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结合免疫荧光与DNA FISH技术对三维保存的间期细胞核进行分析以研究三维核结构的变化

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DOI：

10.3791/50087

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2013年2月3日

 ,  , 
1Department of Pathology, New York University School of Medicine, 2New York University Center for Health Informatics and Bioinformatics, 3NYU Cancer Institute, 4Department of Pathology and Yale Cancer Center, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案，该方法结合免疫荧光、DNA荧光原位杂交（DNA FISH），并进行三维显微成像与分析（3D 免疫-DNA FISH）。

摘要

利用 DNA 探针在三维保存的细胞核中进行荧光原位杂交，随后进行三维共聚焦显微镜观察（3D DNA FISH），是可视化单个细胞中基因位点、染色体亚区或整个染色体区域位置的最直接方法。此类分析可揭示细胞核的整体结构，以及特定基因组位点和区域在核空间内的行为。另一方面，免疫荧光技术可用于检测核蛋白（修饰组蛋白、组蛋白变体及其修饰酶、转录机器及因子、核亚区室等）。将免疫荧光与 3D DNA FISH 相结合的主要挑战在于：一方面需保持抗体所识别表位的完整性以及细胞核的三维结构，另一方面需允许 DNA 探针充分渗透以检测基因位点或染色体区域1-5。本文提供了一种将染色质修饰与基因组位点在三维保存的细胞核中同时可视化的实验方案。

引言

表观遗传机制可触发发育过程及特定细胞类型中转录谱的建立与遗传。在某一层面，该机制涉及染色质包装的调控，从而界定基因组的活跃或沉默区域。在更大尺度上，基因组的全局三维结构以及细胞核架构也在转录模式的调控中发挥重要作用。因此，解析这些表观基因组特征对于全面理解基因调控机制至关重要6-11。

免疫荧光与三维DNA荧光原位杂交（3D DNA FISH）相结合，为评估细胞核内DNA序列和/或蛋白质之间的特异性相互作用/关联提供了独特的机会，可补充分子与生化分析。此外，尽管染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）或染色体构象捕获结合深度测序（4C-seq、5C、Hi-C）等全基因组高通量技术可提供细胞群体的全局数据12，免疫荧光/DNA FISH技术则能够在单细胞水平上进行分析。

本文介绍一种通过免疫荧光联合DNA FISH技术，结合三维显微镜成像与分析（三维免疫-FISH）同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案。该方案的优势在于能够联合可视化DNA并保持蛋白质结构的完整性。我们在该领域的研究经验使我们得以改进并简化了现有的实验流程。尽管我们已将此方法用于检测正在进行重组的淋巴细胞中的DNA双链断裂，但该技术同样适用于其他蛋白质及其他细胞类型。

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方案

1. 使用荧光染料标记DNA探针：缺口平移法（约6小时）

  1. 可用于标记的模板包括：通过大量提取制备的BAC DNA、质粒或PCR产物，均需用H2O重悬。注意：为获得较强的FISH信号，探针应至少跨越10 kb。
  2. 在RNase A中37 °C孵育30分钟（所有试剂见表1）。
  3. 在16 °C下进行缺口平移反应2小时（见表2和表3）。也可采用其他直接标记方法（例如：FISH Tag，Invitrogen）。
  4. 在-80 °C下灭活反应1小时，或在-20 °C下过夜。
  5. 在2%琼脂糖凝胶上测定探针大小。条带应分布在100至1,000 bp之间，主要集中在约300–500 bp（注意：Cy5标记的探针条带不可见）。若DNA消化不足，可向反应体系中补充更多DNA聚合酶I和DNase I，并在16 °C下再孵育2小时。
  6. 将探针置于装有H2O的两升烧杯中，使用0.025 mm滤膜在避光条件下纯化2小时。
  7. 向探针中加入封闭因子，具体如下：每10 μg DNA探针加入10 μg Cot-1 DNA、10 μg Hybloc DNA和100 μg鲑精DNA。DNA探针储存于-20 °C。

2. 探针沉淀/变性/预退火（3-4 小时）

  1. 每个盖玻片使用 0.3 μg 至 1 μg 的 DNA 探针。将探针与 0.1 体积的 3M NaAc（pH 5.2）和 2.5 体积的 100% 乙醇混合，在 -80 °C 下孵育 1 小时或在 -20 °C 下过夜，随后在 4 °C 下以 13,000 rpm 离心 30 分钟。注意，DNA 探针的用量可根据 DNA 质量和杂交的核区域进行调整。采用其他直接标记方法可能允许减少探针用量。在同一张载玻片上检测多个 DNA FISH 信号时，不同探针可共同沉淀（不应预先退火的探针除外，例如重复序列）。同时进行的多个实验所用探针也可共同沉淀。沉淀物的颜色应根据所用荧光染料呈浅色（若探针量较少，沉淀可能不可见）。
  2. 将沉淀物干燥，并在避光条件下，于 37–45 °C 下使用 15 μl 杂交缓冲液（见表 4）每盖玻片重悬，轻轻振荡（使用 Eppendorf Thermomixer）约 20 分钟。
  3. 在 75–95 °C 下使探针变性 5 分钟。
  4. 在 37 °C 下预退火 30–60 分钟。预退火时间可根据探针的复杂性和质量进行调整。
  5. 将探针加入盖玻片，进行过夜杂交（见第 3 节）。

3. 三维 DNA FISH——第一天（约 3 小时）

  1. 将非贴壁细胞浓缩于少量1×PBS中（每张盖玻片约2×105个细胞，体积为5–10 μl 1×PBS），滴加至经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片中心。贴壁细胞应培养于盖玻片上至少24小时（约70%融合度）（盖玻片可用0.1%明胶包被）。将18×18至24×24 mm的方形盖玻片置于6孔板中，整个实验过程中每孔使用2 ml溶液（也可使用直径1.5 mm的圆形盖玻片，置于12/24孔板中）。
  2. 用含2%多聚甲醛的1×PBS（pH 7–7.4）在室温下固定细胞10分钟（4%多聚甲醛储备液可分装后于-20 °C保存）。多聚甲醛可购买现成溶液（16%），也可由粉末或颗粒配制成4%储备液。将多聚甲醛粉末溶于1×PBS中，温度需高于>60 °C（可将pH调至8–9以促进溶解），冰上冷却后调节pH至7–7.4，过滤，分装至离心管中，于-20 °C可保存数周。
  3. 用1×PBS洗涤三次后，在冰上用含0.4% Triton X-100的1×PBS冰浴处理5分钟以通透细胞。通透时间可根据细胞类型进行调整。注意：若DNA FISH与免疫荧光联合进行，应在本步骤进行免疫染色（见第4节）。
  4. 用1×PBS洗涤三次后，加入含0.1 μg/μl RNase A的1×PBS溶液，37 °C孵育1小时。将盖玻片细胞面向下置于涂有100 μl溶液的Parafilm或载玻片上，放入湿盒中。随后用镊子小心取下盖玻片。若遇阻力，应先用1×PBS浸润盖玻片，避免损伤细胞。
  5. 用1×PBS洗涤三次后，在冰上用含0.7% Triton X-100的0.1 M HCl冰浴处理10分钟以进一步通透细胞。
  6. 用1×PBS洗涤三次后，在室温下用1.9 M HCl处理30分钟以变性细胞DNA。或者，也可在50%甲酰胺/2×SSC溶液中75–80 °C处理至少30分钟进行变性。注意：杂交时间（及温度）可根据细胞类型进行优化。
  7. 用预冷的1×PBS洗涤三次后，在避光湿盒中，将盖玻片细胞面向下置于载玻片上15 μl探针液滴中，37 °C过夜杂交，并用橡胶胶水密封。

4. 三维免疫荧光原位杂交 - 第一天（约 6-7 小时）

  1. 对于联合免疫荧光与DNA FISH实验，免疫染色应在使用0.4% Triton-X-100进行透化处理后进行（步骤 3.3）。
  2. 在封闭液中室温孵育细胞30分钟（2.5% 牛血清白蛋白（BSA）、10% 正常山羊血清、0.1% Tween-20）。封闭液经过滤后分装至1.5 ml Eppendorf管中，可在-20 °C下保存数月。
  3. 将针对目标蛋白或组蛋白修饰的一抗用封闭液稀释后，在湿盒中室温孵育1小时。此处以抗H2AX丝氨酸-139磷酸化抗体（γ-H2AX，Millipore；详见表5）为例。将载玻片细胞面向下置于Parafilm或载玻片上100 μl溶液液滴中。随后用镊子小心取下载玻片（必要时可用1x PBS淹没）。注意：一抗的稀释比例和孵育时间可根据抗体质量和细胞类型进行调整。
  4. 用含0.2% BSA / 0.1% Tween-20 / 1x PBS的溶液在室温下振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗三次。
  5. 将合适的荧光标记二抗用封闭液稀释后，在避光湿盒中室温孵育1小时。此处以山羊抗小鼠二抗（Alexa Fluor 488 或 555，Invitrogen；详见表5）为例进行检测。也可使用半抗原标记的二抗（如生物素、地高辛等）。若使用此类二抗，可在过夜DNA-FISH杂交前后增加相应的检测步骤（如链霉亲和素、抗地高辛抗体等）。
  6. 在避光条件下，用含0.1% Tween-20 / 1x PBS的溶液在室温下振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗三次。
  7. 用含2% 甲醛/1x PBS的固定液在避光条件下室温固定细胞10分钟。
  8. 从RNase A孵育步骤开始继续进行DNA FISH操作（步骤 3.4）。

5. 三维DNA荧光原位杂交/免疫荧光原位杂交——第二天（约2小时）

  1. 小心去除橡胶胶水，用2x SSC淹没盖玻片，用镊子小心取下，并将其放入含有洗涤液的孔中。
  2. 在37 °C避光振荡条件下，用2x SSC洗涤细胞30分钟。
  3. 在室温避光振荡条件下，用2x SSC洗涤细胞30分钟。
  4. 在室温避光振荡条件下，用1x SSC洗涤细胞30分钟。注意：若使用甲酰胺进行变性，则应将洗涤步骤替换为以下操作：在50%甲酰胺/2x SSC中洗涤3次，在2x SSC中洗涤3次，每次5分钟，37 °C。
  5. 将细胞封片于含1.5 μg/ml DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）的ProLong Gold封片剂中，用于总DNA的复染。将盖玻片细胞面朝下置于载玻片上10–15 μl封片剂液滴中，并用指甲油封固。载玻片可在-20 °C保存数月。

6. 三维显微成像与分析

  1. 可以使用不同的显微镜系统获取三维图像。在我们的实验中，使用徕卡SP5 AOBS共聚焦系统（声光束分离器）采集光学切片，切片间距为0.3 μm。请注意，光学层面之间的间距可根据分析类型进行调整。
  2. 可以使用不同的软件和工具分析三维图像堆栈。我们使用Image J软件测量感兴趣位点之间的距离，并分析感兴趣位点与核内亚区室或蛋白质之间的不同类型的关联。
  3. 所有统计分析均用于比较两种（或多种）不同的生物学条件，并进行成对显著性评估：不同细胞类型或阶段之间的比较，不同感兴趣位点之间的比较。在所有统计检验中，P值 ≤ 5.00E-2（a = 0.05）被认为具有显著性（1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * 显著；1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 ** 极显著；P < 1.00E-3 *** 高度显著）。

两个等位基因间距离分布的统计学分析。我们首先在整个测得的等位基因间距离范围内构建累积分布频率曲线。为了评估实测等位基因间距离分布差异的显著性，我们采用非参数双样本 Kolmogorov-Smirnov（KS）检验13,14。

使用最优距离截断值对两个等位基因的紧密关联（即配对）进行统计分析。 为确定两个等位基因或位点间距离差异最显著的范围，我们采用一系列双尾 Fisher 精确检验。 15 即，在每个测量距离处，我们检验某一条件在两个样本间的较短距离上是否显著富集。该分布中的最小值 P-数值表示应被视为紧密关联距离阈值的范围（即 两个等位基因配对）的显著性。随后，采用双尾Fisher精确检验在确定的截断值处评估两个等位基因配对的显著性15对执行的 Fisher 检验总数进行多重检验校正 16.

目标位点与核内亚结构区室或蛋白质关联性的统计分析。采用双尾 Fisher 精确检验来分析目标位点与不同区室或蛋白质之间关联性的显著性15。

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结果

DNA 和免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）被 Skok 实验室用于研究 B 细胞和 T 淋巴细胞发育过程中，抗原受体基因座 V(D)J 重组过程所伴随的细胞核内结构组织变化。上述技术使我们能够：i）测量基因座两端之间的距离（收缩程度）；ii）测量等位基因或基因座之间的距离（配对情况）；iii）分析基因座内部发生的 DNA 损伤；iv）评估等位基因和基因座相对于细胞核亚区室的位置关系（在本研究中为抑制性着丝粒周围异染色质）；以及 v）评估核蛋白在等位基因和基因座上的结合情况（在本研究中为磷酸化组蛋白 γ-H2AX 的结合）。特别是，我们分析了基因座动态变化在发育中 B 细胞免疫球蛋白基因座 V(D)J 重组调控中的作用17-30，以及在 CD4+ 与 CD8+ T 细胞谱系命运决定中的调控作用14。我们还评估了携带重组酶蛋白 RAG2 突变体的发育中 T 细胞内 T 细胞受体基因座之一 Tcra/d 上的 DNA 损伤情况31。

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讨论

上述技术已在本实验室用于分析发育中淋巴细胞中免疫球蛋白和Tcra/d位点V(D)J重组的调控机制30,31。我们确信该技术可经适当调整后用于检测不同细胞类型中的多种核蛋白、核区室及基因位点。实验方案可能需要进行优化，此时应重点关注以下几个主要步骤：首先，透化时间可根据细胞类型进行调整；其次，一抗孵育时间也可根据抗体质量和目标蛋白的丰度进行调整（例如，在某些情况下，可在4 °C下孵育过夜）。重要的是，变性步骤可进行调整，盐酸（HCl）处理可替换为甲酰胺3,4,34或氢氧化钠（NaOH）用于DNA FISH20。此外，仅针对DNA FISH，可在固定和透化后对细胞施加多次液氮冻融循环4,34。最后，尽管已有研究成功利用该方法检测多种组蛋白修饰、RNA聚合酶II及其共因子30,35，但针对其他核蛋白的免疫染色可在DNA FISH杂交后进行4。

三维图像分析可能涉及使用不同类型的显微镜，包括宽场落射荧光显微镜（结合去卷积技术...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢Skok实验室的成员，特别是Susannah Hewitt，对本研究的讨论和意见。本工作由美国国立卫生研究院基金R01GM086852和RC1CA145746（J.A.S.）资助。J.A.S. 是白血病与淋巴瘤学会学者。J.C. 是癌症研究所Irvington研究所研究员。M.M. 获得美国国家科学基金会综合研究生教育与研究培训项目基金（NSF IGERT 0333389）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
H2O费舍尔# BP2470
RNase A西格玛# R4642
dNTP西格玛# DNTP100
Alexa dUTP英维特罗根# C11397 至 C-11401
Cy3 或 Cy5 dUTP费舍尔# 45-001-xxx
DNase I罗氏# 04536282001
DNA Pol I新英格兰生物实验室# M0209
0.025 μm 滤膜密理博# VSWP02500
Cot-1 DNA 1 mg/ml英维特罗根# 18440
Hybloc DNA 1 mg/ml应用遗传学# MHB
鲑鱼精DNA西格玛# D1626粉末，需用 H2O 溶解至 10 mg/ml
NaAc（醋酸钠，pH 5.2，缓冲液）西格玛# S7899
Ficoll 400（分子生物学级）费舍尔# 525
聚乙烯吡咯烷酮（分子生物学级）费舍尔# BP431
硫酸葡聚糖粉末西格玛# D8906
SSPE（氯化钠-磷酸钠-EDTA）20× 溶液费舍尔# BP1328
甲酰胺费舍尔# BP227
盖玻片费舍尔# 12-548-B
载玻片费舍尔# 12-550
6 孔板费舍尔# 0720080
PBS，10×费舍尔# MT-46-013-CM
聚-L-赖氨酸溶液西格玛# P8920
多聚甲醛微粒，95%西格玛# 441244
曲拉通 X-100，分子生物学级西格玛# T8787
BSA（牛血清白蛋白）第五组分费舍尔# BP 1600
正常山羊血清Vector Labs# S-1000
Tween-20，分子生物学级西格玛# P9416
SSC（柠檬酸钠-氯化钠）20× 溶液费舍尔# BP1325
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂英维特罗根# P36930
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）西格玛# D9542
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参考文献

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