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分析沿生长轴突的小鼠许旺细胞发育

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DOI：

10.3791/50016

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2012年11月21日

 , 
1Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , 2Department of Neuroanatomy, University of Heidelberg, 3FRIAS, University of Freiburg

本文内容

摘要

本文介绍了一种施万细胞（SC）迁移实验方法，其中施万细胞能够沿着延伸的轴突进行迁移和发育。

摘要

周围神经的发育是一个引人入胜的过程。神经元会延伸出轴突以支配特定靶标，而在人类中，这些靶标通常距离神经元胞体超过100厘米。发育过程中的神经元存活不仅依赖于靶标来源的生长因子，也依赖于施万细胞（SCs）的支持。为此，施万细胞从神经元胞体区域（或中枢神经系统与周围神经系统交界处）开始包裹轴突，一直延伸至突触或神经肌肉接头。施万细胞起源于神经嵴，并以前体形式沿着新生轴突迁移，直至整条轴突被施万细胞完全覆盖。这凸显了施万细胞迁移在周围神经系统发育中的重要性，也强调了深入研究这一过程的必要性。为了分析施万细胞的发育过程，需要建立一种实验体系，该体系除了包含施万细胞外，还应包括其生理性的迁移基质——轴突。然而，由于胎内发育的限制，在诸如小鼠（mus musculus）等胎盘类脊椎动物中，体内实时成像（in vivo time-lapse imaging）并不可行。为克服这一难题，我们采用了颈上神经节（SCG）组织块培养技术。在神经生长因子（NGF）处理后，SCG组织块可延伸出轴突，随后施万细胞前体从神经节沿轴突向周围迁移。该体系的优势在于，施万细胞来源于内源性细胞池，且它们沿着自身生理性的、同步生长的轴突进行迁移。这一模型尤为吸引人之处在于，可通过实时成像技术观察施万细胞沿轴突的发育过程，从而为进一步揭示施万细胞迁移机制提供可能。

方案

1. 胶原凝胶的制备

  1. 制备一种储存培养基，其中包含 455 μl 10x MEM、112 μl 7.5% NaHCO3、50 μl 谷氨酰胺和 NaOH。NaOH 的浓度和用量取决于大鼠尾部胶原的制备情况（见 1.2），储存培养基的最终体积为 1,000 μl。
  2. 根据 Ebendal（1）的方法制备大鼠尾部胶原。将胶原溶液在 4 °C 下保存。未观察到胶原溶液发生降解。每次制备新批次时，需评估储存培养基所需的 NaOH 浓度（见 1.1）。使用培养基的 pH 指示剂来滴定 NaOH 的用量和浓度。800 μl 酸性大鼠尾部胶原与 210 μl 储存培养基混合后应呈现红色。若 NaOH 浓度过低，由于培养基中的 pH 指示剂作用，胶原溶液将变为黄色。将胶原加入培养基中并混匀，避免产生气泡。以上操作均需在冰上进行。胶原溶液与储存培养基混合后，在 37 °C 下孵育，聚合反应在 2 小时内完成。实验开始前应先进行测试。1.3) 将 800 μl 胶原溶液与 210 μl 储存培养基混合（见 1.2）。取 100 μl 该混合液加入 8 孔培养板的孔中。将培养板置于细胞培养孵箱中，在 37 °C、5% CO2 及湿润条件下孵育。胶原凝胶的制备应在细胞培养操作台内无菌条件下完成。胶原凝胶在 2 小时内完成凝固。

2. 胚胎颈上神经节的解剖

  1. 从子宫中收获妊娠时间点为 E16-18 的小鼠胚胎，并将其保存在 PBS 中，待后续使用。
  2. 从羊膜中分离一个胚胎，于锁骨水平以下切断头部。使用“昆虫针”将头部固定在硅胶底培养皿上，使头部腹侧朝向操作者，以便观察下颌下区域。固定有助于更方便地进行解剖。
  3. 去除左右两侧下颌下区域的皮肤及其下方的皮下结缔组织。
  4. 将下颌下唾液腺从原位移除，以暴露舌骨、舌骨下肌群及胸锁乳突肌。
  5. 小心去除这些肌肉，以充分暴露喉部和气管。随后移除气管和喉部，此时可在两侧椎前肌上观察到颈动脉。颈动脉节位于颈动脉分叉处，呈椭圆形。小心分离神经节并将其置于 PBS 中；若神经节粘附于解剖工具，应轻柔取下。建议使用镊子以及装有“昆虫针”的持针器进行颈上神经节的分离操作。
  6. 将神经节置于 PBS 中，室温保存，直至收集足够数量。随后在层流罩内的解剖显微镜下，清除神经节上的血管和结缔组织。
  7. 最后，借助安装在注射器上的针头，将分离出的神经节更方便地转移至明胶包被的胶原凝胶上。
  8. 将神经节外植体置于细胞培养孵箱中，在 37 °C、5 % CO2 及湿润条件下，在明胶包被的胶原凝胶上进行培养。

3. 背根神经节外植体的处理

  1. 孵育1-2小时后，向含有胶原的SCG外植体中加入100 μl含有B27添加剂、谷氨酰胺和抗生素的Neurobasal细胞培养基。此时，腔室载玻片的每个孔中含有200 μl液体（100 μl凝胶和100 μl培养基）。再加入200 μl培养基，但此次培养基中含有NGF（60 ng/ml），以促进轴突生长。因此，NGF的最终浓度为30 ng/ml。
    1. 为了研究脊索细胞迁移的起始，在第几天直接添加额外因子 体外 0（DIV0）。将因子溶解于含神经生长因子（NGF）的培养基中，使其浓度为所需浓度的两倍（2).
    2. 为了分析对已开始沿轴突迁移的施万细胞（SCs）的影响，可在体外培养第3天（DIV3）至第4天（DIV4）期间（实验可能终止的时间点）加入额外因子。具体操作为：在DIV3时小心移除180 μl培养液，随后加入200 μl含有神经生长因子（NGF）及目标额外因子的新鲜培养基，其中NGF和额外因子的浓度均为原浓度的两倍。2).

4. 时间序列成像

使用倒置显微镜进行分析。可使用不同的物镜，以确定视野范围和放大倍数。然而，一个重要因素是所用物镜的工作距离，因为 SCG 外植体的成像需透过玻片和胶原凝胶进行。1/10 至 30 分钟的记录帧率效果良好（2）。但该参数需根据具体科学问题进行调整。图像采集可使用普通的 CCD 相机。进行延时成像时，需在显微镜载物台上安装细胞培养孵育腔。成像过程中，将组织置于 37 °C、5% CO2 及湿润条件下孵育。在开始成像前一小时启动孵育系统，使显微镜部件（例如 物镜）以及腔室载玻片均达到设定温度，防止温度变化引起的漂移。利用显微镜软件和软件控制的电动载物台（多点位设置），定义特定的分析区域（同一外植体内部及不同外植体之间），以便同时分析施加于 SCG 外植体的不同实验条件。延时成像可使用野生型组织，也可使用转基因动物的组织，后者可通过 SC 标记（s100b:GFP）进行识别（3）。若需对荧光染料成像，显微镜系统中须配备荧光光源，并使用标准滤光片。

5. 神经嵴细胞迁移距离的定量分析

  1. 在终点（例如 DIV4），用 4% 多聚甲醛在腔室载玻片中固定胶原凝胶，固定时间为 3–4 小时。随后用 PBS 洗涤胶原凝胶 5 次，每次 10 分钟。按照标准流程进行免疫细胞化学染色（2）。如果您初次制备 SCG，建议通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色验证神经节的身份，TH 是儿茶酚胺能细胞的常用标志物。在免疫组织化学染色过程中（一抗孵育后），将含有胶原凝胶的组织块转移至 24 孔板中，因其容积更大，有利于充分洗涤凝胶。
  2. 免疫组织化学染色完成后，小心地将胶原凝胶置于玻璃载片上。轻轻去除残留液体，使胶原凝胶自然干燥并二维收缩。此步骤有助于准确测量迁移距离（2）。随后对样品进行封片处理。
  3. 最后，使用 Fiji（NIH）软件测量迁移距离。此过程无需特殊插件。为确保以 μm 为单位进行准确测量，请检查图像的元数据以及 Fiji 中“图像”→“设定比例尺”的参数设置。同时可使用 Fiji 进行细胞定量分析。

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结果

在NGF（4）处理后，SCG组织块中的轴突生长得以促进（电影方案S1 图1方案）。该过程可通过任何倒置显微镜清晰观察，并可通过延时成像进行追踪（电影S2）。若研究人员初次进行小鼠胚胎SCG解剖，我们强烈建议通过简单的抗酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色对技术进行验证。TH是儿茶酚胺能神经元（本例中为交感神经元）的常用标记物，也可标记轴突（图2B）。借此方法可在该系统中分析轴突长度（2）。

重要的是，在轴突生长被诱导后，可以观察到一群迁移细胞的移动（视频 S2 和 S3）。通过 S100 免疫染色阳性验证，这些迁移细胞为施万细胞（SC）（2）。此外，可利用一种转基因小鼠品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）由人 S100b 启动子片段驱动（3），以直接分析标记的 SC 群体（2）（视频 S4 和 S5）。借助该转基因品系，这些实验还可结合共聚焦显微镜或光...

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讨论

周围神经系统发育是一个令人着迷的过程。当发育完成时，轴突全长均被施万细胞（SCs）包绕，在人类中这一长度通常可超过100 cm。为此，在发育过程中必须建立所需施万细胞的正确数量，同时这些细胞还需沿着延伸的轴突迁移至外周，以确保轴突被完全覆盖。这一规律不仅适用于有髓鞘轴突，同样适用于无髓鞘轴突。在这两种情况下，所有轴突均与施万细胞接触，并依赖其支持。为了研究施万细胞的发育过程，需要采用能够考虑轴突区室的实验方法，从而模拟真实生理环境 体内 比划痕实验在发育研究中具有更显著的优势5），Boyden 小室实验（6）或腔室实验所能实现的。在某些实验中，已经考虑了轴突区室的作用。例如，使用坐骨神经的节段作为施万细胞迁移的路径（7, 8)，或施万细胞与神经元共培养，沿神经元轴突观察到其迁移（9).

然而，SCG 外植体施万细胞迁移实验具有更多优势。该方法尤其引人关注，因为施万细胞（SCs）是沿着自身生理状态下...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢Urmas Arumae分享胶原蛋白实验方案，感谢Jutta Fey和Ursula Hinz提供的出色技术支持。此外，我们感谢Christian F. Ackermann、Ulrike Engel以及海德堡大学尼康影像中心，同时也感谢Joachim Kirsch在视频拍摄过程中给予的热心帮助。本工作部分由德国研究基金会（SFB 592）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x MEMGibco21430
碳酸氢钠 (7.5%)Gibco25080
谷氨酰胺Gibco25030
NaOHMerck109137
神经生长因子（NGF）Roche1058231R&D#556-NG-100
Neurobasal 培养基Gibco21103
B27 添加剂Gibco17504
抗生素Gibco15640
d-PBSGibco14040
昆虫针头FST26002-20
注射器针头BraunBD # 300013
8孔细胞培养板Lab tek177402

参考文献

  1. Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6 (12), e28692(2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).
  4. Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).
  5. Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34 (1), 39-51 (2001).
  6. Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).
  7. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).
  8. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
  9. Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).
  10. Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).
  11. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  12. Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).
  13. Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24(2009).

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