冷冻切片酵母群落以观察荧光模式

摘要

我们介绍一种用于冷冻和冷冻切片酵母群落以观察荧光细胞内部分布模式的方案。该方法通过甲醇固定和OCT包埋，可在保持群落内细胞空间分布的同时，避免使荧光蛋白失活。

摘要

微生物通常以群落形式生存。群落内细胞的空间组织被认为会影响群落的生存与功能¹。光学切片技术，包括共聚焦显微镜和双光子显微镜，已被证明可用于观察细菌和古菌群落的空间结构^2,3。结合共聚焦成像与酵母菌落的物理切片，已揭示出细胞的内部组织结构⁴。然而，使用共聚焦或双光子显微镜进行直接光学切片仅能深入酵母菌落数个细胞层。这一限制可能是由于酵母细胞对光的强烈散射所致⁴。

本文介绍一种基于固定和冷冻切片的方法，用于获取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）群体内荧光细胞的空间分布。我们采用甲醇作为固定剂，以保持细胞的空间分布结构。固定后的群体经OCT包埋剂浸润、冷冻，并在恒冷切片机中进行冷冻切片。对切片进行荧光成像，可揭示群体内部荧光细胞的组织结构。

表达红色和绿色荧光蛋白的酵母菌株所组成的酵母群落示例，展示了冷冻切片法在揭示酵母菌落中荧光细胞空间分布以及基因表达分布方面的潜力^2,3。尽管我们的研究重点是Saccharomyces cerevisiae群落，但该方法也可望用于研究其他微生物群落。

方案

1. 固定酵母群落

1. 在膜滤器上培养酵母群落（例如，Millipore MF 膜滤器； 图2A）。该方案对应于一个少于 2x10 的典型群落⁸ 6 mm直径膜滤器上的细胞
2. 使用一张直径为1 cm的Whatman 541滤纸覆盖直径为1 cm的孔底部（图2B）。此Whatman滤纸将在后续步骤中用作转移菌群的载体。向孔中加入1 ml 100%甲醇，并将孔板置于-20 °C环境中，使其温度平衡。
3. 加入液氮₂ 在杜瓦瓶中，将样品浸入液氮中至少15秒，以冻结样品₂ 使用镊子（图2C).
4. 将冻存的菌群转移至含有 -20 °C 甲醇的孔中图 2D）。将膜组件浸入甲醇时，确保其保持水平。静置 20 分钟。MF 膜滤器在甲醇中开始解离。
5. 将群落通过载体Whatman 541滤纸从甲醇孔转移至置于-20 °C的冷培养皿中，以挥发甲醇（图2E转移时，将菌落保留在载体Whatman滤膜上，在放入冷的培养皿前，用另一块厚的Whatman滤纸吸去多余的甲醇液滴。这将确保各样本之间的蒸发时间保持一致。
6. 等待4-6小时使溶剂挥发，直至载膜Whatman滤膜看起来干燥。挥发不充分会残留甲醇，干扰切片过程；过度干燥则会导致菌群出现裂纹和变形。
7. 从 -20 °C 冰箱中取出样品。剪去未被群落覆盖的 Whatman 541 滤纸部分。
8. 制作一个长方体铝箔容器，其尺寸需足够大，使样品与容器每侧之间至少留有约 2 mm 的边距图 2F将群落置于铝箔容器的底面，立即用OCT包埋液覆盖样本，使其高出群落3~4 mm。如有需要，可在此步骤中根据容器的边缘调整样本的方向。静置10分钟。
9. 将OCT包埋的样本置于干冰上的金属板中进行速冻。将冻存的样本保存于-20 °C或-80 °C冰箱中。

2. 冷冻样品切片用于荧光成像

1. 将冷冻切片机腔室的温度设置为 -25 °C，并将样品置于腔室内，直至其温度与腔室温度一致。
2. 在冷冻载具上滴加一滴OCT包埋剂，然后将样品固定于其上。使用暴露的Whatman滤纸（容器底部）将OCT均匀涂抹在样品侧面，使OCT厚度达到2-3 mm。在切片前，让OCT在冷冻切片机腔室内完全冻结。确保样品四周保留2-3 mm的OCT边缘，有助于维持切片的完整性。
3. OCT样品块的侧面可用于样品的对齐。如果样品相对于刀片未对准，切片将从样品的某一角或一侧开始。调整载具位置，确保刀片能够垂直（或水平）切割样品块的表面。
4. 酵母群落的典型切片厚度约为14 μm。切下一片后，用室温下的载玻片缓慢接近切片以收集之。切片会融化并转移至载玻片上。每张载玻片最多可转移18个切片。
5. 成像前应将载玻片储存在低温环境中，建议为 -20 °C。若在4 °C下保存一周，信号损失最小。为获得最强的荧光信号，建议在切片完成后立即进行成像。

结果

含有红色和绿色标记的竞争性种群的酵母群落垂直截面的荧光图像⁶ 如图所示 图3这些群落由两种原养型酵母菌株组成，它们对包括空间在内的共有资源的竞争导致形成柱状图案⁷如其垂直截面所示，截面中可分辨出单个细胞水平的分辨率。 图3 比较经甲醇固定（底部）与未经甲醇固定（顶部）处理后，按照相应实验方案获得的重复群落的横截面 图1对于未固定的酵母群落进行冷冻切片时，从步骤1.8开始执行本方案。未固定的群落切片中荧光信号得以保留，但群落完整性受损。结果表现为：（1）部分细胞在切片边缘漂浮脱落；（2）总体得率（即，未受切片过程人为假象干扰的切片区段所占比例）相较于固定样品中的群落更低。

图4展示了酵母菌群的代表性明场和荧光垂直截面图像。位于菌群顶部的细胞形成一个冠状结构，在明场下表现出更强的散射，在荧光下表现出更亮的信号，因而与其他细胞明显不同。这些模式与已有报道的酵母菌落分化模式一致⁴

讨论

本文介绍的方法提供了一种观察酵母菌群内部结构的途径。甲醇固定步骤可使酵母菌落变得坚硬⁸，并保持菌落的完整性；然而，该步骤也会引起收缩⁸，在结果解读时应予以考虑。与未固定直接包埋于OCT中的菌落相比，我们通常观察到酵母菌落高度约收缩30%⁹。

为避免收缩，冷冻切片的一种替代方法是将群落直接包埋于OCT中并进行冷冻。基于直接包埋的方法能够保留荧光信号，但其缺点是切片内各个细胞之间未被固定在一起。因此，切片边缘的部分细胞容易漂移，且在切片过程中更易受到扰动（图4）。尽管本文未重点讨论，酵母群落横截面的明场图像也可能为我们提供有关群落内部细胞状态的有用信息⁹。所关注的特性是否受固定步骤的影响，需根据具体情况逐一评估。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100% 甲醇	J.T. Baker	9070-01
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Andwin Scientific	4583
Whatman Grade No. 541 定量滤纸	Whatman	1541-047
Millipore-MF 膜滤器	Millipore	HAWP04700
冷冻切片机	Leica	CM 1510 S