电穿孔法标记鸡胚后脑以示踪轴突投射路径及突触靶点

摘要

神经元网络如何在胚胎大脑中建立是发育神经生物学中的一个基本问题。在此，我们将电穿孔技术与新型遗传工具相结合，如在禽类后脑中使用Cre/Lox质粒和PiggyBac介导的DNA转座系统，以标记背侧中间神经元，并在不同发育阶段追踪其轴突投射及突触靶点。

摘要

对鸡胚神经管进行电穿孔具有多种优势，例如可快速高效地将外源基因导入神经元细胞。本文提供了一种独特的方法，用于在 E2.75 时期对禽类后脑进行 DNA 电穿孔，以特异性标记一部分神经前体细胞，并追踪其轴突投射及突触靶标在后续发育阶段（直至 E14.5）的动态变化。我们采用了多种新型遗传工具，包括特异性增强子元件、基于 Cre/Lox 的质粒以及 PiggyBac 介导的 DNA 转座系统，以驱动 GFP 在后脑特定亚型细胞（背侧最上方的中间神经元亚群，dA1）中表达。在胚胎发育的早期和晚期，于脑干多个区域追踪了 dA1 轴突的走行路径及其靶向分布。该策略为在胚胎后脑中靶向特定细胞以及在多个发育阶段追踪神经环路形成提供了先进的技术手段。

引言

后脑是神经系统的关键中继枢纽，通过上行和下行神经网络在中枢神经系统与周围神经系统之间进行通信。它调控多种基本功能，包括呼吸、意识、听觉和运动协调^1-3。在早期胚胎发育过程中，脊椎动物的后脑沿其前后（AP）轴暂时划分为一系列重复的菱脑节，在这些菱脑节中形成不同类型的神经元，并产生多个脑干核团中心⁴。后脑还沿其背腹（DV）轴分为基板和翼板，在不同DV位置上特定的神经前体细胞被确定并分化^3,5,6。目前尚不清楚早期AP和DV特异性的神经元模式如何调控功能性脑干神经环路的建立。

为了探究这一基础科学问题，需要借助特定工具来标记早期后脑中特定的神经元亚群，并在更晚的发育阶段示踪其轴突走向及连接性。我们此前曾利用特定增强子元件以及基于Cre/LoxP的条件性表达系统，在早期鸡胚中追踪背侧脊髓中间神经元的轴突轨迹^7-9。在本研究中，我们聚焦于后脑区域，并改进了实验方案，采用改良的电穿孔策略结合PiggyBac介导的DNA转座技术，实现对晚期胚胎后脑中间神经元、轴突及其突触靶点的标记。这一新策略使我们能够在后脑的一侧标记不同的神经元亚型，并在电穿孔后2至12天的不同胚胎发育阶段，追踪其轴突投射路径及突触形成位点。基于该方法，我们标记了后脑中最背侧的中间神经元亚群（dA1/Atoh1⁺细胞），并揭示了两种不同的对侧上行轴突投射模式，每种模式起源于不同的前后（AP）位置，并在不同的索束....

方案

1. 后脑电穿孔

1.1 蚕卵处理

1. 将鸡蛋水平放置于加湿的孵育箱中（37-38.5 °C）。孵育65-70小时后，当胚胎发育至16-17（HH）期（25-30个体节）时，进行电穿孔操作。
2. 从孵育箱中取出鸡蛋；保持其水平位置。

1.2 准备工作

1. 拉制玻璃毛细管（直径 0.5 mm）。
2. 将弯曲的 L 形金质 Genetrodes 电极（直径 3 mm）通过适配器连接至脉冲发生器。电穿孔参数包括：25 伏电压、5 次脉冲、脉冲时长 45 毫秒、脉冲间隔 300 毫秒。
3. 准备口吸移液管、10 ml 注射器针头、石蜡膜条、软毛刷、锋利的解剖剪刀以及 25 ml 无菌 PBS 溶液。此用量通常足以处理一个蛋盘（18 枚蛋）。
4. 配制适量的 DNA 质粒混合物（每种 5 μg/μl），并加入约 0.025% 的 Fast Green 染料以可视化 DNA 注射过程。通常，一个蛋盘的注射量约为 4 μl 即可。

1.3 窗口化、注射与电穿孔

1. 用 70% 乙醇清洁蛋壳。
2. 每次操作一个鸡蛋，以尽量减少胚胎暴露在空气中的时间。
3. 用剪刀尖在蛋的极部开一个小孔，并用注射器吸出 3–4 m....

结果

最近，该方案被用于揭示鸡胚胎后脑中间神经元 dA1 亚群的轴突形态及其投射位点¹⁰。为了特异性地标记这些轴突，研究人员确认了一段增强子元件（Atoh1）在后脑 dA1 细胞中表达，该元件此前已被鉴定为脊髓 dI1 神经元的特异性标记物^8,12,1310。将该元件克隆至 Cre 重组酶上游，并在 E2.75 时期与一种 Cre 依赖的胞质 GFP 报告质粒（pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP；图 1BI）共同进行电穿孔转染。电穿孔后 48 小时，通过整体脑组织平铺制备法分析后脑，结果显示了两种对侧上行轴突投射模式（图 2A）：其中一条纤维束完全来源于位于菱脑节 6-7 的 dA1 神经元，并沿背索延伸；另一条则起源于菱脑节 2-5 的神经元，并沿外侧索延伸。

为了在发育后期阶段绘制dA1中间神经元的轴突投射图谱，采用了PiggyBac转座方法^14,15。将报告基因Cre条件型肉豆蔻酰化GFP（mGFP）表达盒（PB.......

讨论

在鸡胚神经系统发育过程中，in ovo 电穿孔是一种可行、可靠且有效的工具，可用于研究细胞命运决定及轴突导向²⁰。本实验方案描述了一种在鸡胚后脑 E2.75 期进行电穿孔的方法，利用增强子元件实现特定中间神经元的条件性标记。该策略结合 PiggyBac 介导的转座系统，将外源基因插入鸡基因组，从而可在胚胎发育的较晚阶段追踪轴突路径、投射模式及突触形成位点。

此前用于标记鸡后脑轴突/突触的方法包括经典的逆行或顺行染料标记或组织移植实验^21-23。这些研究对后脑上行和下行轴突束的通路提供了重要的发现。然而，这些基于细胞水平的方法忽略了某些轴突路径和投射。此外，投射至已报道的纤维束中的神经元亚群的分子特性也无法被揭示。我们结合电穿孔与持续性遗传示踪的方法，能够独特地追踪选定后脑神经元从命运决定阶段到轴突导航及其投射靶区的整个发育过程¹⁰。值得注意的是，我们此前已应用该方法在较短时间内追踪脊髓背侧中间神经元的轴突走向^8,9。

.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L形金质Genetrodes 3 mm电极	BTX, Harvard Apparatus	45-0162
脉冲发生器，ECM 830	BTX, Harvard Apparatus	45-0002
OCT（最佳切割温度）包埋剂	Tissue-Tek Sakura	4583 O.C.T. Compound
指甲油	任意商业供应商