从感染Plasmodium berghei ANKA小鼠中分离和分析脑滞留白细胞

摘要

本文介绍了一种从感染约氏疟原虫ANKA株（Plasmodium berghei ANKA）的小鼠脑血管中分离黏附性炎性白细胞的方法。该方法可通过荧光标记抗体染色后进行流式细胞术分析，对分离得到的白细胞进行定量以及表型鉴定。

摘要

我们描述了一种从感染P. berghei ANKA小鼠的脑血管中分离和表征黏附性炎性细胞的方法。易感小鼠品系感染该寄生虫株后，会引发实验性脑型疟疾，这是一种神经综合征，可模拟人类中由Plasmodium falciparum引起的重症疟疾的某些重要特征^1,2。疟疾红细胞期的成熟形态会在感染红细胞表面表达寄生虫蛋白，使其能够与血管内皮细胞结合。此过程导致血流受阻，引起缺氧和出血³，并刺激炎性白细胞募集至寄生虫滞留部位。

与其他感染（例如嗜神经病毒^4-6）不同，疟原虫寄生的红细胞（pRBC）以及相关的炎症性白细胞均滞留在血管内，而不会浸润脑实质。因此，为了避免滞留的白细胞被非炎症性的循环细胞污染，本实验在器官取出和组织处理前，必须对感染小鼠进行充分的心内灌注，以清除血液成分。灌注完成后，取出大脑并切成小块。随后使用胶原酶D和DNA酶I进行酶解处理，进一步破坏组织结构。将所得脑匀浆在Percoll梯度离心液上离心，从而将脑内滞留的白细胞（BSL）与髓鞘及其他组织碎片分离。分离后的细胞经洗涤后，用血细胞计数板计数，并用荧光标记抗体染色，用于后续的流式细胞术分析。

该方法可对响应多种刺激（包括脑卒中以及病毒或寄生虫感染）而迁移至脑组织的炎症性白细胞进行全面的表型表征。该方法还为临床前动物模型中新型抗炎治疗手段的评估提供了有效工具。

方案

1. 用P. berghei-ANKA感染小鼠

1. 解冻一份冻存的P. berghei ANKA 感染红细胞（pRBC）。
2. 使用双手固定法固定一只对脑型疟疾具有抗性的 BALB/c 供体小鼠（8-12 周龄）。使用 1 ml 胰岛素注射器（28G 针头）向小鼠注射 100–200 μl pRBC。通常情况下，注射 1–2 只供体小鼠。
3. 在感染后第 4–5 天（p.i.），将供体小鼠从笼中取出，置于工作台或一次性操作垫上。
4. 轻轻抓住小鼠尾尖进行固定，用小剪刀剪去尾尖约 1 mm。或者，也可使用 25 G 针头在尾部进行小穿刺。
5. 将小鼠尾静脉的一滴血置于载玻片磨砂端附近。
6. 将另一张载玻片（推片）以 45° 角接触血滴，待血液沿边缘展开后，均匀地将推片沿载玻片向前推动，制成血涂片。让涂片自然风干。
7. 将血涂片置于 100% 甲醇中固定 30 秒，随后用新配制的吉姆萨染液染色 10 分钟。
8. 用流动水冲洗血涂片 1 分钟，风干后在显微镜下观察（100 倍油镜）。计数 1,000 个红细胞中的感染红细胞（pRBC）数量，计算寄生虫血症百分比。供体小鼠的寄生虫血症水平需达到 2.5–5% 后，方可采血用于实验动物感染。
9. 使用肝素化毛细管通过眼后静脉丛采血法采集供体小鼠血液。所有实验均符合 Walter & Eliza Hall 研究所....

结果

图2结果显示了从灌注或未灌注的疟疾感染小鼠及未免疫对照小鼠脑组织中回收的不同脑脊液样（BSL）细胞群体的百分比和绝对数量。分离的BSL细胞按照方案文本所述，使用PE标记的抗NK1.1抗体和APC标记的抗TCR-β抗体进行染色。与先前的研究结果一致^7-9，在灌注的疟疾感染小鼠（感染后第6天）脑组织中，αβTCR⁺ T细胞在BSL细胞群中占比较高。而在未灌注动物的脑组织中，该细胞群体的比例明显偏低（图2A-B）。未灌注脑组织中T细胞频率的明显降低，与双阴性细胞（αβTCR^- NK1.1^-）比例和总数显著升高相关（图2A-B）。在未灌注的脑组织中，双阴性细胞的高比例和高数量不仅见于疟疾感染小鼠，也见于未免疫对照小鼠，提示这些细胞是存在于脑血管中的非炎症性白细胞，若未进行心内灌注，则会与炎症细胞一同被回收。

图3和图4展示了BSL分析的另外两个示例。简言之，将C57BL/6小鼠感染P. berghei ANKA（1×10⁶ 个感染红细胞）。已有研究^7-.......

讨论

脑脊液（BSL）的分离与分析是一种可用于表征和定量实验小鼠模型中因组织损伤或感染而迁移至脑部的炎性细胞的方法。在器官提取及后续细胞分离之前，通过心内灌注清除血液成分，有助于防止循环中的非炎性白细胞污染炎性细胞样本。在某些嗜神经性感染（如小鼠脑脊髓炎病毒）中，炎性细胞可浸润脑实质⁵，此时该步骤可能并非必需；但在疟疾感染的大鼠模型中，这一操作尤为重要，因为感染的红细胞和炎性白细胞主要滞留在血管内，而非浸润脑组织。因此，对感染疟疾的小鼠进行心内灌注，不仅应推荐用于BSL分析，还可用于评估寄生虫在组织中的滞留情况^10,11。与非炎性循环白细胞类似，疟原虫的未成熟形态无法黏附于血管内皮，应可通过灌注过程被清除；而黏附性的感染红细胞（pRBC，即成熟的裂殖体）则似乎仍保留在脑血管内。P. berghei ANKA 转基因疟原虫已成功构建并表达荧光素酶¹²，为这类分析提供了有价值的工具。在感染表达荧光素酶的虫株后，可通过IVIS系统对灌注后的动物脑组织进行成像，以确定寄生虫在组织中的滞留情况^10,11。将灌注动物在感染后第6–7天的寄生虫滞留情况.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>溶液与缓冲液
吉姆萨伊红亚甲蓝溶液	默克密理博	1.09204.0500	在蒸馏水中按1:10比例稀释
RPMI 培养基			小鼠张力
小鼠等渗 PBS			20 mM 磷酸钠，0.149 NaCl，pH 7.3
0.4%台盼蓝	Sigma Aldrich	T-8154	1:2 稀释
胶原酶D	沃辛顿生物化学
脱氧核糖核酸酶（DNAse）I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	从牛胰腺
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	PBS 中的 30% 溶液
超纯 Tris	Invitrogen	15505-020
氯化铵（NH₄Cl）4Cl	分析纯	10017
红细胞裂解缓冲液			17 mM Tris，14 nM NH4Cl，pH 7.2
FCS	Gibco	1009
EDTA 二钠盐	默克	10093.5V	0.1 M，pH 7.2
<强>抗体与偶联物
抗小鼠 CD16/CD32（Fc 封闭抗体），克隆株 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 μ50升 μl 染色缓冲液（0.5 mg/50 ml）
FITC-抗小鼠 CD4，克隆 H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-抗小鼠 NK1.1，克隆 PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-抗小鼠 CD8，克隆 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-抗小鼠 TCR-β，克隆 H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-抗小鼠 CXCR3，克隆 220803	R&D Systems	FAB1685P
生物素标记的抗小鼠 CCR5 抗体，克隆号 C34-3448	BD Pharmingen	559922
链霉亲和素-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
<强>仪器与材料
SuperFrost 显微镜载玻片	Lomb Menzel-Glä血清
解剖镊、剪刀	REDA 仪器
500 ml PBS 储液槽	Nalgene
橡胶管
23G针头	BD PrecisionGlide	302008
含金属筛网的细胞解离试剂盒	Sigma Aldrich	CD-1
70 μm 尼龙细胞滤网	BD Falcon	352350
血细胞计数板	GmbH Neubauer	717810
流式细胞术管	BD Falcon	352008