人乳房缩小成形术和乳房切除术组织的细胞培养处理

摘要

本文描述了一种处理人类乳腺手术废弃组织的方法。经过处理的组织以类器官形式存在，可无限期冷冻保存，也可用于长期培养。该方法可用于对正常人类上皮细胞生物学特性以及外源性干扰因素的影响进行实验研究。

摘要

通过实验研究正常人乳腺上皮细胞（HMEC）的行为及其正常细胞如何获得异常特性的过程，可得以促进 体外 能够更精确地模拟的培养系统 体内 生物学。利用人类来源的材料研究细胞分化、衰老、衰老相关过程及永生化具有显著优势，因为人类细胞与常用啮齿类动物细胞在这些特性的分子层面存在诸多显著差异^1-2乳腺细胞是一个便捷的模型系统，因为缩乳手术和乳房切除手术较为常见，可获得大量正常及异常组织。

乳腺由多种不同类型的细胞复杂混合而成，例如，上皮细胞、脂肪细胞、间充质细胞和内皮细胞。其中，上皮细胞负责乳腺特化的泌乳功能，同时也是绝大多数人类乳腺癌的起源。我们已建立方法，可将乳腺手术废弃组织处理为纯化的上皮组分以及间充质细胞³。处理后的材料可长期冷冻保存，也可直接用于原代培养。手术废弃组织被运送至实验室后，通过手工解剖富集含上皮细胞的组织。随后使用胶原酶和透明质酸酶消化解剖所得组织，从而在基底膜处将间质成分从上皮结构中剥离。所得的上皮树状小片段（类器官）可通过固定孔径的滤膜依次过滤，与消化后的间质成分分离。根据滤膜孔径的不同，可获得包含较大导管/腺泡片段、较小腺泡簇或间充质细胞的不同组分。我们发现，将类器官而非解离的单个细胞作为起始材料进行培养时，细胞生长效果更佳。采用低应激诱导培养基进行类器官培养，可支持正常人乳腺上皮细胞（HMEC）的长期生长，并表达多种谱系类型的标志物（肌上皮细胞、腔面细胞、前体细胞）^4-5。从单一个体组织中即可获得足够数量的细胞，从而允许使用标准化的细胞批次进行广泛的实验分析，也可用于高通量检测手段的研究。

培养的HMEC已被广泛应用于多种研究中，以探讨调控正常生长、分化、衰老和细胞衰老过程的机制，以及这些正常过程在永生化和恶性转化过程中如何发生改变^4-15,16。可在存在细胞外基质成分、其他细胞类型和/或三维培养条件下观察其生长效应，并与在塑料培养皿上的生长情况进行比较^5,15。从正常细胞开始培养的HMEC为研究可能促进或抑制人类衰老及癌变的因素提供了一个实验上易于操作的体系。

方案

1. 组织处理与消化

1. 从外科手术的废弃组织中获取人乳腺组织。缩乳手术可提供正常或良性细胞；纤维腺瘤和男性乳房发育组织可提供良性细胞；非肿瘤性乳房切除组织（肿瘤周围、对侧或皮下组织）可提供从正常、良性至可能含微小肿瘤的细胞。在获取废弃组织前，须确保已获得适当的机构审查委员会（IRB）批准。所有组织材料均应按照血液传播病原体的防控规定进行处理。
2. 将材料置于含有缓冲液或培养基的无菌容器中（例如 1:1 混合的DMEM培养基与Ham's F-12培养基，添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、5 μg/ml两性霉素B、50 U/ml多粘菌素B和10%胎牛血清，于4 °C运输至实验室。乳房缩小成形术组织可在4 °C保存或运输长达72小时，对后续细胞活力无明显影响。非缩小成形术的少量乳房组织可能需要更及时地处理。
3. 使用无菌手术刀、镊子和剪刀的组合，将脂肪组织、结缔组织和血管中的上皮区域与基质分离。用剪刀剪取组织碎片，并置于大型无菌玻璃培养皿中例如，150 mm）。用镊子夹住组织，手术刀刮除明显的脂肪组织，小心分离出呈白色条索状、嵌于较黄的间质基质中的上皮区域。为便于消化，使用相对的手术刀将上皮组织切成约3–4 mm的小块，放入50 ml离心管中。若处理的组织量较大，可能需要更换新的手术刀刀片。根据机构规定，将培养皿中的脂肪组织清除并妥善处理。
   1. 在富含纤维的组织中（例如，伴有严重纤维囊性病变的皮下乳房切除术），会有更多的实性白色非上皮组织。从这类纤维基质中分离上皮细胞可能较为困难。较大的纤维组织块可切割成面积约为1–3 mm²的小块，并分别进行消化。
4. 将解剖得到的上皮组织放入锥形离心管（50 ml 或 15 ml）中，组织体积不超过管容积的三分之一。用组织消化液（DME/F-12 或等效培养基，含 10 μg/ml 胰岛素、上述抗生素，以及终浓度为 10% FCS、200 U/ml 粗制胶原酶和 100 U/ml 透明质酸酶）加至接近满管体积，仅留少量气隙以利于旋转混合。
5. 将试管置于HulaMixer试管旋转仪上，于37 °C、8 rpm条件下360°旋转过夜。
6. 以 600 × g 离心 5 分钟。根据机构规定丢弃上清液中的脂肪和培养基。
7. 通过将少量沉淀物稀释于培养基中，检查消化是否完成。当显微镜下观察到细胞团块（类器官）具有表面光滑的导管状、腺泡状或导管-腺泡状结构，且无附着的间质组织时，表明消化已完成。图1A）。缩乳手术组织通常在过夜消化后仍会残留附着的基质，需要延长消化时间。
   1. 将未完全消化的沉淀物重悬于新鲜的组织消化液中，于37 °C旋转孵育4–12小时。重复步骤1.6和1.7。若消化仍不完全，再次向沉淀物中加入消化液，于37 °C旋转孵育过夜。为防止过夜消化过度，可降低酶的浓度。
8. 消化完成后，于600 × g离心5分钟，吸除消化液，将沉淀物重悬于含抗生素的培养基中，每50 ml离心管加约15 ml，每15 ml离心管加5 ml。

2. 消化后材料的过滤与冷冻

1. 将重悬沉淀物的等分试样转移至置于无菌50 ml离心管上的无菌100 μm滤网中。让培养基流入离心管，然后用2–3 ml培养基在滤网上方重新冲洗类器官1–2次。重复此操作，直至所有重悬的沉淀物均被转移。如果滤网上类器官过多导致培养基无法顺利滤过，应为剩余材料更换新的滤网。小心地将滤网翻转至另一无菌离心管上方，并用更多培养基将类器官冲洗入管中。此即为100 μm类器官群体。
2. 取流入原始50 ml离心管中的材料，使用40 μm滤网重复步骤2.1的操作，以获得40 μm类器官群体，其中主要包含肺泡样结构。流入离心管中的滤过物构成滤液群体，其中含有单个细胞或小团的间充质细胞和上皮细胞，以及血管组织的小片段。
3. 在600 × g条件下离心5分钟，分别收集100 μm、40 μm及滤液群体的沉淀。
4. 吸除上清液，用CPM II培养基（DME/F-12或等效培养基，含44% FCS和6% DMSO）重悬各管沉淀物，每0.1 ml压紧沉淀物约使用1 ml CPM II。保持样品在4 °C环境中。
5. 通过将0.1 ml重悬物逐滴加入35 mm组织培养塑料培养皿中（操作同下文3.2），对两个类器官群体分别进行测试性接种。滤液群体可直接接种于含成纤维细胞培养基（DME/F-12或等效培养基，添加10 μg/ml胰岛素和10% FBS）的组织培养塑料表面。
6. 将剩余的重悬材料分装至Nunc型冷冻安瓿瓶中（每瓶1 ml或2 ml）。在-80 °C下过夜冷冻，随后立即转移至液氮中长期保存。自20世纪70年代末以来，我们储存的原始安瓿瓶未观察到明显的细胞活力下降。

3. 冻存类器官的接种与原代培养物的传代

1. 将含有类器官的冻存安瓿瓶在37 °C水浴中快速解冻。根据安瓿瓶中类器官数量的目测估计，将类器官接种至2至10个（通常约为6个）60 mm培养皿，或1至3个100 mm培养皿中。每个60 mm培养皿接种约20–40个类器官为最佳。
2. 解冻后的类器官使用1 ml移液器或巴斯德移液器逐滴小心地接种到培养皿表面，以实现类器官的均匀分布。类器官若放置过密，将因生长空间受限而导致传代或冻存时获得的细胞数量减少。操作时应避免刮伤培养皿表面（细胞通常难以在刮伤区域生长）。接种后静置1–2分钟，待类器官贴附，再缓慢加入生长培养基，以防类器官被冲起。例如 2-3 ml/60 mm 培养皿。在37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育。₂ 培养箱。这些是原代培养物。目前我们使用 M87A+oxytocin(X) 培养基以获得最理想的 HMEC 生长效果（图2).
3. 1天后，检查类器官是否已贴壁。添加额外培养基（例如 2-3 ml/60 mm 培养皿）。接种后24-48小时应可见类器官中的细胞迁移，48-72小时应可见有丝分裂形成的细胞增殖。图1B，C）。有时在24小时后附着效果较差，特别是当接种过度消化的类器官或来自年龄较大女性的类器官时，但大多数样本会在72小时内完成附着。血管组织的小碎片可能附着并产生成纤维细胞的外延生长（图1D).
4. 每周至少换液3次。根据接种密度的不同，细胞在M87A型培养基中培养5-8天可长至接近汇合。
5. 如果成纤维细胞生长显著，需要采用差异胰蛋白酶消化法（DT），该方法基于成纤维细胞比上皮细胞更快地从塑料表面脱落的特性来去除成纤维细胞。当上皮细胞集落变大时，吸除培养基，洗涤培养皿（例如，1-2 ml/60 mm 培养皿）加入 STE（生理盐水，0.05% 胰蛋白酶，0.02% EDTA），吸除液体，再加入新鲜的 0.5 ml STE，室温孵育约 1 分钟，并持续在显微镜下观察。当成纤维细胞开始脱落而上皮细胞仍贴壁时，轻轻但迅速地将培养皿侧面敲击硬物表面，使成纤维细胞脱落，随后立即吸除液体。用 PBS 洗涤一次，再次吸除。若培养物中成纤维细胞污染严重，可能需要额外进行一次 DT 处理。
6. 当出现较大的上皮细胞区域但尚未达到汇合时，对原代培养物进行传代。类器官接种密度和贴壁情况将影响所需时间。为了保留原代培养物并随时间推移产生多个继代培养物，我们采用部分胰酶消化法（Partial Trypsinizations, PT）。
7. 吸弃培养基，用1-2 ml STE洗涤60 mm培养皿，加入0.5 ml新鲜STE。室温下在显微镜下观察细胞脱落情况1-5分钟，轻敲培养皿以促进细胞脱落。当约50%的细胞脱落时，应终止消化。早期传代细胞通常脱落较快。对于后期传代细胞，可将培养皿置于37 °C以加速脱落，但需密切监测，因为所有细胞可能迅速脱落。
8. 向培养皿中加入2 ml含血清的培养基，用移液器反复吹打洗涤，然后转移至无菌15 ml离心管中。再用另外约1–2 ml培养基重复洗涤两次，将洗涤液一并加入该离心管中。为原代培养皿更换新鲜培养基，并放回培养箱继续培养。使用血细胞计数板对离心管中的细胞进行计数。原代细胞（primaries）通常可重复传代4至8次，期间原代培养皿中的细胞再生良好，且继代培养或冻存的二代细胞（secondaries；原代细胞经一次传代后即称为secondaries）具有相当的长期增殖能力。一旦原代培养物中类器官成分消失，继代培养的二代细胞其长期群体倍增潜能将逐渐下降。
9. 1. 继代培养至次级培养皿时，直接从试管中将细胞接种至培养皿中。接种量为1-2 x 10⁵ 在M87A+X等培养基中，每100 mm培养皿接种细胞，4–7天内可达到汇合。我们在第二代培养时向培养基中添加霍乱毒素以增强细胞增殖潜能；但在原代培养中不添加霍乱毒素，因其可导致类器官出现多层细胞生长。
   2. 以600 × g离心5分钟收集细胞，重悬于CPMII中，终密度为10⁶ 细胞/ml。将重悬的细胞分装至Nunc型冻存安瓿瓶中，于-80 °C过夜冷冻，随后迅速转移至液氮中长期保存。
10. 建议将第一次传代培养（PT）的细胞冻存以备保存，使用第二次传代培养（PT）的细胞进行传代培养。后续的传代培养细胞可冻存，以供将来使用。

结果

适当地将组织消化为类器官并接种培养后的代表性图像见图1。消化不完全的组织可见仍有物质附着在结构外部，并可能在原代培养中出现成纤维细胞样细胞生长，需通过DT法去除。消化过度的组织将显示较不光滑的外缘，且在原代培养中贴壁时间可能延长。上皮细胞出芽通常在48–72小时内开始（图1B,C）。血管组织的小片段（图1D）可能成为间充质细胞出芽的来源。上皮细胞出芽群体在形态上具有异质性，包含表达肌上皮、前体细胞及腔面细胞谱系标志物的增殖性细胞混合群体（图1E, 3C-E）。在低应激培养基（如添加霍乱毒素和催产素的M87A）中，正常静止前期HMEC的长期生长能力优于以往的培养基配方（图2）。M87A型培养基亦可支持腔面细胞和前体细胞在传代4–8代期间的生长（图3C-E, 4）；此后，大多数细胞仅表达肌上皮谱系标志物。在塑料培养皿上培养的HMEC仍能保持其在微图案化三维微孔中形成正确的三维自组织能力，表现为腔面细胞位于肌上皮细胞内侧（图4A,B），并在Matrigel中接种时形成有序结构（图4C,D）。

图1. HMEC类器官与原代培养。 (A) 消化和过滤后显示导管-腺泡结构的类器官。(B, C) 置于原代培养2天后显示导管和腺泡结构的类器官；注意细胞开始向外生长（白色箭头）。(D) 来自与B、C相同培养物的小血管附着，并伴有成纤维细胞开始向外生长。(E) 原代类器官培养4天后的上皮细胞向外生长。通过K14（红色）和K19（绿色）抗体染色鉴定细胞谱系；细胞核用DAPI染色（蓝色）。可见管腔细胞（K14⁻/K19⁺，绿色）、肌上皮细胞（K14⁺/K19⁻，红色）和前体细胞（K14⁺/K19⁺，黄色）。由于抗体渗透不完全，类器官核心区域存在未染色细胞。

图2. 不同培养基配方中HMEC培养物的生长情况。 来自同一个体（标本184）的类器官在原代培养中使用了不同的培养基配方。使用我们最新的配方M87A+催产素(X)⁴可获得最佳的长期生长效果。该培养基还能支持多种HMEC谱系的生长（见图1E）。较早的培养基配方MM³支持的生长效果较弱，而无血清培养基MCDB170（商业MEGM）¹⁷则会迅速诱导细胞周期依赖性激酶抑制因子p16^INK4A的表达，并促进异常细胞的筛选^7,11,13。

图3. 未培养类器官与培养的HMEC在4代时谱系多样性的比较^th 传代 (A,B) 未培养的酶解离类器官的流式细胞术分析，(A) EpCAM 和 CD49f/alpha 6 整合素的表达，(B) CD227/Muc1 和 CD10/CALLA 的表达。(C,D) 4^th 静止前 HMEC 中 (C) EpCAM 和 CD49f/α6 整合素，以及 (D) CD227/Muc1 和 CD10/CALLA 的表达。可识别的细胞群标记为 LEP（表达腔面标志物 EpCAM 或 CD227）、MEP（表达肌上皮标志物 CD49f 或 CD10）或 PROG（富集于 CD49f+/EpCAM+ 群体）。需注意，与未培养的类器官相比，HMEC 在适应培养过程中 EpCAM 和 CD49f 的调控发生变化。(E) 未经分选的 HMEC 及经 FACS 富集的 LEP 和 MEP 在 4^th 使用角蛋白K14（MEP标志物）和K19（LEP标志物）免疫荧光染色以验证谱系鉴定。细胞核经DAPI染色后呈蓝色。

图4. 培养的HMEC能够形成有序结构 体内在适当的微环境中表现出类似谱系的关系。 (A) 濒死前状态 4^th 原代HMEC细胞通过CD227和CD10标志物经FACS分选富集为管腔型LEP和肌上皮型MEP谱系，这些谱系通过K14和K19的表达得以验证（未展示）。(B) 当在微图案化微孔中混合培养时，这些细胞能够自组织形成双层结构，其中MEP位于外层，LEP位于内层［改编自Chanson 等.⁵]. 添加至微孔后0小时、24小时和48小时，使用共聚焦显微镜对荧光标记的LEP（绿色）和MEP（红色）进行成像（上图）。对照组HMEC随机标记为红色或绿色荧光（下图）。（C）将FACS富集的前体细胞（cKit+）接种于三维（Matrigel）培养体系中培养18天后的明场图像。形成的结构可呈现腺泡形态发生特征。（D）从Matrigel中提取结构并染色检测K14和K19；细胞核用DAPI复染。免疫荧光分析显示结构有序，具有正确的管腔和基底极性。

讨论

本文介绍的人类乳腺组织处理方法能够从人类乳腺中多种细胞类型的异质混合物中分离出纯净的乳腺上皮细胞。通过固定孔径的过滤可实现乳腺不同组分的分离。例如，导管型和导管-腺泡型与腺泡型）从消化后的基质中分离出来。可获得与上皮细胞匹配的同基因型乳腺成纤维细胞。消化后冷冻保存的组织材料在超过30年的时间里仍保持良好的活力。该方法对除极纤维化的乳腺组织外的所有组织均能成功应用，且操作简便。其他乳腺组织处理方法虽有报道，但所获得的上皮细胞组分在活力、纯度或分离效果方面均不及本法。将处理后的类器官置于低应激诱导培养基（如M87A）中培养，可实现人乳腺上皮细胞（HMEC）的长期生长，并表达多种谱系标志物。在塑料培养皿上培养的HMEC仍保留形成具有正常结构的三维结构的能力 在体-样的谱系关系。这些HMEC培养物适用于对正常HMEC行为及其可能促进或抑制衰老和转化的因素进行广泛的实验研究，包括高通量分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 cm 玻璃培养皿	VWR	89000-308
6.5" 剪刀	VWR	82027-594
8" 镊子	VWR	82027-436
一次性手术刀	Miltex	4-411
胶原酶	SIGMA	C0130
透明质酸酶	SIGMA	H3506
胰岛素	SIGMA	I5500
DMSO	SIGMA	D8418
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140-122
制霉菌素	Life Technologies	15290-018
硫酸多粘菌素B	Life Technologies	21850-029
胎牛血清	Life Technologies	26140-087
0.05% 胰蛋白酶，100 ml	Life Technologies	25300-054
DMEM/F12	Life Technologies	11039-021
HulaMixer	Life Technologies	159-20D
100 μm 细胞筛	BD Falcon	352360
40 μm 细胞筛	BD Falcon	352340
15 ml 离心管	Greiner bio-one	188-261
50 ml 离心管	Greiner bio-one	227-261
10 cm 组织培养皿	Greiner bio-one	664-160
6 cm 组织培养皿	Greiner bio-one	628-160
冻存管	Nalgene	5000-1020
血细胞计数板	Hauser Scientific	1490
离心机	Eppendorf 型号	5702