一种可重复的新型技术 体内 描述了一种小鼠颈段脊髓切割损伤模型。该技术基于通过固定颈椎关节突实现脊柱稳定，并使用振荡刀片对脊髓进行切割，切割精度为±0.01 mm。
本文内容
摘要
摘要
使用基因修饰小鼠可加深我们对多种神经系统疾病（如脊髓损伤，SCI）潜在分子机制的理解。传统手工自由操作建立的脊髓损伤切割模型往往造成不一致的损伤，且常伴随挤压或挫伤成分，因此，我们开发了一种新颖的技术。我们的颈段脊髓切割损伤模型通过以下三点改进，解决了传统手工方法的固有缺陷：1）通过椎小关节固定实现颈椎椎体的稳定；2）增强脊髓的暴露程度；3）利用振荡刀片精确至±0.01 mm深度，创建可重复的脊髓切割损伤，且不伴随挫伤。与传统的脊髓切割损伤方法（如徒手使用手术刀或剪刀）相比，本方法可产生一致的病灶。该方法适用于皮质脊髓束、红核脊髓束及背侧上行传导束的轴突再生研究。
引言
基因修饰小鼠的可获得性是识别特定基因在脊髓损伤（SCI）机制中作用的强大工具。撕裂性SCI是研究可能在该损伤后提供有效治疗的治疗剂或分子的重要模型8。由于小鼠棘突细小且脆弱，难以抓握以维持脊柱固定，因此在制作撕裂损伤时对棘突进行固定的精度较低5,11。仅0.2 mm（相当于小鼠脊髓直径的10%）的损伤深度差异即可导致数据的误导性解读。脊髓撕裂损伤的性质和范围必须被精确定义10。为应对这一挑战，我们开发了一种新技术，包括椎体稳定化，并使用连接至路易斯维尔损伤系统装置（LISA）的定制刀片来制造撕裂性SCI7,14。该损伤通过锋利的振荡刀片实现，避免了撕裂过程中组织的变形。利用微驱动器控制撕裂深度，使损伤深度精确至0.01 mm。切割刀片根据特定形状和宽度定制，以形成所需的撕裂轮廓9。本文展示了：1）颈椎暴露的方法；2）使用双侧小关节固定装置进行椎体稳定的技巧；3）采用振动刀片制造颈椎撕裂损伤的过程。
方案
1. 动物准备及脊柱稳定器的应用
从小鼠的侧视图可见，其颈椎腹侧呈凹陷状。C3至T1节段的棘突较小且脆弱，因此不适合用于脊柱稳定，这与文献中常见的描述一致3,4。我们建议通过侧方关节突固定来实现脊柱稳定。固定装置由一个U形金属支架用于支撑小鼠，以及两个可调节的不锈钢臂组成，后者从侧方夹住每个关节突。该方法可对目标椎体实现良好的固定。脊柱固定后，轻微抬高脊柱以展平颈椎的生理弯曲，从而更好地暴露脊髓。
- 对以下手术器械进行灭菌：2-3 把镊子、2 把显微剪刀、30 G 针头、缝合线与持针器、皮肤夹及施夹器。对脊柱稳定器进行消毒。使用氯胺酮/赛拉嗪（100 mg / 10 mg/kg）腹腔注射混合液对小鼠实施麻醉。剃除小鼠颈部的毛发。
- 用聚维酮碘溶液和 70% 酒精清洁皮肤后，将小鼠移至带有加热垫的温控手术台。用眼用软膏覆盖动物的眼睛，以防止角膜干燥。
- 麻醉诱导完成后（当小鼠对尾部夹捏无反应时即达到麻醉状态），从枕骨开始沿后颈部正中线切开皮肤，直至下颈椎皮下脂肪垫处。在放大条件下，于 C2 水平沿斜方肌正中切开，并分离头半棘肌。识别肌下脂肪垫有助于在正确层次进行解剖分离。
- 将正中肌肉分离向尾侧延伸至 T2 棘突，该结构可作为可靠的解剖标志。切断附着于 T2 椎体的肌肉，并去除 T2 棘突的软骨部分。
- 使用显微剪刀从 C2 至 T2 椎板水平剥离椎旁肌。肌肉分离起始于棘突旁侧，并向双侧关节突关节方向延伸。将紧邻棘突和椎板的肌肉（骨膜层）分离，以减少出血。暴露外侧关节突后，将小鼠置于 LISA 手术台的 U 形槽中。
- 将不锈钢固定臂双侧置于暴露的关节突下方。固定臂就位后，拧紧其上的拇指螺钉以固定脊柱。此操作可牢固固定目标椎体并提供良好的术野暴露。可通过调节固定臂实现脊柱精确的水平定位。
- 在 C5 与 C6 之间切开黄韧带，暴露其下方的硬脊膜。在椎板间隙处，使用 30 G 针头制造一个小的硬脊膜切口，随后插入显微剪刀扩大该切口。此时脊髓已准备就绪，可进行可控性切割损伤。
2. 使用 LISA 装置进行颈脊髓切割损伤
- 颈段脊髓膨大部分的宽度在不同节段有所变化。使用2.3 mm的平刃刀片在C5-6节段进行脊髓背侧半切损伤，并调节振动幅度以覆盖整个脊髓的宽度。刀片购自Fine Science Tools Inc.（加利福尼亚州福斯特城），并针对脊髓切割损伤进行了改装。保持刀片振幅≥0.5 mm，较低的振幅会降低脊髓切割的顺畅性。
- 将脊柱稳定器和小鼠放置于LISA平台上。刀片通过微驱动装置连接至LISA，可实现三个方向的运动控制。LISA的各组成部分及其功能详见图1。
- 开启刀片振动开关。在显微放大条件下移动小鼠，使暴露的脊髓正位于振动刀片下方。
- 通过提升支撑小鼠的平台使其接近振荡刀片。当刀片刚刚接触脊髓背侧静脉时，记录此时的“0”位置。脊髓切割损伤的深度以“0”位置为基准进行测量。
- 通过微驱动装置控制平台上升：微驱动旋钮旋转360°可使平台升高0.25 mm。因此，旋转微驱动旋钮3圈即可形成0.75 mm深的背侧半切损伤。损伤深度的精度为±0.01 mm。当刀片开始切割脊髓时，使用生理盐水冲洗以润滑手术区域。脊髓切割深度由垂直方向的微驱动装置控制，无需依赖视觉引导。
- 达到预定切割深度后，关闭振动开关。理想情况下，振荡刀片应停留在损伤间隙中，且无组织变形迹象。将平台从切割刀片下移开，并使用棉签清除手术区域的血液和生理盐水。止血通常在<1分钟内自发完成。
- 将小鼠从脊柱稳定器中取出。使用6-0丝线缝合椎旁肌，并用不锈钢Michel夹闭合皮肤切口。
3. 动物护理
- 皮下注射总共 1–2 ml 生理盐水以维持充分的水合作用，并将小鼠置于加热垫上的恢复笼中，直至其恢复意识。
- 术后自由提供水和软食，并持续 48 小时给予镇痛药物。脊髓背侧半切术后无需进行膀胱护理。
结果
在小鼠脊髓精确损伤造模过程中，目标椎体的固定至关重要。我们的脊柱稳定装置克服了小鼠颈椎棘突较短以及脊柱腹侧生理性前凸的解剖学难题。使用本研究的颈椎稳定器可充分暴露颈椎椎体（图2）。本小鼠脊柱稳定装置是一种可靠的颈椎脊髓手术准备技术。采用LISA进行损伤时，其深度精确至0.01 mm 6,13。这种精确的切割损伤在损伤边缘与周围组织交界处不会产生挫伤（图3）。在一项关于轴突再生的研究中，于C57BL/6小鼠中证实了背侧半横断损伤的精确性：每个样本的切割深度达0.9 mm，刚好超过中央管，且经脊髓病理切片确认 1。所有动物在经历该脊髓切割损伤后，运动功能均得到恢复。
图1. (A) 小鼠置于LISA平台上的脊柱稳定器中。振动刀朝向将要进行损伤的脊髓部位。显微驱动控制器位于平台下方，用于将小鼠准确定位于适当位置。垂直方向的显微驱动器控制损伤深度，倾斜旋钮用于调节脊髓的水平面，以避免损伤角度偏斜。电源开关控制振动电机的启停，另一旋钮用于调节振动幅度。(B) 在完整椎板弓下方造成的0.75 mm背侧半横断损伤切口。
图 2. (A) 小鼠脊柱稳定装置，由U型槽和两个臂及连接件组成。小鼠置于C型槽中用于颈段脊髓损伤（SCI）实验，置于T型槽中用于胸段SCI实验。(B) 通过将臂置于侧块下方并拧紧拇指螺钉来固定颈椎。在不切除任何骨组织的情况下，暴露C5-6、C6-7和C7-T1椎板间的硬脑膜。
图3. 在矢状面观察到的四个背侧脊髓切割损伤，深度分别为0.5、0.8、1.1和1.4 mm（焦油紫和伊红染色），显示了该技术具有高度精确性。
讨论
在对脊髓造成切割损伤之前，通常通过固定棘突来实现脊柱的稳定。然而，在小鼠中，颈椎的生理性前凸曲度以及将夹具连接到脆弱且较短的C3至T1节段棘突上，均会妨碍有效的脊柱固定。此外，在手动控制下使用剃刀刀片或显微剪刀会造成明显的组织变形，导致损伤深度不一致6。这可能引起数据的误读，尤其是在研究特定通路的轴突再生时。例如，如果背侧皮质脊髓束在损伤时未被完全横断，则残留的背侧皮质脊髓轴突可能被误判为再生的轴突。通过使用一种在单个节段关节突处固定的脊柱稳定装置，并结合对脊髓进行精确的损伤操作，可克服上述问题。此外，采用高频振荡刀片可在不压伤或挫伤邻近脊髓组织的情况下实现清晰的切割损伤。该方法此前已被用于在大鼠中制造脊髓切割损伤9,12,14，并经过后续改进后应用于小鼠胸段脊髓切割损伤的建模6。在本研究中，我们描述了在小鼠中建立可靠的颈段脊髓切割损伤的方法。
由于小鼠脊髓的前后直径<2 mm，因此在建立可靠的实验模型时，切割损伤的深度必须精确。损伤深度的微小变异将显著影响评估轴突再生以及体积和行为学研究的实验结果。本方法的损伤深度精度为±0.01 mm，因为我们采用高精度微驱动器来控制切割刀片的位置。该方法减少了其他脊髓切割损伤模型中固有的不一致性。该技术在研究位于脊髓背侧半部的长脊髓通路（如皮质脊髓束、红核脊髓束和背侧上行束）的轴突再生方面尤为有用。利用该方法，这些纤维束可被完全且可靠地横断。因此，数据解读的误差被最小化，从而提高了脊髓损伤（SCI）实验研究报道的可靠性。
总之，我们介绍了一种可重复的新型技术 体内 小鼠颈椎脊髓切割损伤模型。该技术基于通过固定颈椎关节突来稳定脊柱，并使用振荡刀片对脊髓进行切割损伤。利用此方法建立小鼠胸段背部脊髓切割损伤模型 6我们证明了裂伤深度、组织学特征与行为恢复之间存在紧密的相关性。该技术也被其他多个实验室证实具有可靠性。 2,12.
披露
- 多位作者（YPZ、XMX、CBS）在 Louisville Impactor System, Inc. 拥有经济利益。
- 作者 Yi Ping Zhang、Lisa B. E. Shields 和 Christopher B. Shields 任职于肯塔基州路易斯维尔市的诺顿医疗保健公司。其他作者任职于印第安纳州印第安纳波利斯市的印第安纳大学。
- 作者未从任何生产本文所用试剂或仪器的公司获得资助。
致谢
该设备的开发得到了肯塔基州路易斯维尔市LISA公司的支持。我们还感谢肯塔基州路易斯维尔市Norton Healthcare对CBS的持续支持，以及美国国立卫生研究院（NIH）基金NS050243、NS052290和NS059622对XMX的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠脊柱稳定器 | 路易斯维尔撞击器系统 | 固定并暴露颈椎椎体 | |
| LISA 振动刀 | 路易斯维尔撞击器系统 | 制作颈段脊髓挫裂伤损伤模型 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools（美国） | 15013-12 | 皮肤和斜方肌切口 |
| 弹簧剪刀 | Fine Science Tools（美国） | 15023-10 | 将肌肉与椎板分离 |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools（美国） | 15002-08 | 硬脑膜切开 |
| 格拉夫镊 | Fine Science Tools（美国） | 11154-10 | 回缩皮肤 |
| Dumont #7 镊子 | Fine Science Tools（美国） | 11274-20 | 肌肉回缩（尖端改良）（图A） |
| Dumont SS 镊子 | Fine Science Tools（美国） | 11203-25 | 脊椎固定（尖端改良）（图B） |
| 30G针头 | Becton Dickinson | 305106 | 制作硬脑膜切口 |
| 6-0 缝合线 | Ethicon | 8806H | 缝合肌肉和筋膜层 |
| 伤口夹 | Fine Science Tools（美国） | 12031-07 | 皮肤闭合 |
| 三溴化物–乙醇（Avertin） | Sigma-Aldrich | 90710-10G | 麻醉剂 |
路易斯维尔冲击器系统公司，肯塔基州路易斯维尔市东格雷街210号1102室，邮编40202，电话：(502) 629-5510，电子邮件： cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, 电子邮件： info@finescience.com 美国新泽西州富兰克林湖贝克顿迪金森公司，贝克顿路1号，邮编07417，(201) 847-6800；爱惜康公司，新泽西州萨默维尔，西22号公路，邮编08876，1-877-ETHICON Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63178，电话：(314) 771-5765，电子邮件：cssorders@sial.com | |||
| <强>图A A 是改良的Dumont #7镊子；B 是改良的Dumont SS镊子。 |
参考文献
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