方法文章

用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

19.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/50070

⸱

2013年2月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Department of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center

本文内容

摘要

在我们首次进行的人体基因治疗临床试验中，将表达靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）的T细胞作为B细胞恶性肿瘤的试验性治疗手段。本文描述了利用Sleeping Beauty（SB）系统对T细胞进行遗传修饰，以导入靶向CD19的CAR，并在设计的CD19阳性人工抗原呈递细胞上实现选择性扩增。

摘要

通过将基因治疗与免疫治疗相结合，可改进临床级T细胞的效能，从而构建出一种具有更优生物学特性的生物制品，其潜力体现在：(i) 对肿瘤相关抗原（TAAs）的识别能力增强，(ii) 输注后在体内持久存续，(iii) 向肿瘤部位迁移的潜力提升，以及 (iv) 在肿瘤微环境中重复发挥效应功能的能力。目前大多数用于人类临床应用的T细胞基因改造方法，均采用逆转录病毒和慢病毒载体以实现嵌合抗原受体（CAR）的稳定表达。1-3此方法虽然符合现行药品生产质量管理规范（GMP），但由于依赖少数生产设施来制备和放行临床级重组病毒，成本较高。非病毒质粒的电转导作为一种替代转导的方案具有吸引力，因为DNA可在临床级生产中的成本约为前者的十分之一th 重组GMP级病毒的成本。为了提高整合效率，我们进行了改进 睡美人 用于人类应用的 (SB) 转座子与转座酶4-8我们的SB系统使用两种DNA质粒，其中一种转座子编码目的基因（例如 2nd 第二代CD19特异性CAR转基因（指定为CD19RCD28）和一种转座酶例如 SB11）可将外源基因插入TA双核苷酸重复序列中9-11为了获得满足临床需求数量的基因修饰T细胞，我们使用经改造以表达肿瘤相关抗原（TAA）的K562细胞系衍生的人工抗原呈递细胞（aAPC）（克隆#4）。例如 CD19，以及T细胞共刺激分子CD86、CD137L、膜结合型白细胞介素（IL）-15（与修饰的IgG4 Fc区融合的肽段）和CD64（Fc-γ受体1），用于负载单克隆抗体（mAb）12在本报告中，我们展示了在符合cGMP条件下生成靶向CD19的CAR的可执行操作步骤+ 适用于人体应用的T细胞。通过同步电转染两个DNA质粒——SB转座子（CD19RCD28）和SB转座酶（SB11），随后在可溶性重组人IL-2和IL-21存在条件下，每隔7天添加γ射线照射的aAPC（克隆#4）以刺激细胞，从而筛选获得稳定整合子13通常需要进行4个周期（连续培养28天），以获得具有临床应用前景数量的稳定表达CAR的T细胞。该制备临床级CD19特异性T细胞的方法可应用于外周血（PB）或脐带血（UCB）来源的T细胞。此外，通过将导入的CAR特异性与aAPC上由CAR识别的TAA表达相匹配，该策略还可用于生成针对多种肿瘤类型的T细胞。

方案

第0天或之前

1. 从外周血和脐带血中分离单个核细胞（MNC）

  1. 用等体积的PBS-EDTA稀释PB，用四倍体积的PBS-EDTA稀释UCB。
  2. 将稀释后的血液（25 ml）缓慢铺加到50 ml离心管中的Ficoll（12 ml）上，以400 × g离心30–40分钟（不使用刹车）。
  3. 使用移液管收集并转移单个核细胞层（界面层）至新的50 ml离心管中。
  4. 用PBS-EDTA补总体积至50 ml，以450 × g离心10分钟。
  5. 吸除上清液，轻轻将细胞沉淀重悬于50 ml完全培养基（CCM）中，再以400 × g离心10分钟。
  6. 轻轻重悬细胞沉淀，并合并至CCM中，使用台盼蓝排斥法进行细胞计数（Cellometer，PBMC程序）。
  7. 此时单个核细胞可用于电穿孔（Nucleofection）或冻存以备后续使用。

第0天用于电穿孔的T细胞制备

  1. 若使用冻存的单个核细胞（MNC），请在37 °C水浴中快速解冻足够用于全规模电穿孔的细胞量（2 × 108，额外增加约20%以补偿离心和2小时孵育过程中的细胞损失）。若使用新鲜分离的MNC，则直接进行步骤2.3。
  2. 轻柔重悬细胞，并转移至适当大小的离心管中，加入预热的无酚完全RPMI培养基（PF-RPMI），在200 × g条件下离心10分钟（不启用刹车），吸除上清液。
  3. 用PF-RPMI重悬MNC，进行细胞计数（Cellometer），并将细胞以106 个细胞/mL的浓度转移至适当大小的细胞培养容器中。
  4. 在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育2小时±30分钟。
  5. 将MNC转移至无菌离心管中，在200 × g条件下离心5分钟（不启用刹车），吸除上清液，轻柔重悬并合并细胞沉淀于PF-RPMI中。
  6. 进行细胞计数（Cellometer），计算所需细胞悬液的体积（2 × 108 MNC）。
  7. 将计算好的体积转移至无菌50 mL离心管中，在200 × g条件下离心10分钟（不启用刹车）。
  8. 吸除上清液，确保无残留培养基，通过轻敲管壁的方式轻柔重悬细胞。

3. 第0天对单个核细胞（MNC）进行电穿孔（核转染）（使用10个比色皿的完整流程）

  1. 在湿润的 37 °C/5% CO2 培养箱中，预先将无菌的 12 孔板（含 10 个孔，每孔加入 4 ml 温热的 PF-RPMI）进行预孵育。
  2. 在生物安全柜（BSC）中，将 Lonza Nucleofector 人 T 细胞试剂盒溶液（按制造商说明重悬，www.lonza.com）恢复至室温。
  3. 制备 Nucleofector 溶液/DNA 主混合液：每个反应/电转杯中加入 100 μl 添加物的 Nucleofector 溶液、15 μg 转座子（指定为 CD19RCD28/pSBSO 的超螺旋 DNA 质粒）和 5 μg 转座酶（指定为 pCMV-SB11 的超螺旋 DNA 质粒）。
  4. 轻轻敲击离心管侧壁使细胞沉淀（来自步骤 2.8）充分分散，并重悬于 Nucleofection 溶液/DNA 主混合液中（最终细胞浓度：2 × 107 个细胞/100 μl）。
  5. 小心将 100 μl 细胞悬液（来自步骤 3.4）转移至十个（10）Lonza Nucleofection 电转杯中，注意避免产生气泡。
  6. 轻敲电转杯一次，使用程序 U-014（适用于未刺激的 T 细胞）进行电穿孔。
  7. 将电转杯和 12 孔板（步骤 3.1）转移至生物安全柜（BSC）中。
  8. 使用 Amaxa 细尖转移移液器，从每个电转杯中收集电穿孔后的细胞：加入约 500 μl 来自对应孔（步骤 3.1 准备的 12 孔板）的预温培养基，然后将 12 孔板放回湿润的 37 °C/5% CO2 培养箱中孵育 2 小时 ± 30 分钟。
  9. 孵育 2 小时后，收集并转移所有孔中的细胞至无菌离心管中。
  10. 在室温下以 140 × g 离心 8 分钟（不启用刹车），洗涤细胞，吸除并弃去上清液，确保细胞沉淀上无残留培养基。
  11. 轻轻敲击离心管侧壁使细胞沉淀分散，并轻柔重悬于 CCM 中，以获得单细胞悬液。
  12. 进行细胞计数，并用 CCM 调整细胞浓度至 106 个细胞/ml。
  13. 将细胞悬液转移至细胞培养瓶中，并置于培养箱中过夜培养。
  14. 对对照组（EGFP 转染细胞）重复执行步骤 2.1 至 3.8：每电转杯使用 5 × 106 个细胞和 5 μg Amaxa 对照 EGFP 超螺旋质粒（pmaxGFP）。

第1天（共1天）st 及后续刺激周期

第1天通过流式细胞术分析CAR表达

  1. 收集电穿孔后的细胞，使用台盼蓝排斥法（血细胞计数板）进行细胞计数。
  2. 用针对 CD3、CD4、CD8 和人 IgG Fcγ 的特异性抗体对细胞（1 至 2 × 106）进行染色（用于检测 CAR 表达水平）。
  3. 在 FACS Calibur 仪器上获取细胞，并使用 FCS Express 软件分析数据以计算 CAR 表达量。
    1. 通过以下公式计算培养物中 CAR+ 细胞数量：
      （总活细胞数）×（CAR+ 细胞百分比）= CAR+ 细胞数

第1天aAPC（克隆#4）的制备。aAPC（克隆#4）由K562细胞（亲本细胞系购自美国模式培养物集存库）衍生而来，用于共表达所需T细胞共刺激分子

  1. 在37 °C水浴中解冻一份冷冻的100 Gy辐照aAPC等分试样。
  2. 将细胞在CCM中以400 × g离心10分钟，洗涤两次，并使用Cellometer（台盼蓝排斥法）进行计数。
  3. 计算刺激所需的活aAPC数量：
    （CAR+细胞数）× 2 = 所需辐照aAPC数

6. aAPC介导的CAR刺激+ 第1天开始时的T细胞st 及后续刺激周期

  1. 在无菌容器中，将电穿孔后的细胞（表达CAR）与γ射线照射的aAPC（克隆#4）按1:2的比例（CAR+细胞：活aAPC）在CCM中混合。
    1. 注意 aAPC的比例需根据电穿孔后第二天流式细胞术检测的CAR表达水平进行调整。
  2. 向细胞悬液中加入IL-21（30 ng/ml）。
  3. 以106个细胞/ml的浓度分装至T-75 cm2培养瓶和/或Vue Life Culture袋中，并放回培养箱。

第3天、第5天

7. CAR+ T 细胞的持续培养

  1. 进行半量换液，补充IL-21，并将T细胞维持在106 个细胞/ml的浓度。

第7天

8. 第一轮人工抗原呈递细胞介导的刺激周期结束

  1. 收集细胞，计数并进行 CD3、CD4、CD8 和 Fcγ（CAR）染色，然后进行步骤 10.1。

9. 耗竭 CD56+ 细胞（通常在电穿孔后 7 至 14 天之间）

  1. 如果 CD56+CD3neg 淋巴细胞 ≥ 10%，则使用磁性微珠进行 CD56 耗竭。

刺激周期 #2、#3 和 #4 分别对应第 8 天 → 14 天、第 15 天 → 21 天以及第 22 天 → 28 天

10. 通过递归添加aAPC扩增T细胞至临床所需数量

  1. 按照步骤 4.3-8.1 中所述，重复刺激过程（4 次）。
  2. 从第 7、14 和 21 天开始，在每次更换培养基时（每周三次，按周一-周三-周五的时间表）向培养物中添加 IL-2（50 U/ml）。
  3. 根据需要冷冻保存（存档）多余的 T 细胞。
    1. 使用程序降温仪冷冻 T 细胞。

第28天

11. 最后一轮aAPC介导的刺激周期结束：收获T细胞

  1. 对T细胞进行冷冻保存，用于放行检测和输注。

结果

我们报道，通过电转染DNA质粒并将T细胞在γ射线照射的aAPC上扩增，可生成适用于临床的人源外周血（PB）和脐带血（UCB）来源T细胞的数量。这些经基因修饰的T细胞表达导入的CAR，可识别与主要组织相容性复合体无关的肿瘤相关抗原CD19。用于表达（i）转座子的SB来源DNA质粒，一种2nd 第二代CAR（CD19RCD28），通过CD28和CD3-ε传递信号14，以及（ii）转座酶SB1115，此前已有描述13,16,17本研究中使用的质粒由Waisman临床生物制造中心（Madison, WI）商业生产。aAPC（克隆#4）源自K562细胞（亲本细胞系购自美国模式培养物集存库），共同表达所需T细胞共刺激分子（每种引入的分子均在 390%（如前所述，在aAPC细胞表面）12在此，我们展示了可通过SB转座技术将CAR导入来自外周血（PB）或脐带血（UCB）的单个核细胞（MNC），再添加人工抗原呈递细胞（aAPC），以CAR依赖的方式扩增CD19特异性T细胞图1、图4)13,18. 十个比色皿（2x107 每位受体使用 MNC/比色皿进行电穿孔处理 15 μg 编码转座子（CAR）的DNA质粒（CD19RCD28/pSBSO） 5 μg 编码转座酶（SB11）的DNA质粒（pCMV-SB11）。若单个核细胞（MNC）数量有限，或为适应实验室工作规模，可减少电穿孔所用比色皿的数量。电穿孔当天定义为刺激周期#1的“第0天”。作为流式细胞术和培养条件的对照，自体T细胞进行模拟电穿孔处理（不加DNA质粒），并在预先负载OKT3抗体以交联CD3、从而维持T细胞增殖的γ射线照射过的aAPC（克隆#4）上进行数量扩增。我们通常在电穿孔后的第二天评估电转效率及T细胞的存活率。图2B）。对照DNA质粒（命名为pmaxGFP）和CAR在该初始时间点的EGFP表达反映了整合型和游离型质粒的蛋白表达。通常，电穿孔后第二天，EGFP表达率约为60%，CAR表达率约为40%（图2A) T细胞存活率为40-50%。在存在可溶性重组人IL-2和IL-21的条件下，反复添加γ射线照射的aAPC，可获得稳定表达CAR（CD19RCD28）的T细胞。CD3阴性CD56+ 若培养物中NK细胞比例≥10%，尤其是T细胞上CAR表达比例较低时，应使用特异性针对CD56的顺磁性微珠去除NK细胞。该步骤可防止NK细胞快速过度生长，从而避免其干扰aAPC维持CAR T细胞增殖的能力。+ T细胞。偶尔，从CAR中耗竭NK细胞+ 在最后两个刺激周期中进行T细胞操作，但由于部分CAR细胞共表达CD56，会导致目标细胞的损失+ T细胞。在共培养的第14天之后，T细胞在功能封闭系统中使用Vue Life培养袋进行培养。通常在共培养的第14天或第21天（即第二轮或第三轮刺激周期结束时），将一部分经基因修饰并扩增的T细胞冷冻保存，作为未来分析的存档材料，并在后续生产工艺中出现意外问题时用于复苏。T细胞通常在培养第28天左右收获。图3）中常规表达 >90% CAR 且为 >80% 存活率（图2C，D). 我们先前已证明，在aAPC上共培养四周后，CD3+ T细胞的平均扩增倍数为19,800±11,313（携带CAR）+ 表达率为 90%±7.5 13这些T细胞经过冷冻保存，并接受生产过程中的检测和放行检测，以评估所制备产品的安全性和治疗潜力。放行检测依照临床实验室改进修正案（CLIA）的要求进行，以在临床试验受试者回输前出具分析证书。

CAR T细胞制备流程图；CD3/CD28转座子激活，细胞因子添加。
图1. 从外周血（PB）和脐带血（UCB）中电穿孔并扩增CAR+ T细胞的步骤示意图。 点击此处查看高清大图。

流式细胞术分析图；GFP、FSC-H 图谱；CAR 表达数据图，CD3、CD4、CD8 结果。
图 2. 外周血来源基因修饰 T 细胞的表征。(A) 首次刺激周期第 0 天 EGFP 的表达，用于评估基因转导效率。(B) 电穿孔后约 24 小时及 (C) 在 aAPC 上共培养 28 天后，通过流式细胞术检测 CD3+、CD8+ 和 CD4+ T 细胞中 CD19 特异性 CAR（CD19RCD28）的表达。在脐带血来源的 T 细胞中也观察到类似的 CAR 表达。(D) CAR 表达的动力学变化。 点击此处查看高清大图。

细胞生长曲线；推断的细胞数量与共培养天数的关系；CD3、CAR刺激分析。
图3. 外周血来源的CAR+ T细胞的扩增。 外周血来源的CD3+ 和CAR+ T细胞在γ射线照射的aAPC存在下，联合重组人源可溶性IL-2和IL-21反复共培养后的数量扩增速率。向上的箭头表示添加γ射线照射的aAPC，标志着每一轮刺激周期的开始。脐带血来源的CAR+ T细胞表现出类似的扩增速率。

CAR T细胞制备示意图：电穿孔、K562共培养、冷冻保存、输注过程。
图4. 使用SB系统和aAPC系统对来自外周血（PB）和脐带血（UCB）的CAR+ T细胞进行基因修饰与扩增的制备流程示意图。 通过电转将SB来源的超螺旋DNA质粒导入T细胞，并在重组人可溶性IL-2和IL-21存在条件下，与K562来源的aAPC（克隆#4）进行后续共培养，从而生成靶向CD19的CAR+ T细胞。 点击此处查看高清大图。

T细胞来源转座子*转座酶T细胞输注IRB #NIH-OBA #IND #
自体（患者来源）**CD19RCD28SB11自体造血干细胞移植后2007-06350804-92214193
同种异体（供者来源）CD19RCD28SB11同种异体造血干细胞移植后2009-05250910-100314577
同种异体（供者来源）CD19RCD28SB11同种异体脐带血移植后2010-08351001-102214739

表1. 在美国食品药品监督管理局（FDA）的监管下，于MDACC开展的临床试验中输注在aAPC上扩增的CD19特异性CAR+ T细胞。 *T细胞通过强制表达编码靶向CD19的SB转座子而获得特异性nd 第二代CAR，命名为CD19RCD28，通过CD28和CD3-ζ传导信号。**试验详见参考文献#7

讨论

转座子与转座酶系统，例如 piggyBac12,19 和 SB18,20-22，是基因治疗的非病毒方法，可作为临床级CAR的病毒介导转导的替代方案+ T细胞。选择睡美人（SB）作为基因转移系统，是基于其在人类基因治疗中的潜在应用价值。1,6,23我们开发了SB转座（用于导入CAR）与递归添加γ射线照射的aAPC（用于回收稳定表达CAR的基因修饰T细胞）两项双重技术，作为符合cGMP标准的I/II期临床试验中制备肿瘤相关抗原特异性T细胞的平台技术。图4。经过28天（四个7天刺激周期）在γ射线照射的aAPC上共培养后，我们通常能够获得至少约1010 适用于人类应用的基因修饰T细胞。根据需要，可进行额外的刺激循环，以产生更大量的基因修饰T细胞。此外，如果CAR较少+ T细胞是必需的，可通过减少电穿孔所用比色皿数量，并在每轮刺激周期开始时仅将扩增后T细胞中的一部分继续在活化人工抗原呈递细胞（aAPC）上进行后续增殖，从而缩小电穿孔与扩增的操作规模。收获用于输注的大多数经电穿孔和扩增的T细胞可稳定表达CAR。CD4的扩增+ 和 CD8+ 表达我们2的T细胞nd 生成的CAR包括具有记忆/初始表型的细胞，并表现出重定向特异性的三个特征。首先，经基因修饰的T细胞可特异性裂解CD19+ 靶点，其次，在响应CD19时产生IFN-γ+ 刺激细胞，第三，响应 CD19 发生增殖+ 饲养细胞，均以CAR依赖性方式13,18通过SB系统以非病毒质粒DNA电转的方式将CAR转基因整合，可在来自外周血和脐带血的静息态原代T细胞中实现。我们及其他研究者已对K562细胞进行遗传改造，使其作为人工抗原呈递细胞（aAPC），以高效扩增出满足临床输注需求数量的T细胞。24,25. 人工抗原呈递细胞及组织培养环境（例如 IL-21的添加）已进行修改，以生成患者和供体来源的CD19特异性T细胞，用于造血干细胞移植后的输注表1)13,18我们可以通过静脉穿刺获取的外周血（PB）直接制备CAR+ T细胞，从而避免了通过单采分离术获取外周血单个核细胞（MNC）所带来的成本、不适和不便。该方法能够大量制备CAR+ 来自少量单个核细胞的T细胞特别适用于异基因脐带血移植后输注T细胞。由于新生儿供者体积小且信息匿名，无法在后续时间点再次获取该个体的样本，且可用于T细胞制备的收获单个核细胞数量有限，以避免干扰造血功能。目前正在进行生产工艺的进一步优化，包括引入高通量电穿孔装置，并结合完全封闭式的WAVE生物反应器，以最大限度减少人工操作。总体而言，SB系统与人工抗原呈递细胞（aAPC）是生成靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的有吸引力的技术平台+ 能够适应并大规模生成经基因修饰的T细胞，以识别其他细胞表面肿瘤相关抗原，且符合cGMP规范。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者感谢宾夕法尼亚大学的 Carl June 博士在生成和提供 aAPC 克隆 #4 方面提供的帮助，以及明尼苏达大学的 Perry Hackett 博士在 SB 系统方面提供的帮助。

基金支持：癌症中心核心资助（CA16672）；RO1（CA120956，CA124782，CA141303）；R33（CA116127）；P01（CA148600）；SPORE（CA136411）；Albert J Ward基金会；Burroughs Wellcome基金；Gillson Longenbaugh基金会；德克萨斯州癌症预防与研究所；CLL全球研究基金会；美国国防部；Noelan L. Bibler遗产；Harry T. Mangurian, Jr. 白血病免疫治疗基金；个性化癌症治疗研究所；白血病与淋巴瘤学会；淋巴瘤研究基金会；MDACC姊妹机构网络基金；Miller基金会；Herb Simons先生；Joe H. Scales先生及夫人；Thomas Scott先生；国家癌症研究基金会；儿科癌症研究基金会；细胞治疗生产援助项目（PACT）；William Lawrence与Blanche Hughes儿童基金会。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
表达GFP的DNA质粒（pmaxGFP）LonzaVPA-1002（试剂盒）
PBSSigmaD8537
CliniMACS PBS-EDTAMiltenyi Biotec70026
HyQ RPMI-1640赛默飞世尔科技SH30096.01
无酚红 RPMI-1640赛默飞世尔科技SH30605.01
Hyclone 胎牛血清赛默飞世尔科技SH3007003HI
GlutaMAX（100倍浓缩液）Gibco3505-061
Ficoll-PaqueGE Healthcare Biosciences17-1440-02
重组人IL-21PeproTechAF-200-21
重组人白细胞介素-2（Proleukin）诺华NDC 65483-116-07
人T细胞试剂盒（核转染溶液）LonzaVPA-1002
CliniMACS CD56 试剂Miltenyi70206
FITC标记的鼠源mAb，特异性识别人CD3BD Biosciences349201
与特异性识别人 CD4 的小鼠单克隆抗体偶联的 APCBD Biosciences340443
PerCPCy5.5 标记的鼠源抗人 CD8 单克隆抗体BD Biosciences341051
PE 偶联的 F(ab')2 山羊抗人 Fc 抗体片段γInvitrogenH10104
叠氮化钠SigmaS2002
一次性用品
12孔板康宁3513
T-75 cm²2 烧瓶康宁430641
培养袋Vue Life290°C；750°C
50 ml 离心管BD Biosciences352098
设备
Amaxa Nucleofector IILonzaAAB-1001
细胞计数仪Nexcelom BioscienceCellometer Vision
Sorvall Legend RT 离心机Sorvall75004377
BD FACS CaliburBD Biosciences342975
程序降温仪平面仪Kryo 750
辐照仪CIS bio InternationalIBL-437 C#09433
<表格 边框="1">
分子（内源性和外源性）的表达
细胞系通用名称细胞类型表达的分子
CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19克隆4K562CD86、CD64、CD137L、CD19、GFP 与膜结合型 IL-15 共表达

完全培养基（CCM） （4℃保存） °C，最长可达30天）
HyQ RPMI-1640/无酚红RPMI-1640
10% FBS
1% GlutaMAX

流式细胞术缓冲液 （4℃保存） °C，最长可达30天）
PBS
2% FBS
0.1% 叠氮化钠

参考文献

  1. Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116, 1035-1044 (2010).
  2. Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).
  3. Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. CARs on track in the clinic. Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).
  4. Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).
  5. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).
  6. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32, 756-767 (2010).
  7. Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies. Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).
  8. Williams, D. A. Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States. Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).
  9. Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes. Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).
  10. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
  11. Izsvak, Z., Ivics, Z. Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy. Mol Ther. 9, 147-156 (2004).
  12. Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).
  13. Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies. Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).
  14. Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).
  15. Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, 849-856 (2011).
  16. Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).
  17. Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity. Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).
  18. Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).
  19. Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).
  20. Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases. Cancer Res. 72, 271-281 (2012).
  21. Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).
  22. Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes. Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).
  23. Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies. Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).
  24. Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).
  25. Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells. Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

T T CAR aAPC

相关文章