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方法文章

小鼠右心室收缩压测量联合肺组织与免疫组织样本采集

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DOI：

10.3791/50023

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2013年1月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Medicine, New York University School of Medicine, Tuxedo, 2Division of Allergy, Pulmonary, & Critical Care Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Division of Pulmonary Medicine, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种特异性强且快速的实验方案，可同时研究右心功能、肺部炎症及免疫反应，可作为学习工具。视频和图示以系统化的团队协作方式描述了生理学检测和显微解剖技术，该方法可灵活适用于从小规模到大规模的各种研究。

摘要

右心的功能是将血液泵入肺部，从而将右心生理学与肺血管生理学联系起来。炎症通过引起细胞浸润、细胞因子和生长因子的产生以及启动重塑过程，成为影响心肺功能的常见调节因素1。

与左心室相比，右心室是一个低压泵，其工作压力范围相对较窄。肺动脉压力升高与肺血管床压力升高及肺动脉高压相关2。肺动脉高压常与炎症性肺部疾病（如慢性阻塞性肺疾病）或自身免疫性疾病相关3。由于肺动脉高压对生活质量和预期寿命具有不良预后，大量研究致力于揭示可能作为药物干预靶点的潜在机制4。目前，开发肺动脉高压有效管理手段的主要挑战仍在于需要同时理解右心、肺部及免疫系统中复杂的分子与细胞变化。

本文介绍了一种用于快速、精确测量小鼠右心压力变化并同时采集心脏、肺脏及免疫组织样本的操作流程。该方法基于对闭胸小鼠经颈静脉直接插管进入右心室的技术，最早于20世纪90年代末开发，作为肺动脉压力的替代性测量手段5-13。通过系统化的团队协作方式，可实现极为迅速的右心导管插入操作，从而使实验能够在自主呼吸空气的小鼠中完成。将实验流程划分为不同的工作区域，可减少时间延迟，并允许同时开展生理学实验以及免疫组织、心脏和肺组织的采集。

此处所述的操作流程可适用于多种实验室环境和研究设计，从小规模的靶向实验到大规模药物筛选分析均可调整使用。通过同步获取心脏生理学数据（可扩展至包括超声心动图5,14-17）并采集心脏、肺和免疫组织，可减少为推进科学认知所需使用的实验动物数量。本文所介绍的操作流程还为研究连接免疫系统、肺和心脏功能的网络机制提供了理想基础。此处概述的相同原则也可根据需要调整用于研究其他或额外的器官。

方案

1. 准备

  1. 按如下步骤准备以下溶液和试管（表1）：
    1. 不含钙、镁或指示剂的Hanks溶液，含青霉素（100 U/ml）/链霉素（100 mg/ml）。
    2. 磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙，不含镁。
    3. 乙醇，70 %，配制500 ml。
    4. 用PBS配制的缓冲甲醛溶液，浓度为7-10 %，配制500 ml。
    5. 麻醉溶液：
      1. Avertin：将5 ml 2-甲基-2-丁醇小心加入5 g 2,2,2-三溴乙醇中。完全溶解后，将储备液置于室温避光处保存。取0.25 ml储备液，用10 ml 1×PBS在玻璃底瓶中稀释。用铝箔包裹瓶子，置于37 °C直至完全溶解，然后分装至5 ml聚丙烯管中，置于冰箱保存。实验当天早晨取出一份 aliquot 并预热。
      2. 巴比妥类药物：用PBS稀释储备液，配制成2.6%的巴比妥溶液。将3-4 ml分装至聚丙烯管中。
  2. 设置三个工作区域（图1）。
    1. 区域A：准备以下物品：用于记录研究编号、日期、体重以及右心、左心和室间隔重量的研究记录表；精度为0.01 g（量程0-50 g）的精密天平，用于测定体重；精度为0.001 g的微量天平，用于测定心脏重量；称量舟；已明确标记的麻醉溶液；装有液氮的小型杜瓦瓶；装有冰块的保温容器；用于收集血液和组织样本的试管及24孔板（表1）；手术器械（表2，图2）；以及用于清洗器械的溶液（表1）。
    2. 区域B：准备以下物品：解剖显微镜；连接至压力控制单元的右心导管，该单元进一步连接放大器和笔记本电脑。将导管置于盛水的烧杯中。准备手术器械（表2），将缝线剪成合适长度并放入称量舟中；将胶带（推荐使用灭菌指示胶带）剪成合适长度和宽度，并整齐排列在显微镜或实验台面上以便取用；棉签和脱毛液。在研究开始前对导管进行校准。
    3. 区域C：准备以下物品：放大镜；气管插管；1 ml注射器；将缝线剪成合适长度并放入称量舟中；装有液氮的小型杜瓦瓶；装有冰块的保温容器；用于收集支气管肺泡灌洗液（BAL）和组织样本的试管及24孔板（表1）；手术器械（表2）；用于进行BAL以及清洗气管插管和器械的溶液（表1）。

2. 右心导管检查

  1. 使用精密天平称量小鼠，将小鼠轻柔地放入称量舟中。操作过程中应轻柔、安静地处理动物。记录体重。本方案最适合体重20 g及以上的小鼠，因为颈静脉的直径需足以容纳压力导管；若静脉足够大，体重17 g及以上的小鼠也可进行导管插入。
  2. 根据小鼠体重（10 μl/g）注射阿佛丁进行麻醉， 例如 对于20 g小鼠给予200 μl，25 g给予250 μl，30 g给予300 μl。确切的注射体积需根据小鼠品系进行调整。操作时应轻柔、安静地处理动物，因为应激可能改变其对麻醉剂的反应。
  3. 小鼠麻醉后，将其置于双层褶皱的卫生纸上，记录纸上的编号。将脱毛膏轻轻涂抹于小鼠颈部腹侧，以清除手术视野。将小鼠放回纸上，静置1-2分钟。
  4. 用棉签轻轻逆着毛发生长方向擦拭颈部腹面以去除毛发。
  5. 通过检查足趾反射是否消失来仔细确认麻醉深度：小鼠在足趾受到夹捏时无反应。
  6. 快速而从容地操作，右心导管术的剩余步骤不应超过10分钟，理想时间为3至6分钟。保持组织湿润至关重要，因为导管需依靠一层水分在静脉内滑行并移动。操作时间的一致性对于获得组间可比的数据非常重要。
  7. 将小鼠放回纸巾上，并连同纸巾一起转移至泡沫板上。使用灭菌指示胶带固定四肢和头部。
  8. 从下颌至胸骨（胸骨）做皮肤切口。
  9. 仔细向上分离甲状腺至下颌骨，以暴露右侧颈静脉和气管。
  10. 将固定小鼠的泡沫板置于解剖显微镜下方，显微镜的焦平面已就位，物镜放大倍数约为0.8倍（总放大倍数［物镜×目镜］约为8倍）。
  11. 用手术镊小心地剥离右侧颈静脉周围的结缔组织，进行显微解剖。
  12. 在右侧颈静脉上方放置两根缝线。将靠近下颌的缝线结扎，使静脉内的血流减少至微量渗出；将靠近胸骨的缝线以松结方式绕过静脉。若后续需要寻找静脉上的穿刺孔，可利用微量渗出的血液进行定位。
  13. 呼吸并放松（放松颈部和下颌的肌肉），以通过目镜持续观察血管。这将确保你的手和手指能够稳定、顺畅且放松地移动。用镊子夹住靠近下颌一侧的血管，同时用另一只手操作显微剪，在两条缝线之间的血管上剪开一个小孔。放下显微剪，保持该手放松，随后用手指探查导管位置。用拇指和食指轻轻捏住导管并将其取出（图3将导管插入静脉的孔中。
  14. 轻柔地将导管推进至右心图3）。观察导管上的标记，这些标记可大致指示导管需要插入的深度，同时观察监测仪。一旦压力曲线显示出来，轻柔地收紧导管周围的下部缝线。由于导管具有一定的抗张强度而呈现卷曲特性，且小鼠的呼吸和心跳会带来移动，因此需 дополнительно使用胶带固定导管。
  15. 记录压力测量数据2分钟，以供后续分析图4).
  16. 打开固定导管的缝线，然后轻柔地取出导管。擦拭压力传感器后方部位，将其放回盛有水的烧杯中。切勿触碰压力传感器。
  17. 将小鼠移至铺有纸巾的 A 区，进行安乐死，并采集血液和脾脏组织。清洁手术器械。
  18. 开始对下一个动物进行操作。在等待记录压力曲线（2.15）时，若时间允许，可同时注射麻醉剂。

3. 血液和脾脏样本的采集

  1. 每只小鼠注射 400 μl 巴比妥酸盐溶液，等待 1–2 分钟。我们实验室常规进行此操作，以避免小鼠在放血过程中意外从阿佛丁麻醉中恢复。通过为每只小鼠注射相同剂量的巴比妥酸盐溶液，并在采血前等待相同时间，可实现实验的适当标准化。如果机构动物护理和使用委员会允许，并且在放血前对动物的麻醉深度进行了仔细监测，则可省略此步骤。
  2. 在腹部做切口，打开尾静脉（下腔静脉），使用移液管收集血液。
  3. 取出脾脏或脾脏组织块，放入离心管中，用液氮速冻；或放入含有 Hank's 平衡盐溶液的 24 孔板中，用于后续单细胞制备。
  4. 将小鼠转移至铺有纸巾的操作区 C，用于收集支气管肺泡灌洗液（BAL）、肺引流淋巴结、肺和心脏组织。清洁手术器械。

4. 肺和心脏样本的采集

  1. 剥离气管周围的肌肉和结缔组织。用镊子置于气管下方，将缝线从下方穿过。轻柔地施加适当张力以切开一个小孔。保持轻柔的牵拉，用轻微旋转的动作插入气管插管，并用缝线将插管固定。插入气管插管时，确保气管保持湿润，必要时可滴加一滴Hanks溶液。在整个操作过程中，保持呼吸平稳，放松颈部和下颌肌肉，以确保手部动作稳定而流畅。
  2. 从腹部端开始小心移除胸骨，打开胸腔。注意不要扰动胸腔内容物，以免影响后续淋巴结的寻找。
  3. 通过气管插管轻柔注入1 ml Hanks缓冲液进行支气管肺泡灌洗（BAL），轻轻旋转注射器后回收灌洗液。重复此操作3次，关闭离心管后置于冰上。操作过程中，始终注意观察连接注射器的气管插管末端，并不时查看胸腔，观察肺部的充气与放气情况。
  4. 用一把镊子夹住胸壁，另一把镊子寻找并取出肺淋巴结，将淋巴结放入24孔板中。明确寻找位置至关重要：从颈部开始，从右侧小鼠体侧找到胸腔入口处，向上观察脊柱上方区域（图5）。
  5. 取出心脏并放置于滤纸上。沿室间隔小心解剖分离右心，转移至工作区A称重，记录重量后放入离心管中，用液氮速冻。
  6. 在左肺叶支气管周围结扎缝线以闭合主支气管。游离左肺叶，放入离心管中用液氮速冻，或放入含有Hanks溶液的24孔板孔中，用于后续单细胞悬液的制备。
  7. 通过气管插管向剩余肺叶注入约0.5 ml缓冲甲醛溶液。充盈后，将肺叶从胸腔中解剖取出，放入含有甲醛溶液的50 ml离心管中。作为替代实验方案，肺组织可用最佳切割温度介质（OCT，以PBS稀释1:4）充盈后，在含有未稀释OCT的模具中冷冻，用于后续冷冻切片制备。另一种实验设计可能需要同时获取速冻肺组织和肺来源的单细胞悬液，此时无需充盈：直接解剖剩余肺叶，从胸腔中取出后放入含有Hanks缓冲液的24孔板孔中。
  8. 移除气管插管，用Hanks缓冲液冲洗清洁，同时清洗手术器械。

5. 右心导管产生的压力曲线分析

使用LabChart 7软件分析记录的右心室压力数据，分析时未知各记录所属分组信息。随机选取20条以上的压力曲线，测量每条曲线上心室压力的最大值与最小值之差（ΔP）。计算平均ΔP，得到右心室收缩压。

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结果

获取右心压力曲线的主要结果取决于右心导管的正确位置。压力-时间曲线的形态至关重要，因为导管正确置于右心室内时，将产生压力平台期（图4）。相反，尖锐的曲线则提示导管受到呼吸或心跳运动影响，抵在右心室壁上移动所致。为检测动物存活状态中可能存在的问题，需计算ΔP的标准差及心率。这两个数值在不同处理组之间预期无显著差异。此外，ΔP值和心率在记录时间内不应出现漂移趋势。例如，ΔP值缓慢升高提示存在低氧性肺血管收缩18-20；心率下降则提示麻醉深度过高，可能导致动物死亡。在我们实验室中，不同人员均可执行该操作。在所有小鼠组别中，获取右心室压力数据的成功率通常可达90–95%。

学习该操作时，最好从较年长的雌性小鼠（25–30 g 或更重）开始，因其颈静脉较粗，且皮下脂肪沉积通常少于雄性小鼠。确定导管位置的最佳方法是在导管固定于静脉内后立即处死动物，然后从心脏开始解剖，直接观察导管的位置。这将极大有助于排查问题。

获取支气管肺泡灌洗（BAL）液的首要结果是气管插管的正确放置。当注入Ha...

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讨论

本实验流程可快速、同步地测量小鼠右心室收缩压，并采集样本以分析肺、心脏及免疫系统的反应。该方法结合了心脏生理学检测、显微解剖以及后续组织采集，可用于活细胞研究、组织学分析或组织的组学分析。每只小鼠的完整操作时间少于20分钟。由于工作区域布局合理，可同时处理2至3只动物。因此，该方法适用于小规模靶向实验12，也适用于从小型实验室到大型制药研究等多种环境下的大规模筛选研究。

心脏生理学测量与组织采集相结合，使得研究人员能够利用转基因和基因敲除小鼠资源，开展旨在检测调控或协调心脏、肺和免疫功能的生物网络的分析。该同步操作流程的一个重要优势是减少了每项研究所需动物的数量。该操作流程的另一个应用是可根据需要，从同一只动物中研究其他或额外的器官。

本方案可在麻醉诱导后5-10分钟内快速获取右心压力数据，从而能够在动物自主呼吸空气的条件下进行研究。该方法的局限性在于其具有侵入性：动物需接受麻醉，仰卧位固定，并通过颈静脉将导管经心房插入右心室。然而，这一局限性也正是该技术的优势所在，因为所获得的数据代表了右心室压力随时间...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助（项目编号：1R21HL092370-01，GG；1R01 HL095764-01，GG；R01HL082694，JW）；美国心脏协会创始人分会（项目编号：0855943D，GG）；纽约斯托尼沃尔德-赫伯特基金（SHP）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
2-甲基-2-丁醇 Sigma-Aldrich152463
2,2,2-三溴–乙醇 Sigma-AldrichT48402
消毒皂（Coverage Spray TB plus Steris）Fisher Scientific1629-08
乙醇，200度，无水，分析纯/美国药典级 PHARMCO-AAPER111000200用蒸馏水稀释至70%
甲醛溶液 Sigma-AldrichF1635-500ML使用 PBS 储备液和水，将甲醛稀释至 7–10 % 的浓度，同时使 PBS 浓度为 1x
无钙、镁的汉克氏溶液 Fisher Scientific21-022-CV
O.C.TTissue-Tek4583
青霉素（10,000 U/ml）/ 链霉素（10,000 mg/ml）溶液赛默飞世尔科技SV30010
磷酸盐缓冲液（PBS），无钙，无镁，1× 和 10× 溶液 Fisher Scientific
戊巴比妥钠 26% Fort Dodge Animal HealthNDC 0856-0471-01
<强>实验器材
12孔、24孔、96孔板 Falcon
移液管 Fisher Scientific13-711-9BM
EDTA 涂层管 Sarstedt2013-08
0.65 ml 和 1.7 ml 微型离心管 VWR
12 x 75 mm 聚丙烯管 Fisher Scientific14-956-1D
聚丙烯管，各种规格Fisher Scientific
<强>仪器
杜蒙 #5 精细镊子Fine Science Tools11254-20
精细镊子，Graefe型，尖端宽度-0.5 mm，弯曲Fine Science Tools11152-10
精细有齿镊，尖端间距 -0.5 mm，直型Fine Science Tools11150-10
18 号导管，19 号导管BD精密滑动针头切割至最佳长度，末端修平，并对外表面进行锉磨以形成粗糙的外表面。
剪刀，解剖剪——细刃，9 厘米Fine Science Tools14081-09
支气管肺泡灌洗用缝线，编织丝线缝线，4-0 Fine Science ToolsSP116
右心导管插入术缝线，编织丝线缝线，6-0泰利福医疗18020-60
1 ml 注射器BD309659
<强>仪器设备
放大器，PowerLab 4/30ADInstrument模型 ML866
导管，压力 F1.4Millar Instruments, Inc840-6719
体视显微镜Variscope
Vannas弹簧剪（2 mm刀头）、镊子 Fine Science Tools15000-00
卤素灯照明台式放大镜Fisher Scientific11-990-56
笔记本电脑华硕型号 A52F，i5 处理器；15 英寸
光源 AmscopeHL-250-A
压力控制单元 Millar Instruments, IncPCU-2000
软件，Labchart-Pro V.7AD Instruments

参考文献

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