信号通路。

摘要

每天，细胞都会受到多种内源性和环境因素的损伤。为应对这些损伤，细胞在进化过程中形成了DNA损伤检查点信号通路，作为一种监控机制，用于识别DNA损伤并引导细胞对DNA损伤作出响应。在DNA损伤检查点信号通路中，包含几类蛋白质，分别称为感应蛋白（sensors）、转导蛋白（transducers）和效应蛋白（effectors）（图1）。在这一复杂的信号通路中，ATR（ATM和Rad3相关蛋白）是能够响应DNA损伤和复制应激的主要激酶之一。活化的ATR可磷酸化其下游底物，例如Chk1（检查点激酶1）。随后，被磷酸化并激活的Chk1会引发DNA损伤检查点的多种下游效应，包括细胞周期阻滞、转录激活、DNA损伤修复以及细胞凋亡或细胞衰老（图1）。当DNA受损时，若未能激活DNA损伤检查点，将导致损伤无法修复，进而引起基因组不稳定。对DNA损伤检查点的研究将有助于阐明细胞如何维持基因组完整性，并加深我们对癌症等人类疾病发生机制的理解。

Xenopus laevis 卵提取物正成为DNA损伤检查点研究中一种强大的无细胞提取模型系统。低速提取物（LSE）最初由Masui研究组描述¹。将去膜精子染色质加入LSE后，可形成细胞核，其中DNA在每个细胞周期中以半保留方式复制一次。

由DNA损伤或复制应激可激活ATR/Chk1介导的检查点信号通路²。目前有两种方法用于诱导DNA损伤检查点：DNA损伤诱导法和模拟DNA损伤结构法³。DNA损伤可通过紫外线（UV）照射、γ射线照射、甲基磺酸甲酯（MMS）、丝裂霉素C（MMC）、4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）或阿非迪霉素（aphidicolin）来诱导^3,4。MMS是一种烷化剂，可抑制DNA复制并激活ATR/Chk1介导的DNA损伤检查点^4-7。紫外线照射同样可触发依赖ATR/Chk1的DNA损伤检查点⁸。模拟DNA损伤结构AT70是由两条寡核苷酸poly-(dA)70和poly-(dT)70退火形成的复合物。AT70系统由Bill Dunphy实验室开发，现已被广泛用于诱导ATR/Chk1检查点信号通路^9-12。

本文描述了以下实验方案：（1）制备无细胞卵提取物（LSE）；（2）使用两种不同的DNA损伤方法（MMS和UV）处理Xenopus精子染色质；（3）制备模拟DNA损伤结构的AT70；以及（4）利用受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构在LSE中激活ATR/Chk1介导的DNA损伤检查点。

方案

1. LSE 样品制备

1. 对雌性非洲爪蟾（Xenopus laevis）进行两次注射以收集卵子。第一次注射（引 priming）为每只蛙皮下注射 100 U PMSG（孕马血清促性腺激素），使用 3 ml 注射器和 27 G 针头注入背侧淋巴囊。引 priming 至少需在诱导产卵前两天进行，引 priming 后的蛙可在两周内使用。
2. 为诱导产卵，对已引 priming 的蛙每只皮下注射 500 U hCG（人绒毛膜促性腺激素），使用 27 G 针头注入背侧淋巴囊。将注射后的蛙分别置于盛有 2 升 1×Marc's 改良林格液（MMR）的桶中孵育。让蛙在收集卵子前孵育 14–20 小时。
3. 将蛙从桶中移出，倒去 MMR 溶液，保留约 100 ml。通过将卵子转移至 250 ml 烧杯中收集卵子。
4. 通过加入 100 ml 2% 半胱氨酸溶液（用 10 M KOH 调节 pH 至 7.8）对卵子进行去胶膜处理。每隔约 30 秒，用倒置的玻璃巴氏移液管（直径 0.7 cm）轻轻搅动卵子。孵育过程中更换两次新鲜的半胱氨酸溶液。当卵子在烧杯底部形成更致密的一层时，去胶膜过程即完成，通常耗时约 5–15 分钟。
5. 弃去半胱氨酸溶液，用 0.25× MMR 洗涤卵子三次。用玻璃移液管在溶液中轻轻搅动卵子。“坏”卵可通过肉眼观察识别，外观呈蓬松白色。搅动后，“坏”卵会聚集在烧杯中央，用巴氏移液管将其移除。
6. 用卵裂解缓冲液（ELB）洗涤卵子三次。再次用巴氏移液管移除任何额外的“坏”卵。将卵子倒入 14 ml Falcon 管中。
7. 使用 CL2 IEC 临床台式离心机配备摆动桶转子，以 188 × g（1,100 rpm）离心 55 秒，使卵子压紧。吸除卵层上方多余的缓冲液。每毫升压紧的卵子中加入 0.5 μl 抑肽酶/亮抑蛋白酶素原液和 0.5 μl 细胞松弛素 B 原液。
8. 使用 Sorvall RC6 plus 超速离心机配备 HB6 摆动桶转子，在 4 °C 下以 16,500 × g（10,000 rpm）离心 15 分钟。离心后，卵子在管中分为三层：从上至下依次为脂质层、提取物层和卵黄/色素层。用 21 G 针头在 Falcon 管侧面中间提取物层的下部穿刺一个小孔。小心拔出穿刺针，以防塑料堵塞。将连接于 1 ml 注射器的新鲜 21 G 针头插入穿刺孔以收集提取物。缓慢吸取提取物，避免产生气泡或混入脂质层和卵黄/色素层。
9. 将提取物置于预冷的 1.5 ml 微量离心管中。每毫升卵提取物中加入以下化学原液至指定终浓度（括号内所示）：（1）环己酰亚胺 10 μl（100 μg/ml）；（2）抑肽酶/亮抑蛋白酶素各 1 μl（10 μg/ml）；（3）细胞松弛素 B 1 μl（5 μg/ml）；（4）二硫苏糖醇 1 μl（1 mM）；（5）诺考达唑 0.33 μl（3 μg/ml）。轻柔翻转混合卵提取物至少 10 次。此即为 LSE（卵提取物），必须新鲜配制并在 4 小时内使用。LSE 超过 4 小时或经历冻融后质量将下降。

2. 精子染色质的DNA损伤处理方法

1. 按照先前描述的方法制备正常精子染色质¹³。
2. 制备MMS处理的精子染色质
   1. 将正常精子染色质重悬于0.5 ml Buffer X中。
   2. 向500 μl重悬的染色质中加入约5.5 μl MMS（储存液浓度为9.1 M），使终浓度为100 mM。
   3. 将精子染色质置于微量离心管中，在室温下旋转孵育30分钟。
   4. 使用IEC CL2临床离心机配备摆动桶转子和管适配器，以686 × g（2,100 rpm）在室温下离心10分钟。
   5. 弃去上清液，并将沉淀重悬于0.5 ml含BSA（3%）、DTT（0.1 mM）和抑蛋白酶肽/亮抑蛋白酶肽（各10 μg/ml）的Buffer X中。
   6. 重复步骤（4）和（5）两次，以洗涤精子染色质。
   7. 使用血细胞计数板测定精子染色质浓度，并稀释至100,000 精子/μl。分装5 μl至-80 °C冰箱保存，以备后续使用。
3. 制备UV处理的精子染色质
   1. 将所需量（例如 10 μl）的正常精子染色质加至一片Parafilm表面。
   2. 将Parafilm放入紫外交联仪中。根据实验需求设定合适的能量参数，启动紫外线照射以损伤精子染色质。例如，达到1,000 J/m²约需21秒。
   3. 紫外照射后，应立即将UV处理的精子染色质加入卵提取物中。

3. DNA损伤模拟结构（AT70）的制备

1. 将两种合成寡核苷酸 poly-(dA)70（简称为 A70）和 poly-(dT)70（简称为 T70）分别溶于水中，配制成浓度为 2 μg/μl 的溶液。
2. 取 100 μl A70 和 100 μl T70 加入一个 1.5 ml 微量离心管中。将混合的合成寡核苷酸溶液置于加热块中，95 °C 煮沸 5 分钟。
3. 将加热块（连同含有 AT 混合物的离心管）取出，放置在实验台上自然冷却至室温。此温度下降过程约需 45–60 分钟。
4. 冷却后的混合物即为 AT70，终浓度为 2 μg/μl。将 10 μl AT70 分装后储存于 -20 °C 冰箱中以备后续使用。

4. 在LSE中利用受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构激活DNA损伤检查点

1. 使用受损精子染色质在 LSE 中诱导 DNA 损伤检查点
   1. 将 50 μl LSE 加入 1.5 ml 微量离心管中，并加入 1 μl 能量混合物和 2 μl 受损精子染色质（终浓度约为 4,000 精子/μl 反应体系）。
   2. 将反应管在室温下孵育 90 分钟，每 10 分钟轻弹混匀一次。
   3. 在孵育 30 分钟后，取 1 μl 反应混合物滴加到载玻片上，加入 1 μl 核染料溶液。盖上盖玻片，通过荧光显微镜观察细胞核形成情况。通常在孵育 30 分钟后可观察到圆形细胞核的形成，表明 DNA 复制已启动。
   4. 取 10 μl 反应混合物加入 90 μl 样品缓冲液中。样品通过免疫印迹分析，使用抗-Chk1 P-S344 或抗-Chk1 抗体检测。
2. 使用 AT70 在 LSE 中诱导 DNA 损伤检查点
   1. 将 50 μl LSE 加入 1.5 ml 微量离心管中，并加入 1 μl 能量混合物和 1.6 μl Tautomycin 储液。
   2. 向每个反应体系中加入 1.25 μl 预制的 AT70（2 μg/μl）或水（作为阴性对照）。在室温下孵育反应体系 90 分钟，每 10 分钟轻弹混匀一次。
   3. 将 10 μl 反应混合物加入 90 μl 样品缓冲液中。样品通过免疫印迹分析，使用抗-Chk1 P-S344 或抗-Chk1 抗体检测。

5. 代表性结果

受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构可在Xenopus卵提取物系统中触发由ATR/Chk1介导的DNA损伤检查点。图2A显示，MMS可诱导Chk1在Ser344位点的磷酸化（Chk1 P-S344），这是ATR激酶激活的标志。图2B显示，AT70作为一种模拟DNA损伤的结构，同样可触发Chk1的磷酸化。在这两个示例中，总Chk1样本均用作上样对照。

图1. DNA损伤检查点信号通路示意图。

图 2. 在 Xenopus 卵提取物中，MMS 或 AT70 处理均可诱导 Chk1 磷酸化。（A）将经 MMS 损伤的精子染色质（MMS）或正常精子染色质（Con）在卵提取物中孵育 90 分钟。通过免疫印迹检测卵提取物中 Ser344 位点的 Chk1 磷酸化（Chk1 P-S344）以及总 Chk1 的表达。（B）分别向卵提取物中加入 AT70 或水（Con）。样品也按照（A）中的方法进行免疫印迹分析。

讨论

利用非洲爪蟾（Xenopus）卵提取物研究DNA损伤检查点具有多个优势。使用卵提取物可获得大量处于细胞周期间期且同步化的无细胞提取物。卵提取物的制备方法简便且成本低廉。在从卵提取物中免疫耗竭目标蛋白后，可相对容易地对DNA或染色质造成损伤，并揭示DNA损伤检查点的缺陷。随后，通过回补野生型或突变型重组蛋白，可“挽救”潜在的功能缺陷。因此，非洲爪蟾（Xenopus）卵提取物是分析DNA损伤检查点结构与功能的一个强大模型系统。

LSE 的制备方法此前已有报道¹⁴，但我们的实验方案进行了一些改进。注射hCG后孵育青蛙的温度（18 °C）对产卵至关重要。有关青蛙处理与注射的更多资源可参考以往研究^13,14以及互联网资料，例如 tropicalis.berkeley.edu/home/obtaining_embryos/hcg/h...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
抗-Chk1 P-S344 抗体	Cell Signaling	2348L
抗-Chk1 抗体	Santa Cruz	SC7898
抑肽酶	MP Biomedicals	0219115880
放线菌酮	Sigma	C7698-5G
细胞松弛素 B	EMD	250233
二硫苏糖醇（DTT）	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-半胱氨酸	Sigma	C7352-1KG
亮抑蛋白酶肽	VWR	97063-922
甲基磺酸甲酯（MMS）	Sigma	129925-5G
诺考达唑	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
上样缓冲液	Sigma	S3401
梭链孢酸	Wako Chemicals USA	209-12041
设备
产卵桶	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC 离心机（带摆动转子）	Thermo Scientific	004260F
HB6 摆动转子	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus 超速离心机	Thermo Scientific	46910
紫外交联仪	UVP	95-0174-01
溶液
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.8
抑肽酶/亮抑蛋白酶肽储存液			各 10 mg/ml 溶于水。分装 20 μl，于 -80 °C 保存。
缓冲液 X			0.2 M 蔗糖，80 mM KCl，15 mM NaCl，5 mM MgCl2，1 mM EDTA，10 mM HEPES，用 HCl 调节 pH 至 7.5
放线菌酮储存液			10 mg/ml 溶于水。分装 1 ml，于 -20 °C 保存。
细胞松弛素 B 储存液			5 mg/ml 溶于 DMSO。分装 20 μl，于 -20 °C 保存。
二硫苏糖醇（DTT）储存液			1 M 溶于水。分装 1 ml，于 -20 °C 保存。
ELB			0.25 M 蔗糖，1 mM DTT，50 μg/ml 放线菌酮，2.5 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 7.7
诺考达唑储存液			10 mg/ml 溶于 DMSO。分装 5 μl，于 -80 °C 保存。
能量混合液			375 mM 磷酸肌酸，50 mM ATP，25 mM MgCl2。分装后于 -80 °C 保存。
细胞核染色液			0.4 μg/ml H–chst 33258，25% 甘油（v/v），溶于 1x PBS
梭链孢酸储存液			100 μM 溶于 DMSO。分装 10 μl，于 -80 °C 保存。