使用胰蛋白酶传代HuES人类胚胎干细胞系

摘要

在本视频中，我们展示了实验室如何常规使用胰蛋白酶对HuES人类胚胎干细胞系进行传代。由JoVE为您提供。

摘要

在本视频中，我们展示了实验室如何常规使用胰蛋白酶对HuES人胚胎干细胞系进行传代。人胚胎干细胞是细胞培养的产物，随着群体倍增次数的增加，容易出现核型异常。正确的传代操作对于维持健康、未分化且核型正常的HuES人胚胎干细胞培养至关重要。首先，用PBS洗涤扩增中的细胞培养物，以去除残留的培养基和细胞碎片，然后加入少量预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。胰蛋白酶作用细胞时间最长不超过五分钟，随后用2 mL血清移液管轻柔吹打使细胞脱落。收集细胞悬液并与大量HuES培养基混合，通过轻柔离心收集细胞。弃去灭活的胰蛋白酶混合液，将细胞重悬于预热的HuES培养基中。根据需要计算合适的分种比例（通常为1:10至1:20），并将细胞重新接种至含有经辐照处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的1-2天龄培养皿中。新接种的HuES细胞培养板在48小时内不得扰动，之后每日更换培养基。需要注意的是，不应将细胞消化至单细胞悬液，因为这会增加核型异常的风险。 关键词：HuES细胞，人胚胎干细胞，胰蛋白酶消化，细胞传代，核型稳定性，小鼠胚胎成纤维细胞，饲养层细胞，细胞培养

方案

常规

建议每次只解冻一个样品，以确保操作简便。操作者应注意不要将细胞培养物长时间置于室温及低二氧化碳环境中。所有活细胞的离心步骤均在室温下以500-600 × g离心5分钟进行。

小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）

1. 将MEF培养基预热至37°C。从-80°C取出MEF冻存管，立即将管底一半浸入37°C水浴中。约需30-45秒，直至细胞融化约80%（仍残留少量冰晶）。
2. 迅速将冻存管转移至超净工作台，用70%酒精喷洒消毒，并将细胞加入预热的培养基中。
3. 吸除先前准备好的培养板中的明胶溶液。
4. 以逐滴方式将2 ml MEF悬液分别加入6孔板的每个孔中。注意将MEF细胞均匀分布于孔内。标记MEF培养板日期，并置于37°C培养箱中过夜，使MEF细胞贴壁。
5. 约6小时后，MEF细胞将完全贴壁。建议在接种后24-48小时内使用MEF饲养层。切勿使用超过4天的MEF培养板。
6. 将HuES培养基和0.05%胰蛋白酶/EDTA预热至37°C。在超净台内，预先标记一个无菌的50 ml锥形管。
7. 小心吸除待传代HuES细胞的培养基。每孔用2 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤一次，随后吸除PBS。每孔加入0.75 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA。
8. 盖上培养板盖，于4倍显微镜下观察细胞。围绕HuES克隆的MEF细胞应开始回缩。当MEF细胞充分变圆且HuES克隆边缘变得粗糙时，立即将培养板移回超净台。此过程约需5分钟，绝对不可超过10分钟，否则细胞将无法正常再生长。
9. 轻柔吹打细胞，冲洗孔底，直至MEF单层细胞完全脱落（单层细胞较黏附，可能保持完整片状）。
10. 将细胞悬液转移至含额外HuES培养基的50 ml锥形管中。以500×g离心5分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
11. 若需接种至新的MEF饲养层，将确定体积的细胞悬液加入额外HuES培养基中，并使用自动移液器吹打5-7次。
12. 吸除新鲜MEF培养板中的MEF培养基。
13. 以逐滴方式将HuES细胞悬液加入各孔，确保液滴均匀分布于孔内。避免振荡培养板，小心将细胞放回37°C培养箱过夜，使HuES克隆充分贴壁。
14. HuES细胞传代后的行为应与复苏后细胞类似。

讨论

在本视频中，我们展示了实验室常规传代 HuES 人胚胎干细胞系的方法。高效且规律的消化与传代对于维持健康的人胚胎干细胞系至关重要。HuES 细胞系的一个显著优势是可采用胰蛋白酶进行传代，但需注意避免过度消化，以及在重新接种时避免出现大量单细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HuES 培养基 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
青霉素-链霉素溶液（PenStrep）6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
非必需氨基酸（NEAA）6.5 ml
2-巯基乙醇（2-mercapt–thanol）0.5 μl
KO 血清替代物（KO Serum Replacement）65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2（终浓度 10 ng/mL）0.65 ml