冻存人类胚胎干细胞

摘要

本文展示了我们实验室如何冻存HuES人类胚胎干细胞系。

摘要

在此，我们演示本实验室如何冻存HuES人类胚胎干细胞系。将处于健康指数扩增状态的细胞培养物用PBS洗涤，以去除可能抑制胰蛋白酶反应的残留培养基。随后加入预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，覆盖细胞表面，在室温下孵育最多5分钟。在此期间可观察到细胞变圆，细胞集落从培养皿表面脱离。通过轻柔反复吹打，可将细胞和集落从培养皿表面完全脱离。胰蛋白酶消化后的细胞转移至标准锥形离心管中，管内含有预热的hES细胞培养基，以中和残余胰蛋白酶活性，随后离心。细胞沉淀用生长培养基重悬，浓度约为每毫升培养基含一百万个细胞，此浓度可确保一个冻存样本足以复苏一个10 cm培养皿上的细胞培养。细胞充分重悬后，加入等体积的冰冻保存液。细胞悬液充分混匀后，分装至冻存管中，并在24小时内缓慢降温至-80°C。冻存后的细胞可转移至液氮气相中长期保存，或在-80°C保存约六个月。

方案

1. 用 PBS 清洗处于健康指数扩增状态的细胞培养物，以去除可能抑制胰蛋白酶反应的残留培养基。 
2. 加入预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液覆盖细胞，于室温孵育最多 5 分钟。在此期间可观察到细胞变圆，细胞集落从培养板表面脱离。 
3. 通过轻柔反复吹打，将细胞和细胞集落从培养板表面完全脱离。 
4. 将消化后的细胞转移至标准锥形管中，管内含有预热的人胚胎干细胞培养基，以中和残余的胰蛋白酶，随后进行离心。 
5. 将细胞重悬于生长培养基中，浓度约为每 1 mL 培养基中含 100 万个细胞。
6. 细胞充分重悬后，加入等体积的冰冻保存液。
7. 细胞悬液充分混匀后，分装至冻存管中，并在 24 小时内缓慢冷冻至 -80°C。 
8. 冻存细胞随后可转移至液氮气相中进行长期保存，或在 -80°C 下保存约六个月。

注意：浓度为 106 个细胞/ml 的冻存分装样品足以复苏一剂 10 cm 培养皿中的细胞培养物。

讨论

我们所描述的HuES细胞系冻存技术，对于高效保存和复苏HuES细胞系以及任何感兴趣的哺乳动物细胞均具有良好效果。在培养人胚胎干细胞（hES）系时，每次传代时冻存少量细胞是一个重要考虑因素，因为可能会出现核型异常，且异常细胞可能迅速占据主导。因此，除了在特定传代阶段建立大规模细胞库外，每次传代均保留冻存的细胞分装样本尤为理想。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
huES 培养基	培养基			共 651.5 mL，加入：500 mL KO-DMEM + 6.5 mL 青霉素-链霉素 + 6.5 mL L-谷氨酰胺 + 6.5 mL 非必需氨基酸 + 6.5 mL β-巯基乙醇 0.6 –0.6 µL（14.3 M 储存液）+ 65 mL 血清替代物 + 65 mL 血浆代用品 + 0.65 mL bFGF2（终浓度约 10 ng/mL）
冻存培养基	培养基			80% FCS（胎牛血清）+ 20% DMSO（二甲基亚砜）。4 °C 保存。