使用Xenopus卵提取物研究DNA损伤检查点

摘要

Xenopus 卵提取物是研究DNA损伤检查点的一个有用模型系统。本方案介绍了Xenopus 卵提取物及DNA损伤检查点诱导试剂的制备方法。这些技术可适用于多种DNA损伤方法，用于研究DNA损伤检查点信号通路。

摘要

每天，细胞都会受到多种内源性和环境因素的损伤。为应对这些损伤，细胞在进化过程中形成了DNA损伤检查点信号通路，作为一种监控机制，用于识别DNA损伤并引导细胞对DNA损伤作出响应。在DNA损伤检查点信号通路中，包含几类蛋白质，分别称为感应蛋白（sensors）、转导蛋白（transducers）和效应蛋白（effectors）（图1）。在这一复杂的信号通路中，ATR（ATM和Rad3相关蛋白）是能够响应DNA损伤和复制应激的主要激酶之一。活化的ATR可磷酸化其下游底物，例如Chk1（检查点激酶1）。随后，被磷酸化并激活的Chk1会引发DNA损伤检查点的多种下游效应，包括细胞周期阻滞、转录激活、DNA损伤修复以及细胞凋亡或细胞衰老（图1）。当DNA受损时，若未能激活DNA损伤检查点，将导致损伤无法修复，进而引起基因组不稳定。对DNA损伤检查点的研究将有助于阐明细胞如何维持基因组完整性，并加深我们对癌症等人类疾病发生机制的理解。

Xenopus laevis 卵提取物正成为DNA损伤检查点研究中一种强大的无细胞提取模型系统。低速提取物（LSE）最初由Masui研究组描述¹。将去膜精子染色质加入LSE后，可形成细胞核，其中DNA在每个细胞周期中以半保留方式复制一次。

由DNA损伤或复制应激可激活ATR/Chk1介导的检查点信号通路²。目前有两种方法用于诱导DNA损伤检查点：DNA损伤诱导法和模拟DNA损伤结构法³。DNA损伤可通过紫外线（UV）照射、γ射线照射、甲基磺酸甲酯（MMS）、丝裂霉素C（MMC）、4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）或阿非迪霉素（aphidicolin）来诱导^3,4。MMS是一种烷化剂，可抑制DNA复制并激活ATR/Chk1介导的DNA损伤检查点^4-7。紫外线照射同样可触发依赖ATR/Chk1的DNA损伤检查点⁸。模拟DNA损伤结构AT70是由两条寡核苷酸poly-(dA)70和poly-(dT)70退火形成的复合物。AT70系统由Bill Dunphy实验室开发，现已被广泛用于诱导ATR/Chk1检查点信号通路^9-12。

本文描述了以下实验方案：（1）制备无细胞卵提取物（LSE）；（2）使用两种不同的DNA损伤方法（MMS和UV）处理Xenopus精子染色质；（3）制备模拟DNA损伤结构的AT70；以及（4）利用受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构在LSE中激活ATR/Chk1介导的DNA损伤检查点。

方案

1. LSE 样品制备

1. 对雌性非洲爪蟾（Xenopus laevis）进行两次注射以收集卵子。第一次注射（引 priming）为每只蛙皮下注射 100 U PMSG（孕马血清促性腺激素），使用 3 ml 注射器和 27 G 针头注入背侧淋巴囊。引 priming 至少需在诱导产卵前两天进行，引 priming 后的蛙可在两周内使用。
2. 为诱导产卵，对已引 priming 的蛙每只皮下注射 500 U hCG（人绒毛膜促性腺激素），使用 27 G 针头注入背侧淋巴囊。将注射后的蛙分别置于盛有 2 升 1×Marc's 改良林格液（MMR）的桶中孵育。让蛙在收集卵子前孵育 14–20 小时。
3. 将蛙从桶中移出，倒去 MMR 溶液，保留约 100 ml。通过将卵子转移至 250 ml 烧杯中收集卵子。
4. 通过加入 100 ml 2% 半胱氨酸溶液（用 10 M KOH 调节 pH 至 7.8）对卵子进行去胶膜处理。每隔约 30 秒，用倒置的玻璃巴氏移液管（直径 0.7 cm）轻轻搅动卵子。孵育过程中更换两次新鲜的半胱氨酸溶液。当卵子在烧杯底部形成更致密的一层时，去胶膜过程即完成，通常耗时约 5–15 分钟。
5. 弃去半胱氨酸溶液，用 0.25× MMR 洗涤卵子三次。用玻璃移液管在溶液中轻轻搅动卵子。“坏”卵可通过肉眼观察识别，外观呈蓬松白色。搅动后，“坏”卵会聚集在烧杯中央，用巴氏移液管将其移除。
6. 用卵裂....

讨论

利用非洲爪蟾（Xenopus）卵提取物研究DNA损伤检查点具有多个优势。使用卵提取物可获得大量处于细胞周期间期且同步化的无细胞提取物。卵提取物的制备方法简便且成本低廉。在从卵提取物中免疫耗竭目标蛋白后，可相对容易地对DNA或染色质造成损伤，并揭示DNA损伤检查点的缺陷。随后，通过回补野生型或突变型重组蛋白，可“挽救”潜在的功能缺陷。因此，非洲爪蟾（Xenopus）卵提取物是分析DNA损伤检查点结构与功能的一个强大模型系统。

LSE 的制备方法此前已有报道¹⁴，但我们的实验方案进行了一些改进。注射hCG后孵育青蛙的温度（18 °C）对产卵至关重要。有关青蛙处理与注射的更多资源可参考以往研究^13,14以及互联网资料，例如 tropicalis.berkeley.edu/home/obtaining_embryos/hcg/h.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
抗-Chk1 P-S344 抗体	Cell Signaling	2348L
抗-Chk1 抗体	Santa Cruz	SC7898
抑肽酶	MP Biomedicals	0219115880
放线菌酮	Sigma	C7698-5G
细胞松弛素 B	EMD	250233
二硫苏糖醇（DTT）	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-半胱氨酸	Sigma	C7352-1KG
亮抑蛋白酶肽	VWR	97063-922
甲基磺酸甲酯（MMS）	Sigma	129925-5G
诺考达唑	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
上样缓冲液	Sigma	S3401
梭链孢酸	Wako Chemicals USA	209-12041
设备
产卵桶	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC 离心机（带摆动转子）	Thermo Scientific	004260F
HB6 摆动转子	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus 超速离心机	Thermo Scientific	46910
紫外交联仪	UVP	95-0174-01
溶液
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.8
抑肽酶/亮抑蛋白酶肽储存液			各 10 mg/ml 溶于水。分装 20 μl，于 -80 °C 保存。
缓冲液 X			0.2 M 蔗糖，80 mM KCl，15 mM NaCl，5 mM MgCl2，1 mM EDTA，10 mM HEPES，用 HCl 调节 pH 至 7.5
放线菌酮储存液			10 mg/ml 溶于水。分装 1 ml，于 -20 °C 保存。
细胞松弛素 B 储存液			5 mg/ml 溶于 DMSO。分装 20 μl，于 -20 °C 保存。
二硫苏糖醇（DTT）储存液			1 M 溶于水。分装 1 ml，于 -20 °C 保存。
ELB			0.25 M 蔗糖，1 mM DTT，50 μg/ml 放线菌酮，2.5 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 7.7
诺考达唑储存液			10 mg/ml 溶于 DMSO。分装 5 μl，于 -80 °C 保存。
能量混合液			375 mM 磷酸肌酸，50 mM ATP，25 mM MgCl2。分装后于 -80 °C 保存。
细胞核染色液			0.4 μg/ml H–chst 33258，25% 甘油（v/v），溶于 1x PBS
梭链孢酸储存液			100 μM 溶于 DMSO。分装 10 μl，于 -80 °C 保存。