本文介绍了一种同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案，该方法结合免疫荧光、DNA荧光原位杂交（DNA FISH），并进行三维显微成像与分析（3D 免疫-DNA FISH）。
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本文内容
摘要
摘要
利用 DNA 探针在三维保存的细胞核中进行荧光原位杂交，随后进行三维共聚焦显微镜观察（3D DNA FISH），是可视化单个细胞中基因位点、染色体亚区或整个染色体区域位置的最直接方法。此类分析可揭示细胞核的整体结构，以及特定基因组位点和区域在核空间内的行为。另一方面，免疫荧光技术可用于检测核蛋白（修饰组蛋白、组蛋白变体及其修饰酶、转录机器及因子、核亚区室等）。将免疫荧光与 3D DNA FISH 相结合的主要挑战在于：一方面需保持抗体所识别表位的完整性以及细胞核的三维结构，另一方面需允许 DNA 探针充分渗透以检测基因位点或染色体区域1-5。本文提供了一种将染色质修饰与基因组位点在三维保存的细胞核中同时可视化的实验方案。
引言
表观遗传机制可触发发育过程及特定细胞类型中转录谱的建立与遗传。在某一层面，该机制涉及染色质包装的调控，从而界定基因组的活跃或沉默区域。在更大尺度上，基因组的全局三维结构以及细胞核架构也在转录模式的调控中发挥重要作用。因此，解析这些表观基因组特征对于全面理解基因调控机制至关重要6-11。
免疫荧光与三维DNA荧光原位杂交（3D DNA FISH）相结合，为评估细胞核内DNA序列和/或蛋白质之间的特异性相互作用/关联提供了独特的机会，可补充分子与生化分析。此外，尽管染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）或染色体构象捕获结合深度测序（4C-seq、5C、Hi-C）等全基因组高通量技术可提供细胞群体的全局数据12，免疫荧光/DNA FISH技术则能够在单细胞水平上进行分析。
本文介绍一种通过免疫荧光联合DNA FISH技术，结合三维显微镜成像与分析（三维免疫-FISH）同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案。该方案的优势在于能够联合可视化DNA并保持蛋白质结构的完整性。我们在该领域的研究经验使我们得以改进并简化了现有的实验流程。尽管我们已将此方法用于检测正在进行重组的淋巴细胞中的DNA双链断裂，但该技术同样适用于其他蛋白质及其他细胞类型。
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方案
1. 使用荧光染料标记DNA探针：缺口平移法（约6小时）
- 可用于标记的模板包括：通过大量提取制备的BAC DNA、质粒或PCR产物，均需用H2O重悬。注意：为获得较强的FISH信号，探针应至少跨越10 kb。
- 在RNase A中37 °C孵育30分钟（所有试剂见表1）。
- 在16 °C下进行缺口平移反应2小时（见表2和表3）。也可采用其他直接标记方法（例如：FISH Tag，Invitrogen）。
- 在-80 °C下灭活反应1小时，或在-20 °C下过夜。
- 在2%琼脂糖凝胶上测定探针大小。条带应分布在100至1,000 bp之间，主要集中在约300–500 bp（注意：Cy5标记的探针条带不可见）。若DNA消化不足，可向反应体系中补充更多DNA聚合酶I和DNase I，并在16 °C下再孵育2小时。
- 将探针置于装有H2O的两升烧杯中，使用0.025 mm滤膜在避光条件下纯化2小时。
- 向探针中加入封闭因子，具体如下：每10 μg DNA探针加入10 μg Cot-1 DNA、10 μg Hybloc DNA和100 μg鲑精DNA。DNA探针储存于-20 °C。
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结果
DNA 和免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）被 Skok 实验室用于研究 B 细胞和 T 淋巴细胞发育过程中，抗原受体基因座 V(D)J 重组过程所伴随的细胞核内结构组织变化。上述技术使我们能够：i）测量基因座两端之间的距离（收缩程度）；ii）测量等位基因或基因座之间的距离（配对情况）；iii）分析基因座内部发生的 DNA 损伤；iv）评估等位基因和基因座相对于细胞核亚区室的位置关系（在本研究中为抑制性着丝粒周围异染色质）；以及 v）评估核蛋白在等位基因和基因座上的结合情况（在本研究中为磷酸化组蛋白 γ-H2AX 的结合）。特别是，我们分析了基因座动态变化在发育中 B 细胞免疫球蛋白基因座 V(D)J 重组调控中的作用17-30，以及在 CD4+ 与 CD8+ T 细胞谱系命运决定中的调控作用14。我们还评估了携带重组酶蛋白 RAG2 突变体的发育中 T 细胞内 T 细胞受体基因座之一 Tcra/d 上的 DNA 损伤情况31。
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讨论
上述技术已在本实验室用于分析发育中淋巴细胞中免疫球蛋白和Tcra/d位点V(D)J重组的调控机制30,31。我们确信该技术可经适当调整后用于检测不同细胞类型中的多种核蛋白、核区室及基因位点。实验方案可能需要进行优化，此时应重点关注以下几个主要步骤：首先，透化时间可根据细胞类型进行调整；其次，一抗孵育时间也可根据抗体质量和目标蛋白的丰度进行调整（例如，在某些情况下，可在4 °C下孵育过夜）。重要的是，变性步骤可进行调整，盐酸（HCl）处理可替换为甲酰胺3,4,34或氢氧化钠（NaOH）用于DNA FISH20。此外，仅针对DNA FISH，可在固定和透化后对细胞施加多次液氮冻融循环4,34。最后，尽管已有研究成功利用该方法检测多种组蛋白修饰、RNA聚合酶II及其共因子30,35，但针对其他核蛋白的免疫染色可在DNA FISH杂交后进行4。
三维图像分析可能涉及使用不同类型的显微镜，包括宽场落射荧光显微镜（结合去卷积技术.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Skok实验室的成员，特别是Susannah Hewitt，对本研究的讨论和意见。本工作由美国国立卫生研究院基金R01GM086852和RC1CA145746（J.A.S.）资助。J.A.S. 是白血病与淋巴瘤学会学者。J.C. 是癌症研究所Irvington研究所研究员。M.M. 获得美国国家科学基金会综合研究生教育与研究培训项目基金（NSF IGERT 0333389）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| H2O | 费舍尔 | # BP2470 | |
| RNase A | 西格玛 | # R4642 | |
| dNTP | 西格玛 | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | 英维特罗根 | # C11397 至 C-11401 | |
| Cy3 或 Cy5 dUTP | 费舍尔 | # 45-001-xxx | |
| DNase I | 罗氏 | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | 新英格兰生物实验室 | # M0209 | |
| 0.025 μm 滤膜 | 密理博 | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | 英维特罗根 | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | 应用遗传学 | # MHB | |
| 鲑鱼精DNA | 西格玛 | # D1626 | 粉末，需用 H2O 溶解至 10 mg/ml |
| NaAc（醋酸钠，pH 5.2，缓冲液） | 西格玛 | # S7899 | |
| Ficoll 400（分子生物学级） | 费舍尔 | # 525 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮（分子生物学级） | 费舍尔 | # BP431 | |
| 硫酸葡聚糖粉末 | 西格玛 | # D8906 | |
| SSPE（氯化钠-磷酸钠-EDTA）20× 溶液 | 费舍尔 | # BP1328 | |
| 甲酰胺 | 费舍尔 | # BP227 | |
| 盖玻片 | 费舍尔 | # 12-548-B | |
| 载玻片 | 费舍尔 | # 12-550 | |
| 6 孔板 | 费舍尔 | # 0720080 | |
| PBS，10× | 费舍尔 | # MT-46-013-CM | |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | 西格玛 | # P8920 | |
| 多聚甲醛微粒，95% | 西格玛 | # 441244 | |
| 曲拉通 X-100，分子生物学级 | 西格玛 | # T8787 | |
| BSA（牛血清白蛋白）第五组分 | 费舍尔 | # BP 1600 | |
| 正常山羊血清 | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20，分子生物学级 | 西格玛 | # P9416 | |
| SSC（柠檬酸钠-氯化钠）20× 溶液 | 费舍尔 | # BP1325 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | 英维特罗根 | # P36930 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | 西格玛 | # D9542 | |
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| 表 1. 特定试剂与小型设备 |
参考文献
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al.
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