海马区胰岛素微量注射及 在体内的 空间记忆测试期间的微透析技术

摘要

通过直接向海马内微量注射来调控依赖海马的空间工作记忆，并在清醒、行为正常动物中伴随和随后进行体内微透析以检测代谢物。

摘要

葡萄糖代谢是局部神经活动的一个有用指标，构成了2-脱氧葡萄糖法和功能磁共振成像等方法的基础。然而，在动物模型中使用这些方法需要麻醉，因而既会改变脑状态，又无法进行行为学测量。另一种替代方法是采用体内微透析技术，对清醒、无束缚动物脑细胞外液中的葡萄糖、乳酸及相关代谢物浓度进行连续测定。当该技术与依赖特定脑区和/或急性药物干预的任务相结合时尤为有用；例如，在空间工作记忆任务（自发交替）过程中对海马区的测量显示，细胞外葡萄糖水平下降而乳酸水平上升，提示糖酵解增强^1-3,4-5，而向海马内给予胰岛素既可改善记忆功能，又能增加海马区的糖酵解活动⁶。诸如胰岛素等物质可通过用于代谢物检测的同一微透析探针递送至海马。采用自发交替行为作为海马功能的评估指标，旨在避免应激性驱动因素（例如足底电击）、束缚或奖赏（例如食物）带来的干扰，因为这些因素均可能影响任务表现和代谢水平；该任务还可提供运动活动的测量指标，从而有助于控制治疗的非特异性效应。综合而言，这些方法能够直接测量调控行为的神经化学和代谢变量。

方案

1. 手术准备

1. 动物操作。实验动物（最常见的是大鼠或小鼠，尽管微透析技术及其与行为学测试结合的方法在不同物种间具有普遍适用性，仅需根据物种特性进行相应调整，e.g. 麻醉方式等）应在手术前至少连续两天、每天至少操作10分钟。充分的操作已被证明可使动物在测试时处于无应激状态，从而避免可能的干扰^4-5,7,8。本方案中将以大鼠作为示例物种。操作过程中必须避免因使用e.g. 乳胶或丁腈手套抓取毛发而引起动物应激：最理想的方式是使用裸手操作，但需事先征得动物设施兽医及职业健康管理人员的同意。若无法使用裸手，则应在屏障手套外加戴柔软棉质手套，以避免牵拉大鼠毛发。
2. 无菌区域准备。手术开始前，应准备好手术区域，在立体定位仪周围建立无菌区域，并在仪器上覆盖无菌手术单，同时覆盖用于维持大鼠体温的加热垫。使用带有精确温控装置的循环水垫，以防止动物体温过高。
3. 麻醉诱导。检查异氟烷挥发器中异氟烷含量是否处于最佳水平，并将其连接至诱导舱。检查各连接部位以确保形成密闭回路。检查通风排气系统是否正常运行。开启异氟烷挥发功能，将动物置于诱导舱内，使用5%异氟烷与氧气混合气体进行麻醉，即向100%氧气气流中加入5%异氟烷，并输送至诱导舱。
4. 固定于仪器。使用耳杆和门齿固定器将动物牢固固定于立体定位仪上。正确安装耳杆可使头部保持静止，双耳紧贴耳杆平面。迅速完成固定后，将动物鼻部插入专用麻醉面罩；将异氟烷输送从诱导舱切换至鼻罩，并....

结果

大鼠在停止麻醉后30分钟内应迅速恢复，表现为清醒、活动自如且行为活跃。如果手术操作规范且使用最少的牙科水泥，套管帽的影响应降至最低。在术后监测期间，若发现任何感染迹象，或大鼠表现出任何痛苦或不适的征象，应立即终止实验；这种情况应极为罕见。在测试前的抓取操作过程中，动物应表现清醒、自由活动、温顺且具有探索性。经过良好操作的大鼠，应基本无任何来自手术、术后恢复或实验人员存在所导致的可观察到的应激反应；如有需要，可通过检测血浆应激激素（肾上腺素、糖皮质激素）和/或血糖水平来确认^4-5,7,8。

脑细胞外液（ECF）葡萄糖浓度通常在 0.5 - 1.5 mM 范围内，不同脑区有所差异，尽管在糖尿病动物中可能观察到更高的数值；在海马区，基础葡萄糖浓度约为 1.25 mM^9,16。在未施加任何外源性处理的情况下，执行任务时，参与该任务调控的脑区应出现细胞外液葡萄糖浓度下降（通常伴随细胞外液乳酸浓度升高）的现象（例如见图1）：这反映了认知负荷所诱导的代谢活动增强^13,19,21。类似的变化也可作为.......

讨论

微透析实验中使用的所有溶液均应在使用前立即用0.2 μm滤器过滤。将探针插入导向套管后，应观察确认液体流动无阻碍且正在正常收集样品。若插入后液体停止流动，最可能的原因是插入时操作不当导致探针膜受损，此时必须更换新的探针。

如上所述，这些方法的一个关键优势在于不存在混杂因素，从而可以在清醒、自由活动的动物中同时进行行为学和神经化学测量：为了充分利用这一优势，测试前必须对动物进行充分的抓握训练，以确保其在测量期间处于无应激状态。平衡期通常足以建立稳定的代谢基线，但若需要确保各动物间血糖水平一致，可在测试前1-2小时移除食物。

微透析（mD）作为一种取样技术最主要的两个局限性是：（i）分析物的分子尺寸受限；（ii）分析物可能因在导管内壁黏附而造成损失。前者可在一定程度上通过使用具有更高分子量截留阈值的mD探针来缓解。典型的商用探针截留分子量最高可达100 kD，因此分子量在约50 kD以下的分子通常可较顺畅地通过；然而，为尽量减少探针尖端因超滤作用导致的样品损失，应尽可能使用较低截留分子量的膜。目标分子在导管内壁的黏附问题主要出.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大多数试剂为标准实验室级别，可从任意供应商处获取。同样，注射泵和管路等设备也可使用来自不同制造商的产品。本实验中使用的某些关键物品，其具体信息如下：
CMA 12 微透析探针	CMA/ Microdialysis	CMA-12-XXX	此类探针具有不同的膜长度和截留分子量，具体由“XXX”中的代码标明。
人胰岛素（Humulin）	Eli Lilly	N/a
液体旋转接头	Instech	375/D/22QM	该型号旋转接头具有极低的扭矩和内部体积，并带有惰性的石英内衬。