成像小鼠原代培养神经元中pHluorin标记受体插入质膜的过程

摘要

通过将膜受体的胞外结构域与超 ecliptic pHluorin 进行标记，并在培养的小鼠神经元中对这些融合受体进行成像，我们可以直接观察受体插入质膜的单个囊泡事件。该技术将有助于阐明调控受体插入质膜的分子机制。

摘要

要更好地理解受体在质膜（PM）与细胞内区室之间转运的调控机制，需要采用具有优异空间和时间分辨率的实验方法。此外，该方法还必须能够区分定位于质膜上的受体与位于细胞内区室中的受体。尤为重要的是，由于单个囊泡仅携带少量受体，因此在单个囊泡中检测受体需要极高的检测灵敏度。目前研究受体转运的常规方法包括细胞表面生物素化后进行生化检测，但该方法缺乏必要的空间和时间分辨率；另一种方法是通过荧光显微镜观察免疫标记的细胞表面受体，但该方法需要对细胞进行化学固定，因而无法提供足够的时间分辨率^1-6。为了克服这些局限性，我们及其他研究者开发并采用了一种新策略，能够以优异的空间和时间分辨率可视化受体动态插入质膜的过程^7-17。该策略包括将一种pH敏感型绿色荧光蛋白——超灵敏pHluorin¹⁸，标记至受体的N端胞外结构域。超灵敏pHluorin具有独特的性质：在中性pH下具有荧光，而在酸性pH（pH < 6.0）下无荧光。因此，当标记的受体位于细胞内转运囊泡或早期内体区室的酸性腔内时，不产生荧光信号；只有当其暴露于细胞外中性pH环境，即到达质膜外表面时，才可被清晰地观察到。这一策略使我们能够有效区分质膜表面的受体与细胞内转运囊泡中的受体。为了获得足够的空间和时间分辨率，以及研究受体动态转运所需的灵敏度，我们采用了全内反射荧光显微镜（TIRFM），该技术使我们实现了光学成像的最佳空间分辨率（约170 nm）、视频速率显微镜的时间分辨率（30帧/秒），以及单个GFP分子荧光信号的检测灵敏度。通过在TIRFM下对pHluorin标记的受体进行成像，我们能够在培养的神经元中直接观察到单个受体插入质膜的过程。该成像方法原则上可应用于任何具有胞外结构域并可用超灵敏pHluorin标记的膜蛋白，有助于深入解析不同类型膜蛋白（如受体、离子通道、转运蛋白等）插入质膜的关键分子机制。

方案

1. 为神经元培养条件化制备小鼠胶质细胞培养物

1. 将 T75 培养瓶用胶原蛋白溶液（Purecol 以 ddH₂O 按 1:3 比例稀释）包被。将培养瓶直立放置，在组织培养超净台中过夜晾干。
2. 制备灌注缓冲液（aCSF：119 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl₂、30 mM 右旋葡萄糖、25 mM HEPES，pH 7.4，不含钙离子）和胶质细胞培养基（DMEM 添加 10% FBS、10 单位/ml 青霉素、10 μg/ml 链霉素及 Glutamax），并储存于 4 °C，待用。
3. 在制备胶质细胞培养物当天，将胶质细胞培养基在 37 °C 水浴中预热至少 30 分钟，随后进行小鼠脑组织的解剖。通过快速断头法处死胚胎期或新生期小鼠，并在解剖显微镜下分离大脑皮层组织。
4. 将分离的脑组织在木瓜蛋白酶溶液（2 ml 解剖缓冲液中含 100 ml 木瓜蛋白酶和 20 μl 1% DNase I）中于 37 °C 消化 20 分钟。
5. 木瓜蛋白酶消化后，用 10 ml 预热的胶质细胞培养基清洗脑组织。向消化后的脑组织中加入新鲜胶质细胞培养基（2 ml），并用火焰抛光的玻璃巴氏吸管吹打混悬。
6. 向解离后的组织中加入新鲜胶质细胞培养基（8 ml），使用 70 μm 细胞滤器过滤细胞悬液。然后将细胞接种至 T75 培养瓶中（通常 2–3 个胚胎可接种一个 T75 培养瓶）....

讨论

由于未知原因，小鼠神经元的培养通常比大鼠神经元更困难。根据我们的经验，将神经元与胶质细胞共培养对原代小鼠神经元的生长效果较好。然而，这种共培养体系不适用于全内反射荧光（TIRF）成像实验，因为在该体系中，神经元及其突起倾向于在胶质细胞上方生长，导致神经元胞体和树突过程超出TIRF显微镜的成像范围。因此，理想的TIRF成像条件是使用细胞密度较低、盖玻片上胶质细胞极少的神经元纯培养体系。我们首先测试了Banker方法^19;20，该方法先在培养皿底部接种胶质细胞，再将神经元接种于盖玻片上，然后将盖玻片倒置放入培养皿中。盖玻片与胶质细胞层之间通过盖玻片上的三个微小蜡滴隔开。该方法适用于较小尺寸的盖玻片（如15 mm或18 mm盖玻片），但当我们尝试使用25 mm盖玻片时，发现盖玻片中央区域的神经元状态不如边缘区域的神经元健康。

尽管我们尚不清楚神经元健康状况存在差异的具体原因，但我们推测这可能是由于营养物质向盖玻片中央区域扩散受限所致。因此，我们采用了本文所述的界面培养方法，因为培养插件的膜允许营养物质自由扩散至盖玻片上的神经元。我们将神经元接种在25 mm盖玻片上.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纯化牛胶原蛋白溶液（Purecol）	Advanced Biomatrix	5005-B
汉克平衡盐溶液（HBSS）	GIBCO, by Life Technologies	14185-045
青霉素-链霉素（Pen Strep）	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
丙酮酸钠	GIBCO, by Life Technologies	11360-070
DMEM高糖培养基	GIBCO, by Life Technologies	10313-021
胎牛血清（FBS）
GlutaMAX	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical Corp.	LS003126
牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNase I）	Sigma-Aldrich	DN25-10MG
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
0.05%胰蛋白酶	GIBCO, by Life Technologies	25300-054
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P2636-1G
硼酸	Fisher Scientific	BP 168-500
Neurobasal培养基	GIBCO, by Life Technologies	21103-049
B-27无血清添加剂	GIBCO, by Life Technologies	17504-044
热灭活马血清	GIBCO, by Life Technologies	26050-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668 019
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
细胞培养插件	EMD Millipore	PICM03050