我们描述了一种用于追踪由胞内细菌引发的内膜系统破裂的方法 志贺氏菌 福氏 和 结核分枝杆菌 在宿主细胞入侵过程中。我们的检测利用了CCF4，一种存在于活细胞或固定细胞宿主胞质中的FRET探针。该报告分子可被细菌表面存在的一种酶活性降解。
本文内容
摘要
摘要
Shigella flexneri 是一种致病性细菌，可侵入宿主细胞并进入内吞囊泡。随后，该膜包被的区室破裂，使细菌进入细胞质中自由移动、增殖，并进一步侵染邻近细胞。Mycobacterium tuberculosis 可被免疫细胞吞噬，并已被证实可在巨噬细胞中破坏吞噬体膜。我们开发了一种可靠的检测方法，用于追踪 Shigella flexneri 或 Mycobacterium tuberculosis 进入宿主细胞后吞噬体膜的破裂过程。该方法利用 CCF4 作为对β-内酰胺酶敏感的FRET报告分子，该探针可在宿主细胞的细胞质中均匀分布。当细菌病原体侵入宿主细胞时，只要细菌仍处于膜包被的区室内，探针便保持完整；一旦囊泡破裂，胞内病原体表面的β-内酰胺酶会立即切割 CCF4，导致FRET信号丧失并改变其发射光谱。这种可靠的比率型检测方法可准确提供侵入性细菌诱导囊泡破裂的时间信息，并可通过专用算法与自动化显微镜及图像处理技术联用，实现对FRET供体和受体发射信号的检测。此外，该方法可在单细胞水平上实时研究胞内细菌引发的囊泡破裂动态过程。最后，该方法非常适用于高通量分析，其时空分辨率优于以往方法。本文提供了以 Shigella flexneri 以及多种分枝杆菌菌株（如 Mycobacterium marinum、Mycobacterium bovis 和 Mycobacterium tuberculosis）为模型，在 HeLa 细胞和 THP-1 巨噬细胞中进行 CCF4 囊泡破裂检测的示例性实验方案，适用于时间序列或终点实验。
引言
许多细菌病原体在感染过程中会被真核细胞以膜包被的区室形式内化。细胞入侵可通过专职宿主细胞的吞噬作用实现，例如巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）；或者由病原体主动诱导进入通常不具备吞噬能力的细胞。在诱导内化的情况下，例如志贺氏痢疾杆菌（Shigella flexneri），病原体会向宿主细胞质中注入效应蛋白，这些蛋白会劫持包括内膜系统分选机制在内的多种细胞功能，导致细菌定位于内体样区室内1,2。随后，志贺氏菌（Shigella）破坏包被膜，引起液泡破裂，使病原体进入细胞质，干扰宿主的膜运输过程，并避免被运送至溶酶体。近年来还发现，吞噬溶酶体破裂也是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的一种感染策略，该病原体曾长期被认为仅存在于膜包被的区室内3,17。
为了研究侵入性病原体亚细胞膜运输的动力学，自20世纪80年代末基于透射电子显微镜（TEM）的研究以来，已取得显著进展4,5。例如，基于荧光显微镜的方法，如使用染料、针对细菌表面组分的抗体，或与亚细胞区室共定位的标记物，已逐渐成为主流6,7。然而，这些方法仍无法提供精确的时空分辨率，也难以对细菌病原体引起的液泡破裂进行定量测量。
这一难题已通过一种基于头孢菌素衍生的CCF4-AM FRET报告分子的检测方法得到解决，该方法最初用于研究基因表达8。随后，该方法被应用于感染生物学领域，以研究效应蛋白的分泌以及Neisseria进入宿主细胞的过程9,10,11。我们开发了一种利用该报告分子的研究方法，用于检测由Shigella flexneri12和Mycobacterium tuberculosis17诱导的液泡破裂。本方法的原理如图1所示，以Shigella flexneri为例进行说明。首先，将宿主细胞加载FRET CCF4-AM底物，该底物在细胞质中脱去AM酯基团后被滞留于胞内。随后，用Shigella flexneri感染细胞。当液泡破裂发生后，细菌表面的β-内酰胺酶即可立即切割CCF4底物。这导致FRET信号丧失，当探针在405 nm激发时，发射峰从535 nm转变为450 nm。通过测定450 nm与535 nm发射光强度的比值，可反映液泡的完整性：低比值表示细菌仍被膜包裹或位于细胞外，而高比值则表明细菌与宿主细胞质发生了接触。我们还报道了该方法的一种改进版本，用于研究Mycobacterium tuberculosis在THP-1巨噬细胞中诱导的吞噬体破裂。尽管实验原理相同，但操作顺序有所调整：CCF4-AM的加载仅在细菌感染之后进行。
因此，通过在单细胞水平上进行定量的比率荧光测量，可以实时追踪Shigella flexneri在不同类型细胞中的液泡破裂过程，并可在固定样品中进行检测12,13,14。此外，本方法还可适用于其他多种侵袭性病原体，本研究中已利用Mycobacterium bovis和Mycobacterium tuberculosis加以验证。最后，将本实验方案微型化至96孔板（或384孔板）格式，可实现对大量实验条件的高通量筛选。
方案
该检测可在多种实验体系中进行，但我们建议缩小样本体积以节约试剂，尤其是 CCF4-AM。因此，以下方案分别描述了在 96 孔板中固定 HeLa 细胞或 THP-1 巨噬样细胞的检测流程，以及在 35 mm 玻底培养皿中活 HeLa 细胞的检测流程。该检测方法可适用于其他病原体。除志贺氏菌感染外，我们还描述了 THP-1 细胞吞噬不同分枝杆菌菌株的检测方案。
重要的是，在加载 CCF4-AM 后，所有试剂和缓冲液（包括洗涤缓冲液）均需含有 1 mM 的丙磺舒。丙磺舒是一种阴离子通道抑制剂，可在整个实验步骤中促进 CCF4 在细胞质中的滞留。固定后的样品应在实验结束后数小时内完成检测，因为 CCF4 信号在长时间内不稳定。
1. 使用Shigella flexneri对固定样本进行CCF4检测（96孔板）
- 准备细菌过夜培养物。在感染前一天，将野生型（M90T AfaI）和突变型（BS176 AfaI）细菌预培养物接种于8 ml添加氨苄青霉素（50 μg/ml）的胰蛋白胨大豆肉汤（TCSB）中，在37 °C摇床中过夜培养。
- 铺板细胞用于感染。在感染前一天，将HeLa细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种于96孔板中，每孔终体积为100 μl，培养基为含10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素的DMEM，在5% CO2培养箱中培养。对于THP-1类巨噬细胞，则在感染前两天以每孔5 × 104个细胞的密度进行铺板，并在含10%胎牛血清（FCS）、1%青霉素-链霉素和0.05 mM 2-巯基乙醇的RPMI培养基中加入30 nM佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）共同孵育。
- 准备细菌亚培养物。将过夜培养的细菌以1:100比例稀释接种于添加50 μg/ml氨苄青霉素的TCSB中，在37 °C摇床中培养2.5小时（OD600 = 0.3至0.4）。
- 用CCF4-AM负载细胞。配制CCF4-AM负载混合液，每孔终体积为25 μl，包含1 mM丙磺舒（Sigma）、1.5 μM CCF4-AM（THP-1细胞为6 μM）以及1.25 μl负载溶液B（Invitrogen CCF4-AM LiveBlazer负载试剂盒中提供的含100 mg/ml Pluronic-F127表面活性剂的DMSO/0.1%乙酸溶液）溶于EM缓冲液（120 mM NaCl、7 mM KCl、1.8 mM CaCl2、0.8 mM MgCl2、5 mM葡萄糖、25 mM HEPES，pH 7.3）。用PBS洗涤细胞一次，每孔加入25 μl CCF4-AM负载混合液，在室温避光条件下孵育2.5小时。
- 准备用于感染的细菌。取1 ml细菌亚培养物在9,000 rpm下离心1分钟。用500 μl PBS洗涤一次，再次在9,000 rpm下离心1分钟，然后重悬于500 μl PBS中，其中添加10 μg/ml多聚-L-赖氨酸（Sigma）和40 μg/ml β-内酰胺酶（Sigma）。室温旋转孵育10分钟后，用500 μl PBS洗涤一次，再将细菌重悬于500 μl EM缓冲液/1 mM丙磺舒中。
- 细胞感染与固定。用150 μl PBS/1 mM丙磺舒洗涤细胞一次，将10 μl细菌悬液加入终体积为100 μl的EM缓冲液/1 mM丙磺舒中混匀，分配至各孔。在室温避光条件下孵育15分钟后，将培养板转移至37 °C继续孵育1小时（THP-1细胞为90分钟），用150 μl PBS/1 mM丙磺舒洗涤，再用50 μl含1 mM丙磺舒的4%多聚甲醛固定10分钟（避光）。随后用150 μl PBS/1 mM丙磺舒洗涤，加入30 μl 10 μM细胞核染料Draq5（Biostatus）孵育30分钟，再次用150 μl PBS/1 mM丙磺舒洗涤，最后将样品保存于100 μl PBS/1 mM丙磺舒中。
- 固定样品的采集设置。图像采集可采用以下两种方式之一：(i) 使用倒置落射荧光显微镜，配备20倍（0.5数值孔径（NA），2.1工作距离（WD））或40倍（0.75 NA，0.72 WD）N-Plan空气物镜；或(ii) 使用共聚焦显微镜，配备10倍物镜。荧光成像使用405 nm激发光（Semrock，FF01-387/11-25），发射光通过450 nm（Semrock，FF02-447/60-25）和535 nm滤光片（Semrock，FF01-520/35-25）检测，曝光时间分别为5 msec（透射光）、1,000 msec（535 nm）和500 msec（450 nm）。共聚焦成像使用以下参数：405 nm激光（870 μW）下450 nm通道曝光240 msec，535 nm通道曝光360 msec；640 nm激光（2560 μW）下Draq5通道曝光640 msec。
- 采集后分析。随后，通过计算机算法对图像进行分析，实现对每个单个细胞荧光信号的自动评分。可使用Metamorph 7.1或Acapella等软件编写脚本，用于计算450 nm与535 nm发射信号的比值（脚本可应要求提供）。值得注意的是，在图像采集过程中结合使用焦点校准装置与自动化显微镜，可同时获取多个孔中数十个不同位置的图像。
2. 使用Shigella flexneri 对活体样本进行 CCF4 检测（35 mm 玻璃底培养皿，MatTek）
- 准备细菌用于过夜培养。操作步骤如前所述。
- 感染用细胞的铺板。在感染前一天，将HeLa细胞以每皿2 × 105 个细胞的密度接种于35 mm玻璃底培养皿（MatTek 10 mm Microwell，MatTek公司）中，终体积为2 ml。
- 准备细菌用于传代培养。操作步骤如前所述。
- 用CCF4-AM负载细胞。按前述方法配制CCF4-AM负载混合液，每皿终体积为2 ml。负载前，用PBS洗涤细胞一次。
- 准备细菌用于感染。操作步骤如前所述。
- 活细胞样本的采集设置。使用倒置落射荧光显微镜，在37 °C加热腔内，采用20×（0.5 NA，2.1 WD）或40×（0.75 NA，0.72 WD）N-Plan空气物镜，每90秒采集一次，持续60分钟。荧光成像使用405 nm激发光（Semrock，FF01-387/11-25），发射光通过450 nm（Semrock，FF02-447/60-25）和535 nm滤光片（Semrock，FF01-520/35-25）检测，曝光时间分别为5 msec（透射光）、200 msec（535 nm）和100 msec（450 nm）。
- 细胞感染与活细胞成像。用2 ml含1 mM丙磺舒的PBS洗涤细胞一次，加入2 ml含1 mM丙磺舒的EM培养基，将培养皿置于显微镜载物台上并开始采集。6分钟后（时间点4），暂停采集，向细胞上方加入250 μl细菌重悬液，随后重新开始采集。
- 采集后分析。可使用Metamorph或ImageJ软件查看动态图像。利用ImageJ可获得每个单个细胞的450/535 nm荧光强度比值。如前所述，在时间序列成像过程中，结合自动显微镜使用焦点校准装置，可实现多个不同位置的图像采集。
3. 使用固定样品进行CCF4检测 分枝杆菌（96孔板格式）
- 准备细菌。培养 分枝杆菌菌株在含白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）的7H9培养基中，于30 °C培养至对数中期（ Mycobacterium marinum）或 37 °C（用于 Mycobacterium bovis BCG 和 结核分枝杆菌.
- 用于感染的细胞接种。在感染前2天，将THP-1巨噬细胞接种于含10%胎牛血清（FCS）、1%青霉素-链霉素和0.05 mM 2-巯基乙醇的RPMI培养基中，并加入30 nM PMA，于5% CO₂条件下培养。2 在最终体积为100 μl、细胞密度为5 x 10的条件下置于培养箱中培养4 细胞/孔
- 准备细菌用于感染。收集菌液，用 PBS 洗涤并重悬，随后进行超声处理，并通过注射器过滤，以避免菌体聚集。通过 OD600 测定每种菌株的浓度，并在 30 °C 条件下以 1:1 的感染复数（MOI）感染 THP-1 细胞（用于 Mycobacterium marinum）或 37 °C（用于 Mycobacterium bovis BCG 和 结核分枝杆菌 在含5% CO的RPMI培养基中22小时后，移除培养基，用PBS洗涤3次，加入完全新鲜培养基继续培养1至2天（对于 Mycobacterium marinum）或 3 至 7 天（对于 Mycobacterium bovis BCG 和 结核分枝杆菌.
- 用 CCF4-AM 负载细胞并进行固定。用 PBS 洗涤细胞一次，并按前述方法配制 CCF4-AM 负载混合液，每孔终体积为 25 μl，CCF4-AM 终浓度为 6 μM。在室温避光条件下负载 2 小时，随后用 150 μl 含 1 mM 丙磺舒的 PBS 洗涤，并在避光条件下加入 50 μl 含 1 mM 丙磺舒的 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。然后用 150 μl 含 1 mM 丙磺舒的 PBS 洗涤，将样本保存在 100 μl 含 1 mM 丙磺舒的 PBS 中。
- 采集参数设置与采集后分析。按照第一段中先前所述的方法进行操作。 志贺氏菌 福氏志贺菌.
补充方案
为了检测细菌表面的β-内酰胺酶活性，需进行荧光测定。每种拟用于本实验方案的细菌菌株均应进行此项检测。具体操作如下：将洗涤后的细菌与100 nM CCF4-AM（Invitrogen）、50 μg/ml 猪肝酯酶提取物（sigma）在1 ml PBS中混合，于37 °C避光孵育1小时。可使用1 mg/ml的可溶性β-内酰胺酶（Invitrogen）作为阳性对照。随后，使用PTI Quantamaster荧光分光光度计和1 ml石英比色皿，在405 nm激发波长下进行发射光谱扫描。当细菌加入CCF4探针后，可在535 nm处观察到FRET信号减弱，同时在450 nm处出现明显的荧光峰。
结果
CCF4-AM/β-内酰胺酶方法是一种稳健且灵敏的技术，可用于追踪如细胞内病原体的液泡破裂过程 福氏志贺菌 (图1）。该 志贺氏菌 本研究中使用的小鼠品系称为 M90T AfaI 和 BS176 AfaI。M90T AfaI 是一种 福氏志贺菌 表达黏附素AfaE的菌株，该黏附素能够高效结合上皮细胞表面的CD55 15因此，表达AfaE的菌株在上皮细胞中的侵袭能力远高于野生型M90T菌株。BS176 AfaI是一种表达AfaE的突变株。 志贺氏菌 福氏 缺失该基因的菌株 志贺氏菌 毒力质粒。该菌株无法侵入HeLa细胞。然而，该菌株能够进入THP-1细胞，因为该细胞系的摄取仅依赖于经典的吞噬作用，不需要功能性的III型分泌系统。两种菌株均表达β-内酰胺酶，并由于携带编码AfaE的质粒而在细胞表面表现出β-内酰胺酶活性。用非侵袭性BS176 AfaI菌株感染HeLa细胞1小时后，CCF4 FRET探针保持完整，如图所示 图2A 由绿色信号（535 nm）指示。相反，感染强毒性的M90T AfaI菌株1小时后，信号转向蓝色（450 nm），表明探针在细胞质中被切割。为了定量分析这一现象，我们开发了一个用于Metamorph和Acapella软件的脚本，可自动识别细胞并测量535 nm和450 nm通道的荧光强度，从而确定比率信号。如图所示 图2B，利用Draq5通道对细胞的细胞核和细胞质进行分割。随后，该算法能够识别450 nm和535 nm的阳性细胞群体，计算每个单个细胞在这两个波长下的荧光强度比值，并以直方图形式呈现 图2C突变株的比值较低，而毒力株的比值较高。尽管本例感染实验采用共聚焦显微镜获取结果，但落射荧光显微镜也适用于该检测。 图3 和 4 以两种不同的人类细胞类型为例：HeLa 上皮细胞和 THP-1 类似巨噬细胞。在感染毒力型 M90T AfaI 后 志贺氏菌 孵育1小时和90分钟时，与感染BS176 AfaI的细胞相比，HeLa和THP-1细胞中可观察到信号从绿色（535 nm）转变为蓝色（450 nm）图3A 和 4A）。我们开发的MetaMorph软件脚本可直接检测CCF4阳性细胞群体，并计算每个单个细胞在450 nm和535 nm通道中的荧光强度比值。随后，通过在Excel中开发的宏程序，根据该比值对细胞进行分类，从而生成显示细胞分布的直方图。与为Acapella开发的其他脚本类似，使用MetaMorph算法分析HeLa细胞和THP-1巨噬细胞时，BS176 AfaI感染的细胞表现为低比值，而M90T AfaI感染的细胞则表现为高比值。图3B 和 4B）。最后，展示了该方法在分枝杆菌研究中的适应性应用。 图5. Mycobacterium bovis 在整个实验过程中，BCG 始终存在于吞噬体中，这一点通过实验全程检测到的强烈 535 nm 信号得以反映。相比之下， 结核分枝杆菌 在感染3天后诱导THP-1巨噬细胞吞噬体膜破裂，感染7天时表现为450 nm信号（图 5A 和 5B）。采用相同的算法来研究液泡破裂 志贺氏菌，我们发现 结核分枝杆菌 感染细胞的450/535 nm比值高于 Mycobacterium bovis 感染7天后的BCG（图5C 和 5D).
图 1. CCF4-AM/β-内酰胺酶检测法用于追踪 Shigella flexneri 内体囊泡破裂的原理示意图。 CCF4-AM 可自由穿过质膜进入细胞质，在细胞质中其酯基被胞质酯酶水解，生成 CCF4 阴离子。该反应阻止 CCF4 进入任何膜包被的细胞器。在此阶段，CCF4 在 405 nm 激发下于 535 nm 处产生 FRET 信号。探针保持完整状态，直至表达 β-内酰胺酶的细菌破坏内吞囊泡。此时，CCF4 被 β-内酰胺酶切割，导致在 405 nm 激发下发射光由 535 nm 转变为 450 nm，FRET 信号随之消失。
图 2. 利用共聚焦显微镜追踪 Shigella flexneri 液泡破裂过程。 (A) HeLa 细胞经 CCF4-AM 负载 2 小时 30 分钟后，分别感染表达 β-内酰胺酶的 Shigella flexneri BS176 AfaI 突变株或 M90T AfaI 毒力株 1 小时，随后用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟。接着使用 Draq5 对细胞核进行染色，并采用配备 10 倍物镜的共聚焦显微镜进行成像。所选代表性图像包含以下合并通道：完整的 CCF4 探针在 535 nm 处显示为绿色，裂解后的 CCF4 探针在 450 nm 处显示为蓝色。(B) 使用 Acapella 软件中自动化算法检测系统的示例图像。细胞（细胞核+细胞质）的分割基于 Draq5 通道获得；CCF4 阳性细胞则通过合并 450 nm 和 535 nm 通道信号识别。(C) 柱状图显示了利用 Acapella 软件对 Shigella flexneri BS176 AfaI 突变株和 M90T AfaI 毒力株进行自动化分析的结果。平均比值表示 450 nm 与 535 nm 通道信号强度的比值。点击此处查看高清大图。
图3. 利用落射荧光显微镜追踪Shigella flexneri在HeLa细胞中的液泡破裂过程。(A) HeLa细胞经CCF4-AM负载2小时30分钟后，分别感染表达β-内酰胺酶的Shigella flexneri BS176 AfaI突变株或M90T AfaI毒力株，感染1小时后用4%多聚甲醛固定10分钟。随后使用配备20倍物镜的落射荧光显微镜进行成像。代表性图像选自以下通道：CCF4完整探针535 nm（绿色）和CCF4裂解探针450 nm（蓝色）。(B) 直方图显示了在MetaMorph软件中进行自动化分析的结果。各个细胞根据其在450 nm与535 nm通道荧光强度比值进行分布。
图 4. 利用落射荧光显微镜追踪 THP-1 细胞中 Shigella flexneri 的液泡破裂过程。 (A) THP-1 细胞经 CCF4-AM 染色 2 小时 30 分钟后，分别感染表达 β-内酰胺酶的 Shigella flexneri BS176 AfaI 突变株或 M90T AfaI 毒力株，感染时间为 1 小时 30 分钟，随后用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟。接着使用配备 20 倍物镜的落射荧光显微镜对细胞成像。所选代表性图像包含以下通道：CCF4 完整探针 535 nm（绿色）和 CCF4 裂解探针 450 nm（蓝色）。(B) 使用 MetaMorph 软件进行自动化分析所得结果的直方图。各个细胞根据其在 450 nm 与 535 nm 通道中的荧光强度比值进行分布。
图 5. 利用落射荧光显微镜追踪Mycobacterium bovis BCG 和Mycobacterium tuberculosis 在 THP-1 巨噬细胞中的吞噬体破裂情况。（A, B） THP-1 细胞经表达 β-内酰胺酶的Mycobacterium bovis BCG 或Mycobacterium tuberculosis 感染 2 小时后，培养 3 至 7 天。洗涤后，细胞负载 CCF-4-AM 2 小时，并用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，随后使用配备 40 倍物镜的落射荧光显微镜进行成像。代表性图像选自以下通道：完整的 CCF4 探针，535 nm（绿色）；裂解的 CCF4 探针，450 nm（蓝色）。（C, D） 使用 MetaMorph 软件进行自动化分析结果的直方图。单个细胞根据其在 450 nm 与 535 nm 通道间的荧光强度比值分布。
讨论
CCF4-AM/β-内酰胺酶检测法是一种简单的方法，用于追踪细胞内Shigella flexneri和分枝杆菌在不同类型细胞中诱导的液泡破裂。该方法利用一种对β-内酰胺酶敏感的胞质FRET报告分子，该报告分子可被细菌表面具有活性的酶切割。
在加载CCF4-AM底物后，向所有溶液中添加丙磺舒可轻松避免底物的流失。如所示，该检测方法可适用于多种细胞类型（上皮细胞、吞噬细胞）和多种实验格式（96孔板、35 mm玻璃底培养皿、6/12/24孔板）。使用6/12/24孔板时，需在接种细胞前将无菌盖玻片置于各孔底部。实验结束后，将盖玻片转移至载玻片上，并用封片剂（如Prolong Gold抗荧光淬灭试剂（Invitrogen））封片。与固定后样本保存于PBS中的96孔板格式相比，该方法可在检测后更长时间内保持信号稳定。在确定样本体积前，应考虑CCF4-AM底物的高成本，因此建议缩小实验规模。6/12/24孔板格式的实验成本较高，但信号可持续数天；相反，96孔板格式的实验成本较低，但样本需在实验当天完成分析。值得注意的是，活细胞实验也可在96孔或384孔板格式中进行，从而可同时检测数十种条件（如突变细菌、感染复数MOI、质粒或siRNA转染、化学物质等），并在每孔内设置多个检测位点。尽管该方法适用于Shigella flexneri，但我们强调，由于分枝杆菌的感染周期过长，超出细胞质中可维持的CCF4可测浓度范围，因此无法实现真正的实时或延时成像实验。基于此原因，CCF4-AM底物仅在入侵完成之后才施加于细胞。
如果使用 MetaMorph 软件进行图像采集与分析，我们建议使用“高通量筛选采集”模块，该模块可对整块 96 孔或 384 孔板进行成像，并为每个孔设定指定数量的图像采集。此外，“筛选数据回顾”模块允许（i）在同一张大“海报”上同时可视化每个孔在任意通道下的拼接图像马赛克，以及（ii）循环运行专门的算法，用于测量 535 nm 和 450 nm 通道的荧光强度。尽管我们已能够通过延时显微镜观察单个细菌的液泡破裂现象，但我们提醒注意，单个细菌表面的酶活性存在差异，这使得细胞内细菌数量与液泡破裂效率之间的精确关联变得困难。
由于该检测方法具有良好的稳健性，适用于96孔或384孔板的高通量操作。我们还成功地将该方案改造用于FACS分析，以研究悬浮细胞的感染情况16。该检测方法也可用于研究其他在表面展示β-内酰胺酶的细菌或载体，因而具有广泛的应用前景。例如，该方法可用于研究由其他病原体（如表达β-内酰胺酶的Legionella pneumophila、Listeria monocytogenes或Salmonella typhimurium）诱导的液泡破裂12。由于Listeria monocytogenes的感染周期较短，与Shigella flexneri相似，因此可进行延时成像实验。相比之下，由于Legionella pneumophila和Salmonella typhimurium的感染周期较长，建议进行终点实验。
多种可能的应用使得 CCF4-AM/β-内酰胺酶检测成为一种有趣的荧光测定方法，可用于追踪固定样本或实时条件下由胞内病原体诱导的液泡破裂。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由法国国家研究局和欧洲研究理事会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LiveBlazer FRET-B/G 加载试剂盒（CCF4-AM） | Invitrogen | K1089 | 避光保存，分装后于 -80 °C 贮存 |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P9155 | |
| μ CLEAR-黑板，96 孔 | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek 公司 | P35G-1.5-10-C | |
| 丙磺舒 | Sigma | P8761 | |
| β-内酰胺酶 | Sigma | P0389 |
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