通过连续光漂白法界定神经肌肉接头处单个施万细胞

摘要

在致密组织中观察单个细胞（例如神经肌肉接头（NMJs）处的终末施万细胞（SCs））具有挑战性。“连续光漂白”技术可用于清晰界定单个终末施万细胞，例如在胸骨三角肌离体组织中，这是一种便捷的神经-肌肉制备模型，可在其中将连续漂白与延时成像以及事后免疫染色相结合。

摘要

连续光漂白为在神经肌肉接头（NMJ）处标记单个施万细胞（SC）提供了一种非侵入性方法。神经肌肉接头是哺乳动物神经系统中最大的突触，长期以来作为研究突触结构与功能的指导性模型。在小鼠的神经肌肉接头中，运动轴突终末与肌纤维形成类似椒盐卷饼状的接触区域。运动轴突及其终末被施万细胞所包绕。在过去几十年中，已培育出多种转基因小鼠用于可视化运动神经元和施万细胞，例如分别用于标记运动神经元和施万细胞的Thy1-XFP¹小鼠和Plp-GFP小鼠²。

在运动轴突上，形成髓鞘的施万细胞沿轴突呈非重叠的节段性排列，各节段之间由兰氏结分隔，以实现动作电位的跳跃式传导。相比之下，位于突触处的终末施万细胞则是一类特化的胶质细胞，能够监测并促进神经递质传递，清除细胞碎片，并引导再生轴突的生长。神经肌肉接头（NMJs）通常由多达六个非髓鞘化的终末施万细胞紧密覆盖——然而，由于这些细胞彼此之间膜结构直接接触，无法通过光学显微镜单独分辨³。

目前存在多种方法可用于单独观察终末端的施万细胞（SCs），但这些方法均存在缺陷。例如，染料填充法需要使用充满染料的微电极穿刺单个细胞，但在填充第二个细胞前必须破坏已标记的细胞，因此无法与后续的时间推移成像相兼容³。通过组合表达荧光蛋白，已实现施万细胞的多光谱“Brainbow”标记⁴。然而，该技术需联合使用多个转基因，并受限于所用启动子的表达模式。未来，在施万细胞中表达“光可切换”蛋白可能是另一种替代方案⁵。本文介绍了一种连续光漂白方法，即通过对单个细胞进行光漂白，并通过图像相减获得其轮廓图像。我们认为，该方法因其简便性和通用性，将成为神经科学研究技术工具中一项持久的补充，尤其适用于活体（in vivo）研究，并可推广至其他细胞类型、解剖部位或物种⁶。

在以下实验方案中，我们详细描述了在胸骨三角肌肌片标本的终末施万细胞（SCs）中应用连续漂白及随后的共聚焦时间序列显微镜成像的方法。这种薄而表浅、易于分离的神经-肌肉制备物^7,8已被证明在神经肌肉接头（NMJ）的发育、生理学及病理学研究中具有重要价值⁹。最后，我们说明了胸骨三角肌在固定后如何制备，以进行关联性的高分辨率共聚焦成像、免疫组织化学或超微结构分析。

方案

1. 胸骨三角肌外植体（图1）

时间：15 分钟。

1. 准备手术器械：两把镊子、一把剪刀、一把弹簧剪、一个组织培养皿（10 cm）。预先通气（至少15分钟）并冷却至4 °C的含5% CO的林格氏液₂/ 95% O₂₂将15 cm组织培养皿装满冰，并用金属板覆盖。准备好解剖显微镜，将装有冰的15 cm培养皿置于解剖显微镜下，以便在解剖过程中冷却组织块。
2. 用过量异氟烷（或任何其他批准的处死方法）对小鼠实施致死性麻醉。用70%乙醇喷洒小鼠体表，以防止毛发污染外植体。对于SC漂白，我们使用了 Plp-GFP 小鼠，可与 Thy1-OFP3 或 Thy1-Membow13 用于轴突的同步可视化。
3. 使用大剪刀，在胸骨上方的皮肤做一正中切口，并在肋缘下侧做两条与之平行的切口。
4. 使用大剪刀剪除皮肤，切开腹壁，并沿肋骨平行方向一直切至脊柱。随后，在胸骨附近靠近胸肌止点处进行切割，剥离胸肌。
5. 在剑突软骨下方切开膈肌，并沿其肋部附着处分离膈肌。
6. 用镊子夹住剑突部位固定胸廓，从肋骨与脊柱连接处尽可能靠近其附着点开始剪断肋骨。左右两侧的剪切线应在心脏上方朝向胸骨柄会合。注意避免剪到主要血管（尤其是锁骨下静脉）。用镊子夹住剑突并轻轻提起标本，可获得更好的视野。
....

结果

用于成像的胸骨三角肌组织外植体示例见图1G。该外植体特别适用于在体外（ex vivo）对神经肌肉接头（NMJs）进行成像，因为胸骨三角肌仅由少数几层肌纤维构成。这使得可以从转基因小鼠品系（标记施万细胞（SCs）的Plp-GFP²和/或标记轴突的Thy1-XFP¹）获取的外植体中获得高分辨率图像。高质量成像的关键因素包括：（i）在制备外植体过程中避免接触胸骨三角肌，以防肌纤维损伤；（ii）选择表浅且平坦的突触，以减少与深度相关的像差；（iii）避免样品过热（> 37 °C），并保持样品充分供氧；（iv）成像过程中可考虑暂停灌流，以减少漂移或振动；（v）小心放置灌流管和温度探针，避免接触样品，同时保持培养皿底部干燥，以防止漂移；（vi）在充分漂白与避免非靶向施万细胞的“附带”信号丢失之间取得平衡，以最大化对比度。若外植体受损或状态不佳，常可观察到肌肉抽搐和轴突断裂现象。制备不稳定会导致共聚焦图像堆栈的投影模糊。然而，一旦上述顺序性光漂白技术成功实施，即可清晰揭示单个终末施万细胞的形态细节（图2F.......

讨论

此处介绍的SC漂白方法简单、快速且用途广泛：（i）该方法仅需一个转基因即可通过共聚焦显微镜揭示单个SC的形态与动态，这在整合该技术与其他方法时具有显著优势 例如 使用需要额外等位基因的疾病模型。（ii）该方法快速，从解剖到固定可在半天内完成。（iii）应用范围广泛，可与其他方法结合使用，如细胞消融、细胞器成像、电生理学或免疫组织化学。此外，本文所述的小鼠神经肌肉接头施万细胞（SCs）研究方法可推广至其他细胞、组织或物种——参考文献6中展示了相关技术在斑马鱼中的一个应用实例。除GFP外，其他荧光蛋白也可用于漂白和延时显微成像，例如YFP或CFP。尽管我们尚未在施万细胞中使用这些荧光蛋白，但轴突的漂白实验表明，较不稳定的荧光蛋白（例如 在此条件下，使用CFP可能具有优势。然而，需根据预期结果在高效漂白与稳定成像之间找到平衡。例如 单张图像与未漂白细胞的延时成像对比。

该技术存在若干局限性。其一，由于使用了离体（因而轴突被切断）的肌肉，限制了成像时间。在以往的研究中我们发现——根据所研究问题的不同——胸骨三角肌离体标本最多可维持使用3.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70%（体积/体积）乙醇溶液	Roth	T913.1	在喷雾瓶中
异氟烷	Forene, Abbott		任何其他经批准的麻醉剂均可用于致死性麻醉
转基因小鼠Plp-GFP			从引用来源获取
配备冷光源照明的解剖显微镜	Olympus SZ51		配备 Schott KL 1500 LCD
镊子 #2	精细科学工具	11233-20
镊子 #5	精细科学工具	11295-00
大号医用剪刀	精细科学工具	14108-09
小角度弹簧剪	精细科学工具	15033-09
inline加热器	Warner Instruments	SF-28
3.5 厘米培养皿用加热环	Warner Instruments	64-0110 DH-35
双通道温度控制系统	Warner Instruments	TC-344B
灌流泵系统			定制构建
15 cm 组织培养皿	Sarstedt	83.1803.003	装满冰并用金属板覆盖
10 cm 组织培养皿	Sarstedt	83.1802.003	用充氧的任氏液
3.5-cm 组织培养皿	Sarstedt	83.1800.003	填充了Sylgard聚合物
Sylgard 聚合物	道康宁	Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒
共聚焦显微镜	奥林巴斯	FV1000	使用氩离子激光器
50 ml 反应管	Sarstedt	62.547.254 PP
PBS 中的 4% PFA	Sigma	P6148
cannula 0.5 mm x 25 mm	Neolab	E-1510
1 ml 注射器	Neolab	E-1496
突触素抗体	Invitrogen	18-0130	兔
二抗	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
24孔板	Sarstedt	83.1836
0.01 M PBS	Sigma	P4417
PBS 中的 0.1 M 甘氨酸	Roth	3790.1
盖玻片	Neolab	E-4132
载玻片	Neolab	E-4121
Vectashield	Vector labs	H-1000
微型固定针 ×10	精细科学工具	26002-20	缩短为 &小于 4 mm
α-与Alexa 594偶联的竹桃霉素	Invitrogen（Molecular Probes）	B-13423
封闭液
0.01 M PBS
0.2% Triton-X100	Roth	3051.3
10% 正常山羊血清	Abcam	ab7481
1% 牛血清白蛋白	Sigma	A7030
任氏液 用95% O₂饱和2 /5% CO₂2
125 mM NaCl	Sigma	S7653
2.5 mM KCl	Sigma	P9333
1.25 mM NaH2PO4	Sigma	S8282
26 mM NaHCO₃3	Sigma	S6297
2 mM CaCl2	Sigma	21114
1 mM MgCl2	Sigma	63020
20 mM 葡萄糖	Sigma	G7528
表1. 特异性试剂与仪器设备。