在致密组织中观察单个细胞（例如神经肌肉接头（NMJs）处的终末施万细胞（SCs））具有挑战性。“连续光漂白”技术可用于清晰界定单个终末施万细胞，例如在胸骨三角肌离体组织中，这是一种便捷的神经-肌肉制备模型，可在其中将连续漂白与延时成像以及事后免疫染色相结合。
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摘要
摘要
连续光漂白为在神经肌肉接头（NMJ）处标记单个施万细胞（SC）提供了一种非侵入性方法。神经肌肉接头是哺乳动物神经系统中最大的突触，长期以来作为研究突触结构与功能的指导性模型。在小鼠的神经肌肉接头中，运动轴突终末与肌纤维形成类似椒盐卷饼状的接触区域。运动轴突及其终末被施万细胞所包绕。在过去几十年中，已培育出多种转基因小鼠用于可视化运动神经元和施万细胞，例如分别用于标记运动神经元和施万细胞的Thy1-XFP1小鼠和Plp-GFP小鼠2。
在运动轴突上，形成髓鞘的施万细胞沿轴突呈非重叠的节段性排列，各节段之间由兰氏结分隔，以实现动作电位的跳跃式传导。相比之下，位于突触处的终末施万细胞则是一类特化的胶质细胞，能够监测并促进神经递质传递，清除细胞碎片，并引导再生轴突的生长。神经肌肉接头（NMJs）通常由多达六个非髓鞘化的终末施万细胞紧密覆盖——然而，由于这些细胞彼此之间膜结构直接接触，无法通过光学显微镜单独分辨3。
目前存在多种方法可用于单独观察终末端的施万细胞（SCs），但这些方法均存在缺陷。例如，染料填充法需要使用充满染料的微电极穿刺单个细胞，但在填充第二个细胞前必须破坏已标记的细胞，因此无法与后续的时间推移成像相兼容3。通过组合表达荧光蛋白，已实现施万细胞的多光谱“Brainbow”标记4。然而，该技术需联合使用多个转基因，并受限于所用启动子的表达模式。未来，在施万细胞中表达“光可切换”蛋白可能是另一种替代方案5。本文介绍了一种连续光漂白方法，即通过对单个细胞进行光漂白，并通过图像相减获得其轮廓图像。我们认为，该方法因其简便性和通用性，将成为神经科学研究技术工具中一项持久的补充，尤其适用于活体（in vivo）研究，并可推广至其他细胞类型、解剖部位或物种6。
在以下实验方案中，我们详细描述了在胸骨三角肌肌片标本的终末施万细胞（SCs）中应用连续漂白及随后的共聚焦时间序列显微镜成像的方法。这种薄而表浅、易于分离的神经-肌肉制备物7,8已被证明在神经肌肉接头（NMJ）的发育、生理学及病理学研究中具有重要价值9。最后，我们说明了胸骨三角肌在固定后如何制备，以进行关联性的高分辨率共聚焦成像、免疫组织化学或超微结构分析。
方案
1. 胸骨三角肌外植体（图1）
时间：15 分钟。
- 准备手术器械：两把镊子、一把剪刀、一把弹簧剪、一个组织培养皿（10 cm）。预先通气（至少15分钟）并冷却至4 °C的含5% CO的林格氏液2/ 95% O₂2将15 cm组织培养皿装满冰，并用金属板覆盖。准备好解剖显微镜，将装有冰的15 cm培养皿置于解剖显微镜下，以便在解剖过程中冷却组织块。
- 用过量异氟烷（或任何其他批准的处死方法）对小鼠实施致死性麻醉。用70%乙醇喷洒小鼠体表，以防止毛发污染外植体。对于SC漂白，我们使用了 Plp-GFP 小鼠，可与 Thy1-OFP3 或 Thy1-Membow13 用于轴突的同步可视化。
- 使用大剪刀，在胸骨上方的皮肤做一正中切口，并在肋缘下侧做两条与之平行的切口。
- 使用大剪刀剪除皮肤，切开腹壁，并沿肋骨平行方向一直切至脊柱。随后，在胸骨附近靠近胸肌止点处进行切割，剥离胸肌。
- 在剑突软骨下方切开膈肌，并沿其肋部附着处分离膈肌。
- 用镊子夹住剑突部位固定胸廓，从肋骨与脊柱连接处尽可能靠近其附着点开始剪断肋骨。左右两侧的剪切线应在心脏上方朝向胸骨柄会合。注意避免剪到主要血管（尤其是锁骨下静脉）。用镊子夹住剑突并轻轻提起标本，可获得更好的视野。
- 在胸骨柄下方稍作横向切口，将移植组织转移至含有冷却的5% CO的10 cm培养皿中2/ 95% O₂2-通入气体的任氏液。将10厘米培养皿置于覆盖在盛有冰的15厘米组织培养皿上的金属板上。所有后续步骤均应在解剖显微镜下进行。
- 使用小型弹簧剪去除胸腺残余、胸膜、膈肌（内部）以及胸大肌（外部）； 图1B-D).
- 为了将外植体适配至3.5 cm培养皿，需切除所有不与胸骨相连的肋骨。建议使用小型弹簧剪刀，从肋骨之间的组织处进行剪切。图1E).
- 用微型钉针（缩短至适当长度）将胸骨三角肌神经-肌肉外植体固定在涂有Sylgard的3.5 cm组织培养皿中 < 4 mm 图1G）。应将两枚针插入胸骨的软骨（白色）部分。在离体组织左右两侧的肋骨上各插入至少两枚针，针应穿过较柔软的软骨部分，并避开三角肌下方或附近的肋骨。使用的针数越多越好（通常使用8-10枚）。固定标本时，应确保肋骨适度展开，使肌肉处于轻微拉伸的状态。
- 可选： 通过加入与Alexa染料偶联的α-银环蛇毒素（浓度为0.8 μg/ml，溶于5% CO₂）来可视化含有乙酰胆碱受体的突触位点2/ 95% O₂2-通入气体的任氏液）。将固定好的外植块置于涂有Sylgard的培养皿中，在室温下孵育15–20分钟，随后用5% CO反复洗涤数次2/ 95% O₂2通入气泡的任氏液。
2. 漂白 SCs 及可选的时间序列显微镜观察（图 2）
时间：30 - 45 分钟，另可选 1 - 5 小时用于延时成像。
- 将3.5 cm涂有Sylgard的培养皿转移至配备氩离子激光器（488 nm波长）和水浸物镜（4x，0.13 NA；20x，0.5 NA 和 100x，1.0 NA 或 60x，0.9 NA）的共聚焦显微镜上。
- 时间序列显微成像可选步骤：将3.5 cm涂有Sylgard的培养皿插入加热环中，安装灌流系统和温度探针（图2A）。确保这些装置均不接触组织块、培养皿边缘或Sylgard涂层。将样品加热至33–35 °C。若仅进行光漂白而不进行时间序列成像，则室温更佳，因为细胞在漂白步骤之间动态性较低。
- 使用4x空气物镜观察胸骨三角肌的神经支配模式，并定位胸骨三角肌终板带。切换至20x浸水锥形物镜，开始在终板带内寻找表浅区域（覆盖肋骨的区域是较理想的选择）。更换为100x或60x浸水锥形物镜以检查单个神经肌肉接头（NMJ）。理想情况是选择一个被多个施万细胞（SC）覆盖且位置非常表浅的NMJ（图2B）。若在漂白后进行时间序列成像，应选择最多3个彼此相对靠近的NMJ，以提高实验成功率。
- 在对单个SC进行光漂白前，获取该NMJ的共聚焦图像（图2B）。（对于全分辨率成像，例如在Olympus FV1000显微镜上，使用100x、1.0 NA物镜并设置2.5倍放大，可实现约每像素0.1 μm的奈奎斯特极限采样。）
- 使用最大功率将488 nm激光束中心对准SC细胞核，持续照射5秒（也可选用高效的扫描模式作用于小兴趣区域，例如Olympus显微镜上的“tornado scan”功能；由于使用的是共聚焦显微镜，激光聚焦于图像共轭平面，因此在488 nm波长下配合1.0 NA物镜，聚焦光斑直径< 0.5 μm）。重新对焦细胞并评估漂白效果。如有必要，重复漂白步骤，直至GFP信号降至接近背景水平。漂白后获取图像（图2C）。关键是要确保漂白区域不位于两个细胞的重叠区域内——若存在重叠，第二个细胞的漂白将显而易见。
- 重复上述步骤，直至除一个SC外其余所有SC均被漂白（图2D–E）。最后一个“未漂白”的SC适用于共聚焦时间序列显微成像。通过图像相减法重建单个细胞，例如使用Photoshop软件，以界定单个SC的形态及其占据区域（图2F）。需注意，两张图像相减会引入噪声（例如将图像依次导入Photoshop中的连续“图层”，然后将顶层通道在通道选项卡顶部的下拉菜单中设置为“difference”）。可通过在相减前对各通道使用“despeckle”功能，并裁剪掉明显不属于漂白细胞来源的背景区域来避免此问题。为优化对比度，可能需要在“levels”窗口中调节两个通道的亮度。将所得漂白细胞图像叠加至原始突触图像上，采用独特色调伪彩着色，并设为透明，以在原始图像中标注该漂白细胞的占据区域（对所有已漂白及最后一个未漂白细胞执行此操作后，即可得到如图2F所示图像）。
- 可选：在除一个SC外其余SC均完成漂白后，开始共聚焦时间序列显微成像。以固定时间间隔（例如每5至10分钟）采集图像。尽可能使用最低激光功率。同一实验过程中最多可同时成像3个NMJ。
- 通过在100x物镜下无放大拍摄图像，再使用20x和4x物镜拍摄该区域图像，制作时间序列NMJ的位置图（图2G–I）。该“位置图”用于在固定肌肉组织完成免疫组织化学染色后重新定位NMJ。
- 图像处理时，将各单独图像转换为最大强度投影，并保存为tiff格式。将所有z轴投影后的时间点合并为图像序列，并在xy方向上对齐，例如使用Fiji中的“stackreg”插件10（Fiji是基于开源软件ImageJ［美国国立卫生研究院］开发的软件包）。
3. 固定与免疫组织化学（图3）
时间：过夜。
- 将外植体小心取出固定针后转移至含有至少15 ml 4% PFA的50 ml反应管中。将包含胸骨三角肌的前胸壁在冰上后固定1小时。用含0.1 M甘氨酸的PBS冲洗固定组织至少10分钟（以淬灭残留固定剂，从而降低背景信号）。样品可在此阶段保存，并于后续进行处理。
- 将固定的外植体转移至一个盛有 0.01 M PBS 的 10 cm Sylgard 包被的组织培养皿中。剪取一个梯形区域，其中一侧与胸骨平行，另一侧穿过骨-软骨交界区——该区域表面包含三角肌。用水平切法去除下部肋骨即 经胸骨切口，以便充分暴露三角肌尾侧末端（图3A-D).
- 将皮下注射针头作为销钉插入斜方肌上部（图3E）。使用连接1 ml注射器的皮下注射针和镊子，轻轻夹住该肌肉尾侧一角，用针头作为微型手术刀去除表面的三角肌。确保切口与胸壁平面平行。当肌肉尾部被分离后，通过胸壁在肌肉下方插入另一根皮下注射针作为固定针，以固定标本，并可用镊子对肌肉施加轻柔牵拉力（图3F）。在切断结缔组织附着处时，用镊子将肌肉从胸壁“剥离”。用弹簧剪刀剪断最后一处尾端附着。用镊子清除脂肪和血管残余。注意避免撕裂神经。 注意： 对活体组织和固定组织的操作应使用不同的工具和器皿。
- 开始免疫组织化学实验（采用标准方案），将组织样本转移至封闭液中，在室温下于摇床上孵育1小时。使用96孔板进行染色时，最小染色体积为200 μl。
- 将一抗用封闭液按比例稀释后加入，每孔200 μl，4 °C摇床孵育过夜。
- 用 0.01 M PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 在封闭液中稀释适当的二抗，室温孵育1-2小时。
- 用0.01 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
- 用抗荧光淬灭剂封片例如 Vectashield）并加盖盖玻片。
- 将载玻片置于磁性金属板上，将磁铁置于样本上方，于4 °C下压平数小时或过夜。用指甲油封片。
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结果
用于成像的胸骨三角肌组织外植体示例见图1G。该外植体特别适用于在体外（ex vivo）对神经肌肉接头（NMJs）进行成像，因为胸骨三角肌仅由少数几层肌纤维构成。这使得可以从转基因小鼠品系（标记施万细胞（SCs）的Plp-GFP2和/或标记轴突的Thy1-XFP1）获取的外植体中获得高分辨率图像。高质量成像的关键因素包括：（i）在制备外植体过程中避免接触胸骨三角肌，以防肌纤维损伤；（ii）选择表浅且平坦的突触，以减少与深度相关的像差；（iii）避免样品过热（> 37 °C），并保持样品充分供氧；（iv）成像过程中可考虑暂停灌流，以减少漂移或振动；（v）小心放置灌流管和温度探针，避免接触样品，同时保持培养皿底部干燥，以防止漂移；（vi）在充分漂白与避免非靶向施万细胞的“附带”信号丢失之间取得平衡，以最大化对比度。若外植体受损或状态不佳，常可观察到肌肉抽搐和轴突断裂现象。制备不稳定会导致共聚焦图像堆栈的投影模糊。然而，一旦上述顺序性光漂白技术成功实施，即可清晰揭示单个终末施万细胞的形态细节（图2F...
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讨论
此处介绍的SC漂白方法简单、快速且用途广泛：（i）该方法仅需一个转基因即可通过共聚焦显微镜揭示单个SC的形态与动态，这在整合该技术与其他方法时具有显著优势 例如 使用需要额外等位基因的疾病模型。（ii）该方法快速，从解剖到固定可在半天内完成。（iii）应用范围广泛，可与其他方法结合使用，如细胞消融、细胞器成像、电生理学或免疫组织化学。此外，本文所述的小鼠神经肌肉接头施万细胞（SCs）研究方法可推广至其他细胞、组织或物种——参考文献6中展示了相关技术在斑马鱼中的一个应用实例。除GFP外，其他荧光蛋白也可用于漂白和延时显微成像，例如YFP或CFP。尽管我们尚未在施万细胞中使用这些荧光蛋白，但轴突的漂白实验表明，较不稳定的荧光蛋白（例如 在此条件下，使用CFP可能具有优势。然而，需根据预期结果在高效漂白与稳定成像之间找到平衡。例如 单张图像与未漂白细胞的延时成像对比。
该技术存在若干局限性。其一，由于使用了离体（因而轴突被切断）的肌肉，限制了成像时间。在以往的研究中我们发现——根据所研究问题的不同——胸骨三角肌离体标本最多可维持使用3...
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致谢
我们感谢 Manuela Budak、Ljiljana Marinković 和 Kristina Wullimann 提供出色的技术支持。感谢 W. Macklin 提供 Plp-GFP 小鼠。T.M. 的研究得到高等研究院（慕尼黑工业大学）、德国研究基金会（DFG；特别研究领域 SFB 596）、亚历山大·冯·洪堡基金会以及德国联邦教育与研究部在 ERA-Net NEURON 项目“iPSoALS”和“2-photon imaging”框架内的资助。T.M. 和 M.B. 得到慕尼黑整合蛋白质科学中心的支持。P.M. 得到慕尼黑工业大学研究生院（TUM-GS）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70%（体积/体积）乙醇溶液 | Roth | T913.1 | 在喷雾瓶中 |
| 异氟烷 | Forene, Abbott | 任何其他经批准的麻醉剂均可用于致死性麻醉 | |
| 转基因小鼠Plp-GFP | 从引用来源获取 | ||
| 配备冷光源照明的解剖显微镜 | Olympus SZ51 | 配备 Schott KL 1500 LCD | |
| 镊子 #2 | 精细科学工具 | 11233-20 | |
| 镊子 #5 | 精细科学工具 | 11295-00 | |
| 大号医用剪刀 | 精细科学工具 | 14108-09 | |
| 小角度弹簧剪 | 精细科学工具 | 15033-09 | |
| inline加热器 | Warner Instruments | SF-28 | |
| 3.5 厘米培养皿用加热环 | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| 双通道温度控制系统 | Warner Instruments | TC-344B | |
| 灌流泵系统 | 定制构建 | ||
| 15 cm 组织培养皿 | Sarstedt | 83.1803.003 | 装满冰并用金属板覆盖 |
| 10 cm 组织培养皿 | Sarstedt | 83.1802.003 | 用充氧的任氏液 |
| 3.5-cm 组织培养皿 | Sarstedt | 83.1800.003 | 填充了Sylgard聚合物 |
| Sylgard 聚合物 | 道康宁 | Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒 | |
| 共聚焦显微镜 | 奥林巴斯 | FV1000 | 使用氩离子激光器 |
| 50 ml 反应管 | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| PBS 中的 4% PFA | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| 1 ml 注射器 | Neolab | E-1496 | |
| 突触素抗体 | Invitrogen | 18-0130 | 兔 |
| 二抗 | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24孔板 | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| PBS 中的 0.1 M 甘氨酸 | Roth | 3790.1 | |
| 盖玻片 | Neolab | E-4132 | |
| 载玻片 | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| 微型固定针 ×10 | 精细科学工具 | 26002-20 | 缩短为 &小于 4 mm |
| α-与Alexa 594偶联的竹桃霉素 | Invitrogen（Molecular Probes） | B-13423 | |
| 封闭液 | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% 正常山羊血清 | Abcam | ab7481 | |
| 1% 牛血清白蛋白 | Sigma | A7030 | |
| 任氏液 用95% O₂饱和2 /5% CO₂2 | |||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO₃3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM 葡萄糖 | Sigma | G7528 | |
表1. 特异性试剂与仪器设备。 |
参考文献
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
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