本文介绍了一种从感染约氏疟原虫ANKA株（Plasmodium berghei ANKA）的小鼠脑血管中分离黏附性炎性白细胞的方法。该方法可通过荧光标记抗体染色后进行流式细胞术分析，对分离得到的白细胞进行定量以及表型鉴定。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
我们描述了一种从感染P. berghei ANKA小鼠的脑血管中分离和表征黏附性炎性细胞的方法。易感小鼠品系感染该寄生虫株后，会引发实验性脑型疟疾，这是一种神经综合征，可模拟人类中由Plasmodium falciparum引起的重症疟疾的某些重要特征1,2。疟疾红细胞期的成熟形态会在感染红细胞表面表达寄生虫蛋白，使其能够与血管内皮细胞结合。此过程导致血流受阻，引起缺氧和出血3，并刺激炎性白细胞募集至寄生虫滞留部位。
与其他感染（例如嗜神经病毒4-6）不同，疟原虫寄生的红细胞（pRBC）以及相关的炎症性白细胞均滞留在血管内，而不会浸润脑实质。因此，为了避免滞留的白细胞被非炎症性的循环细胞污染，本实验在器官取出和组织处理前，必须对感染小鼠进行充分的心内灌注，以清除血液成分。灌注完成后，取出大脑并切成小块。随后使用胶原酶D和DNA酶I进行酶解处理，进一步破坏组织结构。将所得脑匀浆在Percoll梯度离心液上离心，从而将脑内滞留的白细胞（BSL）与髓鞘及其他组织碎片分离。分离后的细胞经洗涤后，用血细胞计数板计数，并用荧光标记抗体染色，用于后续的流式细胞术分析。
该方法可对响应多种刺激（包括脑卒中以及病毒或寄生虫感染）而迁移至脑组织的炎症性白细胞进行全面的表型表征。该方法还为临床前动物模型中新型抗炎治疗手段的评估提供了有效工具。
方案
1. 用P. berghei-ANKA感染小鼠
- 解冻一份冻存的P. berghei ANKA 感染红细胞（pRBC）。
- 使用双手固定法固定一只对脑型疟疾具有抗性的 BALB/c 供体小鼠（8-12 周龄）。使用 1 ml 胰岛素注射器（28G 针头）向小鼠注射 100–200 μl pRBC。通常情况下，注射 1–2 只供体小鼠。
- 在感染后第 4–5 天（p.i.），将供体小鼠从笼中取出，置于工作台或一次性操作垫上。
- 轻轻抓住小鼠尾尖进行固定，用小剪刀剪去尾尖约 1 mm。或者，也可使用 25 G 针头在尾部进行小穿刺。
- 将小鼠尾静脉的一滴血置于载玻片磨砂端附近。
- 将另一张载玻片（推片）以 45° 角接触血滴，待血液沿边缘展开后，均匀地将推片沿载玻片向前推动，制成血涂片。让涂片自然风干。
- 将血涂片置于 100% 甲醇中固定 30 秒，随后用新配制的吉姆萨染液染色 10 分钟。
- 用流动水冲洗血涂片 1 分钟，风干后在显微镜下观察（100 倍油镜）。计数 1,000 个红细胞中的感染红细胞（pRBC）数量，计算寄生虫血症百分比。供体小鼠的寄生虫血症水平需达到 2.5–5% 后，方可采血用于实验动物感染。
- 使用肝素化毛细管通过眼后静脉丛采血法采集供体小鼠血液。所有实验均符合 Walter & Eliza Hall 研究所动物伦理委员会的要求。根据当地动物伦理委员会的规定，也可采用其他采血方法。将所需量的血液溶解于 RPMI 培养基中，终浓度为 1×106 pRBC/0.2 ml。注意，正常小鼠的红细胞压积约为 6×109 个红细胞/1 ml。
- 通过腹腔注射（i.p.）向实验用 C57BL/6 小鼠（8–12 周龄）注射 1×106 pRBC/0.2 ml 进行感染。
- 为监测感染小鼠的寄生虫血症水平，请参照步骤 1.3–1.8。应从感染后第 2 或第 3 天开始，每 2–3 天测定一次寄生虫血症。
- C57BL/6 小鼠重症疟疾的发病表现可能包括弓背、毛发竖立和活动减少。部分小鼠在此阶段可能恢复，但若进展至失去自我翻正反射，则表明疾病已不可逆，必须实施安乐死。
2. 小鼠心脏灌注及脑组织提取
- 通过将一个500 ml的储液罐固定在连接于60 cm柱架顶部的柱夹上，组装一套手动重力灌注系统。将塑料管连接至储液罐底部，并在管路上安装一个管夹以控制缓冲液流速。将管路连接至23 G针头。用保持在22 °C的PBS充满储液罐，打开管夹，使缓冲液流经管路以排除所有气泡。
- 通过吸入CO2处死感染P. berghei ANKA的小鼠。通过检查足底、眼眶和呼吸反应的消失来确认死亡。
- 将已处死的小鼠仰卧位固定在塑料托盘内的泡沫解剖板上，前后肢用针固定。根据当地动物伦理委员会的要求，可在开始心脏灌注前给予麻醉。
- 用70%乙醇擦拭腹部表面。
- 使用大剪刀和镊子沿中线切开皮肤，暴露胸腔。将皮肤向两侧翻开并用针固定。
- 用精细镊子夹住胸骨，剪断膈肌，并沿胸骨两侧剪断肋骨。注意避免损伤任何大血管。
- 将肋骨笼通过胸骨松散地固定在头部旁边。
- 用精细镊子夹住心室，用精细剪刀小心剪开右心房。
- 当PBS正在流动时，将连接至重力灌注系统的23 G针头插入左心室，朝向升主动脉方向，针尖插入深度仅为0.5 cm。
- 灌注小鼠5分钟，或直至流出液变澄清。
- 取下固定针，将小鼠翻转至腹部朝下。用70%乙醇擦拭头部。
- 使用大剪刀，在颈椎脊髓区域上方做一个切口。
- 使用精细剪刀从颅底开始，沿中线向头侧做一尾-头方向的切口，并剥离皮肤以暴露颅骨。
- 固定头部，将小剪刀的刀片分别插入两侧眼眶，于两眼眶之间做一剪切。
- 沿矢状缝做一纵向切口，并小心将两侧大脑半球对应的颅骨向外剥离。
- 使用刮勺轻轻抬起脑组织，将其放入含有RPMI培养基的10 ml离心管中。
3. 脑滞留白细胞（BSL）的分离
- 在安全柜中操作，将新鲜收获的脑组织置于含有 3–5 ml RPMI 组织培养基的培养皿中的不锈钢细胞筛（40–60 目）上。
- 将脑组织切成小块。
- 使用晶体冲头将脑组织小块压过细胞筛。
- 将脑匀浆转移至 10 ml 离心管中，在 4 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟。
- 将沉淀溶解于 3 ml RPMI 培养基中，其中含有 0.05% Collagenase D 和 2 U/ml DNAse I。
- 室温下旋转孵育 30 分钟。通过将混合物压过 70 μm 尼龙细胞筛和/或在冰上孵育 5 分钟，去除细胞碎片。
- 将脑匀浆铺于 7 ml 30% Percoll 垫层上，在室温下以 400 × g（无刹车）离心 20 分钟。
- 将沉淀重悬于 1 ml 红细胞裂解缓冲液中，冰上孵育 5 分钟以裂解黏附的红细胞（pRBC），这些红细胞无法通过心脏灌注从脑组织中完全去除。
- 加入 9 ml RPMI 培养基，洗涤细胞并在 4 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟。
- 将含有 BSL 的沉淀重悬于 50–100 μl RPMI 培养基中，并将细胞转移至 Eppendorf 管。
- 取 5–10 μl 细胞样品，用台盼蓝按 1:2 比例稀释，用于鉴定活细胞。
- 使用血细胞计数板在显微镜下计数活细胞。从感染后第 6 天（p.i.）开始，当感染 P. berghei ANKA 的小鼠出现神经系统症状时，可回收 20,000–100,000 个 BSL。
4. 通过多色流式细胞术对生物安全等级实验室的免疫表型分析
- 在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 10 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 50 μl 染色缓冲液（PBS，1% 胎牛血清（FCS），2 mm EDTA）中。
- 加入1 μl纯化的抗CD16/32抗体（Fc阻断剂）。
- 将细胞在冰上孵育10分钟。
- 用1 ml染色缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以250 × g离心10分钟，吸除上清液。
- 在含有已预先确定最佳稀释浓度的所需荧光抗体的 50 μl 染色缓冲液中重悬细胞 即 抗CD4、抗CD8、抗TCR和抗NK1.1
- 冰上孵育1小时。
- 用1 ml染色缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以250 × g离心10分钟，吸除上清液。
- 在100 μl PBS中重悬细胞。
- 将细胞转移至流式细胞术塑料管中。
- 使用流式细胞仪，至少采集 5,000–10,000 个细胞事件。根据需要设置相应的未染色细胞对照和荧光补偿样本。
- 使用适当的流式细胞术软件分析结果。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图2结果显示了从灌注或未灌注的疟疾感染小鼠及未免疫对照小鼠脑组织中回收的不同脑脊液样（BSL）细胞群体的百分比和绝对数量。分离的BSL细胞按照方案文本所述，使用PE标记的抗NK1.1抗体和APC标记的抗TCR-β抗体进行染色。与先前的研究结果一致7-9，在灌注的疟疾感染小鼠（感染后第6天）脑组织中，αβTCR+ T细胞在BSL细胞群中占比较高。而在未灌注动物的脑组织中，该细胞群体的比例明显偏低（图2A-B）。未灌注脑组织中T细胞频率的明显降低，与双阴性细胞（αβTCR- NK1.1-）比例和总数显著升高相关（图2A-B）。在未灌注的脑组织中，双阴性细胞的高比例和高数量不仅见于疟疾感染小鼠，也见于未免疫对照小鼠，提示这些细胞是存在于脑血管中的非炎症性白细胞，若未进行心内灌注，则会与炎症细胞一同被回收。
图3和图4展示了BSL分析的另外两个示例。简言之，将C57BL/6小鼠感染P. berghei ANKA（1×106 个感染红细胞）。已有研究7-...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
脑脊液（BSL）的分离与分析是一种可用于表征和定量实验小鼠模型中因组织损伤或感染而迁移至脑部的炎性细胞的方法。在器官提取及后续细胞分离之前，通过心内灌注清除血液成分，有助于防止循环中的非炎性白细胞污染炎性细胞样本。在某些嗜神经性感染（如小鼠脑脊髓炎病毒）中，炎性细胞可浸润脑实质5，此时该步骤可能并非必需；但在疟疾感染的大鼠模型中，这一操作尤为重要，因为感染的红细胞和炎性白细胞主要滞留在血管内，而非浸润脑组织。因此，对感染疟疾的小鼠进行心内灌注，不仅应推荐用于BSL分析，还可用于评估寄生虫在组织中的滞留情况10,11。与非炎性循环白细胞类似，疟原虫的未成熟形态无法黏附于血管内皮，应可通过灌注过程被清除；而黏附性的感染红细胞（pRBC，即成熟的裂殖体）则似乎仍保留在脑血管内。P. berghei ANKA 转基因疟原虫已成功构建并表达荧光素酶12，为这类分析提供了有价值的工具。在感染表达荧光素酶的虫株后，可通过IVIS系统对灌注后的动物脑组织进行成像，以确定寄生虫在组织中的滞留情况10,11。将灌注动物在感染后第6–7天的寄生虫滞留情况...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Liana Mackiewicz 女士提供的技术协助。本工作得益于维多利亚州政府运营基础设施支持以及澳大利亚政府国家卫生与医学研究理事会 IRIISS 和项目资助 1031212。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>溶液与缓冲液 | |||
| 吉姆萨伊红亚甲蓝溶液 | 默克密理博 | 1.09204.0500 | 在蒸馏水中按1:10比例稀释 |
| RPMI 培养基 | 小鼠张力 | ||
| 小鼠等渗 PBS | 20 mM 磷酸钠，0.149 NaCl，pH 7.3 | ||
| 0.4%台盼蓝 | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 稀释 |
| 胶原酶D | 沃辛顿生物化学 | ||
| 脱氧核糖核酸酶（DNAse）I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | 从牛胰腺 |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | PBS 中的 30% 溶液 |
| 超纯 Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| 氯化铵（NH₄Cl）4Cl | 分析纯 | 10017 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | 17 mM Tris，14 nM NH4Cl，pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA 二钠盐 | 默克 | 10093.5V | 0.1 M，pH 7.2 |
| <强>抗体与偶联物 | |||
| 抗小鼠 CD16/CD32（Fc 封闭抗体），克隆株 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μ50升 μl 染色缓冲液（0.5 mg/50 ml） |
| FITC-抗小鼠 CD4，克隆 H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-抗小鼠 NK1.1，克隆 PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-抗小鼠 CD8，克隆 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-抗小鼠 TCR-β，克隆 H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-抗小鼠 CXCR3，克隆 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| 生物素标记的抗小鼠 CCR5 抗体，克隆号 C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| 链霉亲和素-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| <强>仪器与材料 | |||
| SuperFrost 显微镜载玻片 | Lomb Menzel-Glä血清 | ||
| 解剖镊、剪刀 | REDA 仪器 | ||
| 500 ml PBS 储液槽 | Nalgene | ||
| 橡胶管 | |||
| 23G针头 | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| 含金属筛网的细胞解离试剂盒 | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm 尼龙细胞滤网 | BD Falcon | 352350 | |
| 血细胞计数板 | GmbH Neubauer | 717810 | |
| 流式细胞术管 | BD Falcon | 352008 |
参考文献
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
