方法文章

小鼠乳腺癌模型中肿瘤微环境对药物反应的活体成像

26.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/50088

⸱

2013年3月24日

 ,  , 
1Watson School of Biological Sciences, 2Cold Spring Harbor Laboratory, 3Departments of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital

本文内容

摘要

我们描述了一种用于成像抗肿瘤治疗反应的方法 体内 并在单细胞分辨率下。

摘要

肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展、转移以及对抗癌治疗的反应中起着关键作用。三维共培养系统常用于阐明肿瘤与间质之间的相互作用，包括它们在药物反应中的角色。然而，在完整微环境中的许多 体内 相互作用无法在这些 体外 系统中完全重现。因此，实时直接观察这些过程已成为理解肿瘤对治疗反应及识别可能影响这些反应的癌细胞与间质相互作用的重要工具。本文提供了一种利用旋转盘共聚焦显微镜对活体麻醉小鼠进行成像的方法，以直接观察在乳腺癌模型中给予全身治疗后药物的分布、癌细胞的反应以及肿瘤-间质相互作用的变化。我们描述了标记不同肿瘤组分、处理动物以观察治疗反应，以及暴露肿瘤组织进行长达40小时成像的手术操作步骤。通过本方案获得的结果为延时电影图像，其中药物渗透、癌细胞死亡和间质细胞迁移等过程可通过图像分析软件进行评估。

引言

实体瘤主要由两个部分组成：癌细胞以及有助于维持肿瘤生长适宜环境的间质成分（包括细胞和非细胞成分）1。这些间质成分在多种癌症（包括乳腺癌2-5）的发生、发展和转移过程中发挥着关键作用。间质微环境还会影响肿瘤对治疗的反应2,4,5。因此，明确癌细胞在完整微环境背景下对传统和新型疗法的反应，对于深入理解癌症生物学机制并改进现有治疗策略具有重要意义。此外，阐明治疗实施后癌细胞与间质相互作用的变化，对于理解肿瘤复发的生物学机制至关重要。

器官型共培养系统在研究肿瘤-间质相互作用方面具有重要作用6但显而易见的是，目前可用的方法尚无法成功重建完整的肿瘤微环境 体外 特别是关于血管功能以及免疫细胞的募集。事实上，所观察到的癌细胞对治疗的反应 体外 与所观察到的常常有显著差异 体内，其中微环境保持完整5因此， 体内 用于研究肿瘤-间质相互作用及其对治疗反应影响的模型可能更准确地反映临床相关机制7.

研究体内抗癌治疗反应的主要方法一直是通过测量肿瘤大小以及对来自治疗后动物或患者的组织进行组织学评估。in vivo 然而，过去二十年中显微镜技术和荧光报告系统的进步使得能够在活体、麻醉动物中以高分辨率可视化观察细胞间和细胞内的过程（活体成像）8。这些活体显微成像技术已被证明特别适用于在细胞和亚细胞分辨率下，从空间和时间维度解析肿瘤-基质相互作用的in vivo动态过程8,9。

通过活体成像技术揭示的生物学过程包括抗肿瘤T细胞的细胞毒性10,11、T细胞与髓系细胞之间的相互作用12、治疗后胶原成分与结构变化的动力学特征13、巨噬细胞依赖性的肿瘤细胞内渗及转移过程14，以及血管通透性15。

活体成像有三个主要要求：包括对组织进行适当的制备和暴露以供成像，对目标组织成分进行荧光标记，以及配备能够采集图像的显微镜-相机系统。16解决这些需求的最常用策略包括：1）异位制备（例如，耳部或眼眶接种），永久性成像窗口，或外置化制备例如，背侧皮肤瓣）；2）转基因荧光报告基因及荧光注射标记物用于标记组织组分；3）分别配备光电倍增管或电荷耦合器件（CCD）相机的多光子或共聚焦显微镜系统9我们采用外科手术制备的皮肤瓣模型，暴露表达荧光报告基因的麻醉动物腹股沟乳腺组织，用于成像。通过增强型CCD（ICCD）相机与四激光转盘共聚焦显微镜系统联用，持续采集12至40小时的图像。17以这种方式成像使我们能够研究诸如 体内 药物分布、阶段依赖性化疗反应、化疗诱导的细胞死亡类型以及髓系细胞行为5.

我们提供了一种在乳腺癌小鼠模型中进行活体成像的实验方案，用于观察癌细胞对抗癌治疗的反应以及肿瘤与间质之间的相互作用。该方案可用于在单次成像过程中长达40小时的时间内，利用多种转基因和可注射的荧光标记物，对转基因模型和移植模型中的癌细胞及间质成分的行为和死亡过程进行动态追踪。

方案

所述所有操作必须遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并须事先获得当地机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 用于成像的小鼠乳腺肿瘤的制备（转基因或原位移植）

  1. 使用基因工程小鼠模型生成用于成像的乳腺肿瘤例如 小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列[MMTV]-多瘤病毒中间T抗原[PyMT]或大鼠C3(1)启动子驱动的SV40大T抗原(Tag)[C3(1)-Tag]模型，或原位移植模型（同系、异系或异种移植）。
  2. 通过将基因工程模型与转基因报告基因品系杂交来标记癌细胞（例如 ACTB-ECFP）或使用 离体 原代癌细胞或细胞系的操作例如 转导）后进行移植。有关原位移植的示例方案，请参见 18.

2. 肿瘤微环境或亚细胞组分的可视化

  1. 利用转基因标记可视化肿瘤组分。将基因工程肿瘤模型与转基因报告小鼠杂交（例如 c-fms-EGFP 标记髓系细胞或 ACTB-H2B-EGFP 标记细胞核）或将此类小鼠用作移植标记组织的受体。这分别实现了对治疗过程中癌细胞与基质细胞相互作用的可视化，或与细胞死亡相关的细胞核变化的观察。
  2. 利用可注射材料可视化微环境。多种试剂（例如 荧光标记的抗体或化学染料可用于标记肿瘤的多种组分。根据染料的半衰期以及所关注的待追踪反应，可在成像开始前或成像过程中通过静脉注射给予注射剂i.v）或腹腔内（腹腔注射., 图1).

3. 显微镜和成像软件

  1. 显微镜。可采用多种显微镜系统和软件对活体小鼠进行成像。最常用的系统为共聚焦显微镜或双光子显微镜。我们使用配备ICCD相机（XR-Mega-10EX S-30，Stanford Photonics，Palo Alto，CA）的微透镜旋转盘共聚焦显微镜（Solamere Technologies，Salt Lake City，UT）。
  2. 成像软件。我们使用开源软件μManager（Vale Lab，加利福尼亚大学旧金山分校[UCSF]）。
  3. 图像分析。我们使用Imaris（Bitplane）、Volocity（PerkinElmer）和ImageJ（美国国立卫生研究院[National Institute of Health, NIH]）进行图像分析。

4. 动物成像前的（预）处理

  1. 使用本方案进行成像时，腹股沟乳腺肿瘤在卡尺测量其最长直径约为 8 mm 或更小时最为理想。
  2. 对于接受小分子抑制剂、治疗性抗体或化疗药物处理的动物，应根据实验需求在成像前或成像期间开始给药。例如，药物外渗及分布的成像需在成像开始后给予药物（视频 1 和 2），而由化疗药物阿霉素诱导的细胞死亡成像则在给药后 24 小时或更晚开始成像效果最佳（视频 3 和 4）。

5. 成像过程中维持动物水合状态和血液渗透压的生理盐水制备

  1. 用1 ml注射器吸取约1 ml的1×PBS。可在该溶液中加入碘化丙啶（PI，Invitrogen，1 mg/ml，按1:15稀释），在成像过程中定期通过腹腔注射（i.p.）给予。这将有助于对细胞膜通透性增加的死亡或濒死细胞的细胞核进行成像。PI在血管系统中的半衰期极短，因此必须在成像过程中反复给药。
  2. 将套管针输液装置（23号，¾英寸针头，12英寸管路）连接至该注射器，并推动液体通过管路，直至管路末端针尖处有盐溶液滴出。
  3. 将注射器从输液装置上取下，并用适当的盐溶液重新填充注射器。
  4. 将注射器重新连接至输液装置，注意避免在管路中引入气泡。

6. 异氟烷麻醉系统的准备

  1. 向雾化器中加入水并旋紧到位。这将对输送给动物的气体进行加湿，防止肺部受到刺激，并延长动物在长期麻醉状态下的存活时间。
  2. 将异氟烷储罐加满至顶部刻度线。注意：异氟烷是一种强效麻醉剂，也可能对研究人员产生影响。应配备适当的真空系统，以确保过量气体从操作区域中被清除。
  3. 打开氧气罐和氮气罐，并调节流量。氮气流量应约为 1.0 L/min，氧气流量应约为 0.2 L/min（约 21%）。
  4. 打开（自制）真空系统。真空流量应约为 1.2 L/min。
  5. 确认通往诱导室的麻醉管路处于打开状态，而通往手术区域和显微镜的管路处于关闭状态。
  6. 确认连接在麻醉系统上的乳胶呼吸袋已充气。如果呼吸袋无法充气，则应更换。
  7. 检查输送麻醉气体至显微镜载物台和手术平台的每个鼻罩上的橡胶隔膜。如果橡胶开始变薄，应及时更换。

7. 外科手术器械和手术平台的准备

  1. 打开高温珠灭菌器，并使其温度升至 >200 °C。
  2. 用肥皂和水清洗手术器械（用于切开动物皮肤的一把镊子[最好带齿]和一把剪刀，以及用于进一步暴露肿瘤的另一把镊子[最好为锯齿状]和一把剪刀）。
  3. 使用高温珠灭菌器对手术器械灭菌至少 30 秒（或者，手术器械也可预先进行高压灭菌）。
  4. 让手术器械冷却，同时注意避免污染已灭菌的器械。
  5. 取一个泡沫聚苯乙烯运输冷藏箱的盖子，作为手术平台。
  6. 在泡沫聚苯乙烯盖子上放置一块实验用吸水垫（大小足以覆盖整个盖子）。
  7. 用实验室胶带（1" 宽胶带效果最佳）将连接麻醉系统的鼻罩导管固定在吸水垫上。在鼻罩两侧，将一根 18 G ×1½" 针头穿过胶带插入泡沫聚苯乙烯盖中，以确保鼻罩固定牢固。
  8. 准备好碘伏、无菌纱布、两片 70% 异丙醇擦拭片、一张显微镜载玻片、Krazy Glue 胶水以及 4 段实验室胶带（½" 宽）备用。

8. 显微镜的准备

  1. 打开显微镜、相机以及运行显微镜的计算机。
  2. 开启加热垫。
  3. 若使用倒置显微镜，应设计一个定制的载物台插入件，其成像孔需与腹股沟乳腺的位置相对应。用肥皂和水彻底清洁载物台插入件并晾干。使用实验室胶带（½英寸宽效果最佳）将盖玻片（#1.5厚度）固定在成像孔上，并用70%异丙醇清洁整个表面。用无菌纱布覆盖载物台，以防污染。将载物台插入件放置于载物台上，并使其自然风干。
  4. 撕取4至6段实验室胶带（1英寸宽），每段长约6英寸，并将其粘贴在显微镜侧面。这些胶带将用于固定向动物输送麻醉气体的鼻罩并将其固定到位。
  5. 再撕取两段胶带（½英寸宽），每段长约1英寸。这些胶带将用于固定向小鼠输注PBS的蝴蝶针头以及用于暴露肿瘤的显微镜载玻片。

9. 暴露腹股沟乳腺用于成像

  1. 使用4%异氟烷、21%氧气及平衡氮气（载气流速约为1.0 L/min）在诱导室中对动物进行麻醉，过程应持续2-4分钟。
  2. 当小鼠呼吸深而缓慢、腹面朝上时，将其转移至手术平台。先打开麻醉气体通往手术平台的通路，再关闭通往诱导室的通路，按此顺序操作以避免麻醉系统内压力过高。此时将异氟烷浓度从4%降至2.5%。
  3. 通过脚掌夹捏测试检查足底退缩反射，以确认动物已达到手术所需的麻醉深度。若动物对脚掌夹捏无反应（例如无抽搐或卷尾），则表明麻醉充分。若动物有反应，应提高异氟烷浓度。
  4. 使用实验室胶带（½"胶带效果最佳）将小鼠四肢固定于手术平台上。
  5. （可选）动物固定于手术平台后，可使用电动剃毛器去除腹面毛发。若采用化学脱毛法，应在手术前24-48小时进行。术前去除毛发有助于防止成像部位污染，因为散落的毛发可能引发强烈且急性的免疫反应。
  6. 使用70%异丙醇擦拭片和碘伏对动物腹面进行消毒。
  7. 使用第一套无菌剪刀和带齿镊子，在腹中线处做一皮下切口，切口方向从尿道上方约3 mm处延伸至剑突。操作时注意避免刺破或切穿腹膜。
  8. 使用第二套无菌剪刀和锯齿镊子，轻柔地将带有腹股沟乳腺的皮肤从腹膜腔分离。
  9. 取一片玻璃显微镜载玻片，将其紧贴上一步骤中形成的皮瓣放置。调整载玻片位置，使肿瘤主体在小鼠置于成像平台时能够平放，且不影响后肢活动。
  10. 待载玻片位置调整妥当后，使用速干胶（例如，Krazy Glue）将载玻片粘附于皮肤外表面。

10. 将小鼠放置在载物台上

  1. 移除固定动物四肢于手术平台上的实验室胶带。
  2. 打开麻醉管线通往显微镜载物台的通道，并按此顺序关闭通往手术平台的麻醉管线。
  3. 迅速将动物转移到显微镜载物台上。
  4. 动物转移完毕后，正确放置并固定麻醉管路和鼻罩（使用 例如 用实验室胶带固定，以确保小鼠保持麻醉状态并处于舒适的位置。
  5. 暴露肿瘤，使其位于显微镜载物台上覆盖有盖玻片的成像孔的中央顶部位置。
  6. 使用目镜确认肿瘤位置正确，然后轻轻用胶带固定载玻片。固定时应保持松紧适度，以免阻碍组织的血液供应。固定载玻片有助于减少动物呼吸造成的成像伪影。
  7. 将带有蝶形输液装置的留置腹腔导管连接至已准备好的1 ml注射器（内含无菌1×PBS或生理盐水，可选含PI等染料，按步骤#5配制），注入动物体内 100 μl 当 腹腔注射。插入导管。从此时点直至成像结束，向动物注射 50 μl 生理盐水，每1小时一次（或 25 μl 每30分钟用含PI的生理盐水处理一次。
  8. 为了监测动物的生命体征，连接血氧饱和度仪探头（例如 Starr Life Sciences, Inc. 公司的 MouseOx 系统19.
  9. 用加热毯覆盖小鼠以防止低体温。

11. 图像采集

开源软件 μManager（Vale 实验室，UCSF）用于获取延时成像图像。原始数据在 Imaris（Bitplane）软件中进行整合，可由独立观察者手动评分，或在 Imaris 或其他图像分析软件中进行分析例如 Volocity [PerkinElmer] 或 ImageJ [NIH]

12. 安乐死

在图像采集结束时（根据所分析的过程类型，通常为1-40小时），处死动物。

  1. 异氟烷浓度增加至 4%。
  2. 观察动物直至其停止呼吸后 30 秒，然后将其从操作台移除。
  3. 进行颈椎脱位以确认动物已被安乐死。

13. 代表性结果

采用该方法进行活体成像可直接观察多种生物学过程，包括药物向肿瘤的递送、药物到达肿瘤后的血管外渗及分布、治疗后细胞死亡情况，以及细胞死亡引发的肿瘤-基质相互作用5。为了观察药物到达肿瘤及其在渗出至肿瘤组织后的分布情况，可在持续采集图像的同时对动物进行注射。尽管多种化疗药物具有微弱荧光（如阿霉素），但大多数药物并不具备荧光特性。荧光标记的葡聚糖可作为药物递送和组织扩散的替代标记物。图2 和 电影1 展示了经尾静脉（i.v.）注射荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的2 MDa葡聚糖（Invitrogen，1 mg/ml 1xPBS）后，其进入MMTV-PyMT;ACTB-ECFP小鼠肿瘤的过程。

药物到达肿瘤后，可通过成像观察其在组织中的渗出和扩散过程，以确定药物的血管内半衰期及分布情况5。影片2展示了将Alexa Fluor-647标记的10 kD葡聚糖（Invitrogen，1 mg/ml溶于1 × PBS）经i.v.注射至C3(1)-Tag;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP小鼠体内后，在成像过程中观察到的渗出与分布情况。在Imaris（Bitplane）软件中生成延时成像视频后，对血管内半衰期和药物分布进行定量分析。为测定血管内半衰期，计算每个时间点肿瘤血管内的平均荧光强度，并将其对时间作图。药物分布则以药物阳性区域占肿瘤总面积的百分比进行量化。

除了追踪药物向肿瘤递送的动力学过程外，确定肿瘤对治疗的反应也常常至关重要。由于抗癌疗法预期会诱导细胞死亡，因此可以使用碘化丙啶（PI）染色或细胞核结构变化作为药物诱导细胞死亡的标志物5。图3展示了在MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP小鼠中，肿瘤对细胞毒性化疗药物阿霉素的反应。在此三重转基因MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP动物模型中，ECFP标记乳腺癌细胞（蓝色），EGFP标记髓系细胞（绿色）。本次成像实验所用动物在成像开始前18小时接受了阿霉素给药，并在成像过程中按上述方法通过腹腔注射（i.p.）给予PI。癌细胞（ACTB-ECFP标记）呈蓝色，而死亡或濒死细胞则呈红色（PI染色）。本时间序列图像显示了阿霉素依赖性细胞死亡随时间的诱导过程。为了定量分析肿瘤中细胞死亡的诱导情况，采用与药物分布分析相同类型的分析方法，其定量输出结果为PI阳性区域占肿瘤总面积的百分比。

高倍成像可提供有关癌细胞所经历的细胞死亡类型的信息5视频3展示了通过成像实验追踪阿霉素全身治疗后典型的凋亡性细胞死亡过程中细胞核变化的结果。为实现细胞核可视化，本次成像所用动物携带ACTB-H2B-EGFP报告基因而非c-fms-EGFP报告基因，因此癌细胞的细胞核呈绿色标记。该MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;ACTB-H2B-EGFP动物接受了阿霉素（8 mg/kg，溶于1×PBS）治疗。 i.p. 在拍摄电影前24小时开始，每小时注射一次含PI的1×PBS（Invitrogen，1 mg/ml溶液按1:15稀释）。可在发生凋亡的细胞中观察到癌细胞核的结构变化，其邻近为发生坏死的细胞（PI阳性细胞，核形态无明显改变）。由于摄取PI染色，凋亡细胞的细胞核最终变为红色（未展示）。根据每个时间点的PI阳性信号及核形态，人工定量统计坏死和凋亡事件的数量。

化疗诱导的癌细胞死亡通常会导致免疫细胞被反应性地招募至肿瘤中2,4,5. 图 4 展示了这种基质对阿霉素急性治疗的反应示例。本实验中成像的 MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP 小鼠接受了阿霉素（8 mg/kg，溶于 1×PBS）处理 腹腔注射约在成像开始前20小时，并接受每小时一次的PI注射 腹腔注射实验期间用于观察细胞死亡。所示时间表示阿霉素处理后的小时数，比例尺代表 100 μm在此实验中，髓系细胞浸润至细胞死亡区域，如白色箭头所示。为量化阿霉素给药后髓系细胞向肿瘤的浸润情况，采用与测定药物分布及肿瘤对化疗反应相同类型的分析方法，其定量输出结果为EGFP阳性区域占肿瘤总面积的百分比。

除了可视化化疗对间质的整体反应外，还可以可视化特定的间质反应。5视频4展示了邻近细胞对坏死细胞物质的吞噬过程。可见含有完整绿色细胞核（典型巨噬细胞特征）的细胞正在摄取红色的细胞核物质。本次成像所用的MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;ACTB-H2B-EGFP动物模型接受了多柔比星（8 mg/kg，溶于1×PBS）处理 腹腔注射在电影开始前24小时，动物每小时注射一次含PI的1×PBS（Invitrogen，1 mg/ml溶液按1:15稀释）。细胞核（ACTB-EGFP标记）呈绿色，当细胞发生坏死时则变为红色。

显示 ACTB-ECFP、c-fms-EGFP 转基因标记和 PI 注射的荧光显微镜图像。
图 1. 利用转基因和可注射标记物对不同肿瘤组分进行示例性标记。 该动物为三重转基因 MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP 模型，其中癌细胞通过表达 ECFP 呈蓝色标记，髓系细胞通过髓系特异性启动子驱动的 EGFP 表达呈绿色标记。在成像过程中向动物注射了碘化丙啶（PI，红色，1×PBS 中约 0.07 mg/ml），以显示细胞死亡。PI 可标记 DNA，但仅能穿透死亡或濒死细胞的细胞膜。比例尺 = 100 μm。

ACTB-ECFP 的延时显微成像显示 2 MD 右旋糖酐扩散；荧光成像分析。
图 2. 药物在肿瘤中的渗出与分布。 在该双转基因 MMTV-PyMT;ACTB-ECFP 动物模型中，癌细胞通过表达 ECFP 被标记为蓝色，成像过程中注射了 FITC 标记的 2 MD 右旋糖酐（绿色），以可视化药物经 i.v. 注射后如何到达肿瘤组织（蓝色）。图中标注了成像开始后的时间。比例尺 = 100 μm。

Fluorescence microscopy of ACTB-ECFP, c-fms-EGFP, and PI over time; cell death progression.
图3. 癌细胞对全身治疗的反应 一个 MMTV-PyMT；ACTB-ECFP；c-fms-EGFP 动物在成像前接受化疗药物阿霉素处理，并注射 PI（红色，~0.07 mg/ml 溶于 1×PBS）以标记细胞死亡。该图像序列显示了 PI 染色随时间的累积（如白色箭头所示），代表阿霉素处理后细胞死亡的诱导过程。所示时间为阿霉素处理后的时间。图像为包含三个 z 轴层面的 z 层扫描最大强度投影。比例尺 = 100 μm.

荧光显微镜结果，ACTB-ECFP、c-fms-EGFP、碘化丙啶，持续24-28小时。
图4. 在给予阿霉素治疗20小时后成像的MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP三重转基因小鼠中，髓系细胞对化疗的反应。 该小鼠每小时接受一次腹腔（i.p.）注射碘化丙啶（PI，红色，~0.07 mg/ml溶于1×PBS），用于标记死亡细胞。此图像序列显示了阿霉素处理后，EGFP阳性髓系细胞（如白色箭头所示）随时间逐渐聚集的过程。已有研究表明，这种反应性免疫应答会阻碍多种类型化疗药物的治疗效果4,5。图中所示时间为阿霉素处理后的时长。图像为沿z轴包含三幅图像的z层扫描序列的最大强度投影。比例尺 = 100 μm。

视频1. 药物递送至肿瘤 这是一只双转基因MMTV-PyMT;ACTB-ECFP动物模型，其癌细胞通过表达ECFP标记为蓝色。在成像过程中，向该动物注射了2 MD的FITC偶联葡聚糖（绿色），以观察药物在肿瘤中的分布情况 i.v. 注射。比例尺 = 100 μm. 点击此处观看视频.

视频 2. 药物渗透进入肿瘤组织。 在一只三重转基因 C3(1)-Tag;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP 小鼠中，癌细胞通过表达 ECFP 标记为蓝色，髓系细胞通过表达 EGFP 标记为绿色，经 i.v. 注射 Alexa Fluor 647 标记的 10 kD 右旋糖酐（红色）。图像显示注射右旋糖酐后立即观察的视野。右旋糖酐最初标记血管系统，迅速渗出至肿瘤组织中，最终被巨噬细胞摄取。比例尺 = 100 μm。 点击此处观看视频。

影片3. 化疗诱导细胞死亡后细胞核变化的成像 这只三重转基因MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;H2B-EGFP动物在成像前注射了多柔比星。通过H2B-EGFP融合蛋白的表达所追踪的细胞核形态（绿色），可直接显示化疗诱导的典型凋亡性细胞核结构改变，如右上角细胞所示。该动物每半小时接受一次处理。 腹腔注射注射PI（红色）以标记整个成像过程中死亡和濒死细胞。所示时间为阿霉素处理后24小时。图像使用高倍物镜（40倍，数值孔径1.1，水镜）采集。比例尺 = 15 μm. 点击此处观看视频.

视频4. 化疗诱导细胞死亡后细胞核变化及死亡细胞物质摄取的成像 该三重转基因 MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;H2B-EGFP 动物在成像前注射了多柔比星。通过 H2B-EGFP 融合蛋白的表达追踪细胞核形态（绿色），可直接观察化疗诱导的细胞核结构变化。该动物每半小时接受一次处理 腹腔注射注射碘化丙啶（PI，红色）以标记整个成像过程中死亡和濒死的细胞。图像使用高倍物镜（40倍，数值孔径1.1，水镜）采集。在PI标记前未见显著结构变化，而核形态改变及GFP信号丢失提示细胞发生类似坏死的死亡方式。可见死亡物质被一个具有大细胞核的细胞所摄取，该特征典型地属于巨噬细胞。所示时间表示阿霉素处理后+24小时。比例尺 = 10 μm. 单击此处观看视频.

讨论

肿瘤对全身治疗的 体内 反应可能与癌细胞的 体外 反应显著不同，因为微环境会影响急性反应和复发过程5。阐明 体内 化疗耐药通路的最大障碍之一，是癌细胞与其微环境之间相互作用的复杂性。特别是，由于实体瘤已形成癌细胞与间质细胞之间的平衡，任一组分的扰动（例如抗癌治疗过程中发生的细胞死亡）都可能对组织结构产生显著影响。

本文提供的活体成像技术可实现对活体麻醉小鼠在抗肿瘤药物治疗过程中肿瘤内癌细胞与间质相互作用的直接可视化观察。我们采用转盘共聚焦显微镜，该技术穿透深度相对有限（见17），但本研究所述的手术与标记技术可与其他类型的显微镜联用。通过这些实验获取的动态影像可用于追踪多种生物学过程，包括荧光强度的变化（例如，因标记细胞群体的浸润或细胞死亡的诱导所致）、细胞运动性、注射物质的分布（例如，用于追踪血管渗漏）以及荧光信号的共定位5,12,17,20。

我们 routinely 对小鼠进行超过6小时的成像，也曾进行超过18小时的成像。这需要在如此长的时间内持续维持小鼠处于麻醉状态。在适当的麻醉条件下，超过90%的动物可存活6小时，约80%可存活超过18小时。有关如何实施长期麻醉的详细方法此前已有发表19。根据我们的经验，有五个因素至关重要：避免低体温、避免脱水、维持生理性的血液氧饱和度、使用加湿的异氟烷载气，以及将动物维持在不表现出疼痛体征的最低麻醉水平。为维持体温，我们将小鼠置于加热毯（38 °C）上。为防止脱水，我们在整个成像过程中定期通过腹腔注射（i.p.）给予少量生理盐水。为维持生理性的血液氧饱和度，我们以载气中21%的氧气浓度开始（而非常用的100%）。这使得我们在实验进行数小时后，若发现小鼠血氧饱和度下降，可及时提高吸入氧浓度。根据我们的经验，此时提高吸入氧浓度（例如至30–40%）几乎总能稳定动物状态，从而实现额外数小时的成像。对于大多数小鼠，最佳麻醉水平可通过1–1.5%异氟烷实现，对应呼吸频率为60–65次/分钟，脉搏频率为400–450次/分钟。在我们的成像实验中，主要使用转基因小鼠模型（MMTV-PyMT 和 C3[1]-Tag），这些模型中的肿瘤呈多灶性，可在单次成像过程中于多个 x、y 位置平行观察处于肿瘤进展不同阶段的多个病灶。这降低了在旨在识别阶段依赖性治疗反应的实验中因个体小鼠间差异带来的影响，同时减少了成像所需的动物数量。

MMTV-PyMT 模型（以及其他自发性癌症模型）会经历可识别的渐进性组织病理学阶段，这些阶段可在活体成像过程中被观察到，尽管活体成像期间对肿瘤病变进行的病理分期与组织学切片相比存在差异，且详细程度较低5,17。相比之下，移植模型通常最能反映晚期肿瘤，因为癌细胞通常来源于进展期肿瘤。因此，这类模型更适合研究晚期肿瘤中的肿瘤-间质相互作用，而非不同阶段之间这些相互作用的差异。

我们展示了如何对治疗诱导的细胞死亡后发生的细胞核结构变化进行成像的示例。在未进行抗癌治疗的情况下，该标记策略可用于对细胞分裂进行成像。 原位， 例如，阐明细胞增殖与休眠如何受到微环境的影响。未来，对线粒体组分进行荧光标记可能使成像细胞凋亡过程中发生的线粒体变化成为可能。

在本方案中，我们还展示了如何对治疗后癌细胞与免疫细胞相互作用进行成像的示例，但其他微环境组分也可被可视化并成像。目前已有的用于基质组分的转基因报告基因品系包括成纤维细胞（例如，FSP1-EGFP17，αSMA-RFP21，COL1A1-EGFP21）或血管系统细胞（例如，Tie2-GFP22；VEGF-GFP23）。

活体成像可实现对发生于体内的相互作用与过程进行实时可视化观察 体内 化疗给药后。利用目前可用的技术，我们已在理解髓系细胞如何影响治疗反应方面取得了重大进展；然而，由于肿瘤微环境极为复杂，仍需进一步的重大突破，才能从机制上深入探究环境介导的耐药过程。其中最迫切需要的重要进展之一，是鉴定出更特异的特定细胞群体标志物。这一点在乳腺肿瘤微环境中两种最主要的间质细胞成分——成纤维细胞和免疫细胞——中表现得尤为突出。α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）常被用于鉴定成纤维细胞，但该蛋白也在血管平滑肌细胞和肌上皮细胞中表达。24因此，尽管存在αSMA-GFP报告小鼠，但在活体成像实验中确定所追踪的具体细胞类型仍具有挑战性。同样，在c-fms启动子驱动下表达的单一荧光标记物（如EGFP）通常会标记出多种免疫细胞亚群。12,17因此，尽管理想情况下希望使用单一标记物来鉴定特定细胞类型，但基础生物学的复杂性为采用这种方法带来了重大挑战。

解决这一问题的一种部分方案是使用可注射标记物，以进一步区分表达相同荧光报告基因的不同细胞亚群。例如，荧光葡聚糖可被巨噬细胞摄取，可用于标记由 c-fms-EGFP 和 Fsp1-EGFP 转基因报告小鼠所标记的巨噬细胞亚群17与荧光探针偶联的抗体也已被用于鉴定特定亚群（例如 由c-fms-EGFP报告基因标记的Gr1阳性髓系细胞群体17).

与通过游标卡尺测量生成的肿瘤反应曲线相比，后者无法提供关于肿瘤为何及如何对治疗产生反应的机制性信息，或依赖于在不同时间点采集组织获得的组织学系列，而后者需要大量动物实验群体；我们的技术则能够在小规模动物群体中直接提供细胞死亡动态以及基质细胞与癌细胞相互作用的可量化信息。因此，采用本报告所述方法的优势在于，它能在完整肿瘤微环境的背景下实时提供药物反应的动态信息。此类信息有助于深入理解驱动治疗反应的潜在生物学过程5。

披露

作者声明无利益冲突。所有动物实验均依照 IACUC 批准的方案进行。

致谢

感谢 J. Cappellani 和 J. Qiu 提供的技术支持。本研究由美国国家癌症研究所（U01 CA141451）、Starr 癌症联合会、Susan G. Komen for the Cure、长岛抗击乳腺癌两日步行活动、Manhasset 妇女抗癌联盟资助给 M.E. 的经费，以及美国国会指定乳腺癌研究计划向 E.S.N. 提供的博士前奖学金资助。E.S.N. 还获得了冷泉港实验室沃森生物科学学院的 Leslie C. Quick 和 William Randolph Hearst 基金会奖学金。H.A.A. 的研究得到了挪威研究理事会（160698/V40 和 151882）以及挪威东南部地区卫生当局（2007060）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
MMTV-PyMT 小鼠Jackson Laboratory2374
C3(1)-Tag 小鼠Jackson Laboratory13591
ACTB-ECFP 小鼠Jackson Laboratory3773
ACTB-H2B-EGFP 小鼠Jackson Laboratory5418
1 × PBS实验室自制
2 MD 葡聚糖，荧光素标记InvitrogenD-7137用 dH2O 重悬至 4 mg/mL（-20 °C 保存）；使用前用 1 × PBS 稀释至 1 mg/mL
10 kD 葡聚糖，Alexa Fluor 647 标记InvitrogenD-22914用 dH2O 重悬至 4 mg/mL（-20 °C 保存）；使用前用 1 × PBS 稀释至 1 mg/mL
盐酸多柔比星Sigma-Aldrich44583用 dH2O 溶解并 4 °C 保存；使用前用 1 × PBS 稀释
异氟烷（Isothesia）Butler Animal Health Supply029450250 ml
碘化丙啶InvitrogenP35661 mg/mL；用 1 × PBS 稀释 1:15
氮气
氧气
设备
18G × 1½" 标准斜面针头BD305196
μManagerVale Lab, UCSFwww.micro-manager.org开源软件
酒精棉片BD32689570% 异丙醇棉片
麻醉系统Molecular Imaging Products, Co.
盖玻片Corning2940-245No. 1½，24×50 mm；使用 70% 异丙醇擦拭消毒
Curity 纱布海绵（无菌）Kendall6939
载玻片Corning2948-75x25预清洁；若未预清洁，使用 70% 异丙醇擦拭消毒
硬化精细剪刀Fine Science Tools14090-112 把；不锈钢，尖-尖头，直头，26 mm 刃长，11 cm 总长
加热毯Gaymar Industries
热珠灭菌器Fine Science Tools18000-45使用前约 30 分钟开启；在 >200 °C 下灭菌 30 秒
ImarisBitplanewww.bitplane.com
Krazy GlueElmer’s ProductsKG484
实验室胶带（½"）
实验室胶带（1"）
泡沫聚苯乙烯运输箱的盖子将用作手术平台
显微解剖镊RobozRS-51531×2 齿，轻微弯曲，0.8 mm 尖端宽度，4" 长
显微解剖镊RobozRS-5135带齿，轻微弯曲，0.8 mm 尖端宽度，4" 长
显微镜转盘共聚焦显微镜，XYZ 压电载物台，具备落射荧光功能17,25
显微镜载物台插件Applied Scientific Instrumentation定制加工，带两个圆形成像窗口
MouseOx 血氧仪、软件及传感器STARR Life Scienceswww.starrlifesciences.com
Nalgene Super Versi-Dry 实验室吸水垫Thermo Scientific74218-00切成四等份，用于铺垫手术平台
雾化器Salter Labs8901用于加湿气体；防止肺组织刺激
滑动式一次性结核菌素注射器（1 ml）BD309659
带翼输液套件（Surflo）TerumoSV-23BLK23G × ¾" 超细针头，12" 管路
聚维酮碘喷雾剂Purdue PharmaBASP3H

参考文献

  1. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
  2. Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
  3. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
  4. DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
  6. Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
  7. Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
  8. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  9. Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
  10. Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
  11. Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
  12. Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
  13. Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
  14. Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
  15. Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
  16. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
  17. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
  18. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716(2011).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563(2011).
  20. Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
  21. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  22. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
  23. Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
  24. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
  25. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97(2011).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章