通过将膜受体的胞外结构域与超 ecliptic pHluorin 进行标记，并在培养的小鼠神经元中对这些融合受体进行成像，我们可以直接观察受体插入质膜的单个囊泡事件。该技术将有助于阐明调控受体插入质膜的分子机制。
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摘要
摘要
要更好地理解受体在质膜（PM）与细胞内区室之间转运的调控机制，需要采用具有优异空间和时间分辨率的实验方法。此外，该方法还必须能够区分定位于质膜上的受体与位于细胞内区室中的受体。尤为重要的是，由于单个囊泡仅携带少量受体，因此在单个囊泡中检测受体需要极高的检测灵敏度。目前研究受体转运的常规方法包括细胞表面生物素化后进行生化检测，但该方法缺乏必要的空间和时间分辨率；另一种方法是通过荧光显微镜观察免疫标记的细胞表面受体，但该方法需要对细胞进行化学固定，因而无法提供足够的时间分辨率1-6。为了克服这些局限性，我们及其他研究者开发并采用了一种新策略，能够以优异的空间和时间分辨率可视化受体动态插入质膜的过程7-17。该策略包括将一种pH敏感型绿色荧光蛋白——超灵敏pHluorin18，标记至受体的N端胞外结构域。超灵敏pHluorin具有独特的性质：在中性pH下具有荧光，而在酸性pH（pH < 6.0）下无荧光。因此，当标记的受体位于细胞内转运囊泡或早期内体区室的酸性腔内时，不产生荧光信号；只有当其暴露于细胞外中性pH环境，即到达质膜外表面时，才可被清晰地观察到。这一策略使我们能够有效区分质膜表面的受体与细胞内转运囊泡中的受体。为了获得足够的空间和时间分辨率，以及研究受体动态转运所需的灵敏度，我们采用了全内反射荧光显微镜（TIRFM），该技术使我们实现了光学成像的最佳空间分辨率（约170 nm）、视频速率显微镜的时间分辨率（30帧/秒），以及单个GFP分子荧光信号的检测灵敏度。通过在TIRFM下对pHluorin标记的受体进行成像，我们能够在培养的神经元中直接观察到单个受体插入质膜的过程。该成像方法原则上可应用于任何具有胞外结构域并可用超灵敏pHluorin标记的膜蛋白，有助于深入解析不同类型膜蛋白（如受体、离子通道、转运蛋白等）插入质膜的关键分子机制。
方案
1. 为神经元培养条件化制备小鼠胶质细胞培养物
- 将 T75 培养瓶用胶原蛋白溶液（Purecol 以 ddH2O 按 1:3 比例稀释）包被。将培养瓶直立放置，在组织培养超净台中过夜晾干。
- 制备灌注缓冲液（aCSF：119 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、30 mM 右旋葡萄糖、25 mM HEPES，pH 7.4，不含钙离子）和胶质细胞培养基（DMEM 添加 10% FBS、10 单位/ml 青霉素、10 μg/ml 链霉素及 Glutamax），并储存于 4 °C，待用。
- 在制备胶质细胞培养物当天，将胶质细胞培养基在 37 °C 水浴中预热至少 30 分钟，随后进行小鼠脑组织的解剖。通过快速断头法处死胚胎期或新生期小鼠，并在解剖显微镜下分离大脑皮层组织。
- 将分离的脑组织在木瓜蛋白酶溶液（2 ml 解剖缓冲液中含 100 ml 木瓜蛋白酶和 20 μl 1% DNase I）中于 37 °C 消化 20 分钟。
- 木瓜蛋白酶消化后，用 10 ml 预热的胶质细胞培养基清洗脑组织。向消化后的脑组织中加入新鲜胶质细胞培养基（2 ml），并用火焰抛光的玻璃巴氏吸管吹打混悬。
- 向解离后的组织中加入新鲜胶质细胞培养基（8 ml），使用 70 μm 细胞滤器过滤细胞悬液。然后将细胞接种至 T75 培养瓶中（通常 2–3 个胚胎可接种一个 T75 培养瓶），并置于 37 °C 细胞培养箱中培养。
- 次日，吸除 T75 培养瓶中的培养基，用 10 ml PBS 清洗培养瓶，再向每个培养瓶中加入新鲜胶质细胞培养基（10–15 ml）。
- 10–12 天内，T75 培养瓶中的胶质细胞应达到融合状态。用 PBS 清洗胶质细胞，每瓶加入 5 ml 0.05% 胰蛋白酶溶液。
- 在 37 °C 胰蛋白酶消化 5 分钟后，胶质细胞解离，将每个 T75 培养瓶中的细胞分种至两个不同的胶原蛋白包被的 T75 培养瓶中。
- 将培养插件（Millipore PICM03050）放入 6 孔板中，包被胶原蛋白后过夜空气干燥。在每个培养插件下方加入胶质细胞培养基（每孔 2 ml）。
- 将融合状态 T75 培养瓶中的胶质细胞经胰蛋白酶消化后，接种至培养插件上（每个 6 孔板接种一个 T75 培养瓶的细胞，每插件 2 ml）。这些胶质细胞培养插件将用于神经元培养的条件培养基制备。
2. 神经元培养
- 用于神经元培养的玻璃盖玻片需在70% HNO3中浸泡至少过夜以进行清洗。随后用ddH2O至少清洗3次，并在Isotemp烘箱（>200 °C）中干燥过夜。
- 将清洗后的盖玻片放入6孔板中，每孔放置一片盖玻片。在37 °C培养箱中，用聚-L-赖氨酸溶液（2 ml，0.1%溶于100 mM硼酸，pH = 8.5）对盖玻片包被过夜。
- 移除聚-L-赖氨酸溶液，并用高压灭菌的ddH2O清洗盖玻片3次。随后在37 °C培养箱中，将盖玻片在铺板培养基（Neurobasal培养基添加5%热灭活马血清、10单位/ml青霉素、10 μg/ml链霉素、Glutamax；使用当天加入2% B27补充剂）中孵育过夜。
- 次日，移除铺板培养基，并向每孔含玻璃盖玻片的孔中加入2 ml新鲜含B-27的铺板培养基。
- 通过CO2处死孕鼠（E15-18），并通过断头法处死胚胎小鼠。从脑组织中分离海马或纹状体，并分别置于含有冰冻解剖缓冲液的15 ml圆锥管中，用于培养海马神经元或纹状体中型棘状神经元。
- 解剖所得脑组织按照步骤1.4）和1.5）所述方法用木瓜蛋白酶进行解离。
- 解离完成后，使用血细胞计数板对各神经元悬液中的细胞数量进行计数。随后以每孔0.4 × 106个细胞的密度将神经元接种至各盖玻片上，并在37 °C培养箱中培养过夜（此时神经元处于DIV 0阶段）。
- 为准备用于神经元培养条件化的胶质细胞培养插件，需移除胶质细胞培养插件中的胶质细胞培养基，并加入新鲜铺板培养基（插件内加入2 ml，插件下方也加入2 ml）。
- 次日（DIV 1），将带有神经元的盖玻片置于胶质细胞培养插件下方，每孔放置一片盖玻片。
- 每隔3-4天，用半量新鲜预热的喂养培养基（含B-27）对神经元进行换液，直至其可用于转染和成像实验。
3. 转染
- 使用 Lipofectamine 2000 进行神经元转染。每份神经元培养物（每张盖玻片一份培养物）使用 2 μl Lipofectamine 2000 和 1 μg DNA。采用无添加物的新鲜 Neurobasal 培养基稀释 Lipofectamine 和 DNA。
- DNA 与 Lipofectamine 混合后，在室温下孵育 20 分钟。
- 从每个胶质细胞培养插件下方保存 1 ml 培养基，同时从每个插件内部保存 1 ml 培养基，并将这些培养基转移至锥形管中。向所保存的培养基中加入等体积的喂养培养基 + B27，并在 37 °C 下孵育。该培养基用于转染后的神经元培养。
- 在 Lipofectamine/DNA 混合物室温孵育 20 分钟后，暂时将胶质细胞培养插件从 6 孔板中取出。将 200 μl Lipofectamine/DNA 混合物加至每张含神经元的盖玻片上，然后将胶质细胞培养插件放回各孔中，位于神经元上方。应避免培养插件膜下产生气泡。神经元在 37 °C 下与 Lipofectamine/DNA 混合物共孵育 2–4 小时。
- 在 2–4 小时孵育期结束后，再次移除胶质细胞插件。从各孔中移除含有 Lipofectamine/DNA 混合物的培养基。将步骤 3.3 中保存的培养基加入神经元培养物中（每孔 2 ml）。将胶质细胞培养插件放回各孔，移除各插件中的胶质细胞培养基，并向每个插件中加入 2 ml 步骤 3.3 中的培养基。
- 神经元继续培养额外 24–72 小时，以允许转染的 cDNA 表达，随后对这些神经元进行 TIRF 成像。
4. 全内反射荧光成像
- 活细胞成像实验将使用人工脑脊液（aCSF：119 mM NaCl、2.5 mM KCl、30 mM 葡萄糖、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、25 mM HEPES，pH = 7.4）。我们的全内反射荧光（TIRF）成像系统为自行搭建，采用100 mW的Cyan激光器作为激发光源，配备电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机作为探测器。
- 在成像实验开始前，将aCSF置于37 °C水浴中预热至少30分钟。将活细胞成像加热插件放置于显微镜载物台上，并在成像实验开始前至少30分钟开启加热插件、激光器和相机进行预热。
- 将载有转染神经元的盖玻片组装入活细胞成像腔室中。在完成腔室组装后，迅速加入预热的aCSF；此步骤应尽快完成。
- 将腔室置于显微镜载物台的加热插件上后，通过落射荧光成像模式在显微镜下目视识别转染的神经元。
- 在确认健康的转染神经元后（参见图1和图2），通常进行1分钟的光漂白，以消除质膜上已存在的pHluorin荧光。因为在TIRF成像初始阶段，质膜上的pHluorin受体荧光信号非常强，会干扰单个膜插入事件的观察。
- 光漂白完成后，将EMCCD相机的电子倍增增益设置为最大值，并以10 Hz的频率连续采集1分钟的图像。
- 每次记录包含600幅图像。使用ImageJ软件回放记录视频以识别单个插入事件，并通过ImageJ手动分析这些插入事件。
5. 代表性结果
稳定的神经元培养是成功进行活体成像实验的关键。图1展示了采用本实验方案培养的小鼠海马神经元，从体外培养第11天（DIV 11）至第18天（DIV 18）的形态。图像清晰显示，神经元已发育出丰富的突起，树突上密集分布着树突棘，表明这些神经元在培养中状态良好。本培养方案也可用于脑内其他类型的神经元。例如，我们近期在一项研究中采用该方案培养了小鼠纹状体中型棘状神经元，以检测多巴胺D2受体（DRD2）在这些培养神经元中的插入过程9。图2展示了采用本方案培养至体外第8天（DIV 8）的小鼠纹状体中型棘状神经元。我们已成功在此类神经元中进行全内反射荧光（TIRF）成像，用于观察超 ecliptic pHluorin 标记的DRD2受体。图3展示了pHluorin标记的DRD2（pH-DRD2）在中型棘状神经元中的表达，以及pH-DRD2在该神经元中插入过程的可视化结果。
图1. 采用界面培养法培养的小鼠海马神经元。DIV：体外培养天数（days in vitro），接种当天记为DIV 0。从图中可见，海马神经元在此类培养体系中于DIV 11至DIV 15之间逐渐成熟。在DIV 11和DIV 13时，神经元树突上布满丝状伪足和未成熟树突棘。在DIV 15和DIV 18时，神经元树突上出现大量较大的树突棘，提示神经元更为成熟。左侧面板：不同发育阶段小鼠海马神经元的低倍镜图像。右侧面板：高倍镜图像（对左侧面板中神经元树突区域的放大），显示不同发育阶段神经元树突及其树突棘的形态。
图 2. 采用界面培养法培养的小鼠纹状体中等棘状神经元培养物。图像中的神经元处于 DIV 8 阶段。
图 3. 转染了超椭圆型pHluorin标记的多巴胺D2受体（pH-DRD2）的小鼠纹状体中型棘状神经元。左侧图像为延时记录（600张图像，每张100毫秒）的最大强度投影。白色箭头指示单个囊泡插入pH-DRD2的过程。该图像在x-y维度上保留了插入信息，但丢失了时间信息。右侧图像显示y-t最大强度投影，其中将x-y-t图像堆栈绕y轴旋转90度，并将每条x轴线上的最大像素投影到单个y轴像素上。该图像在y-t轴向上保留了插入信息，但丢失了x轴信息。
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讨论
由于未知原因，小鼠神经元的培养通常比大鼠神经元更困难。根据我们的经验，将神经元与胶质细胞共培养对原代小鼠神经元的生长效果较好。然而，这种共培养体系不适用于全内反射荧光（TIRF）成像实验，因为在该体系中，神经元及其突起倾向于在胶质细胞上方生长，导致神经元胞体和树突过程超出TIRF显微镜的成像范围。因此，理想的TIRF成像条件是使用细胞密度较低、盖玻片上胶质细胞极少的神经元纯培养体系。我们首先测试了Banker方法19;20，该方法先在培养皿底部接种胶质细胞，再将神经元接种于盖玻片上，然后将盖玻片倒置放入培养皿中。盖玻片与胶质细胞层之间通过盖玻片上的三个微小蜡滴隔开。该方法适用于较小尺寸的盖玻片（如15 mm或18 mm盖玻片），但当我们尝试使用25 mm盖玻片时，发现盖玻片中央区域的神经元状态不如边缘区域的神经元健康。
尽管我们尚不清楚神经元健康状况存在差异的具体原因，但我们推测这可能是由于营养物质向盖玻片中央区域扩散受限所致。因此，我们采用了本文所述的界面培养方法，因为培养插件的膜允许营养物质自由扩散至盖玻片上的神经元。我们将神经元接种在25 mm盖玻片上...
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致谢
本工作由杰克逊实验室的启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 纯化牛胶原蛋白溶液（Purecol） | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS） | GIBCO, by Life Technologies | 14185-045 | |
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| 丙酮酸钠 | GIBCO, by Life Technologies | 11360-070 | |
| DMEM高糖培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 10313-021 | |
| 胎牛血清（FBS） | |||
| GlutaMAX | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNase I） | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05%胰蛋白酶 | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich | P2636-1G | |
| 硼酸 | Fisher Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27无血清添加剂 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| 热灭活马血清 | GIBCO, by Life Technologies | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| 细胞培养插件 | EMD Millipore | PICM03050 |
参考文献
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
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