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方法文章

体外 红细胞溶血实验用于评估pH响应性内体裂解剂对生物大分子药物的胞质递送效果

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DOI：

10.3791/50166

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2013年3月9日

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1Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Institute for Nanoscale Science & Engineering, Vanderbilt University, 3Interdisciplinary Materials Science Program, Vanderbilt University, 4Monroe Carell Jr. Children's Hospital, Vanderbilt University Medical Center, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 6Department of Cancer Biology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

溶血实验可用于快速、高通量地筛选药物递送系统在细胞内货物递送中的细胞相容性及内涵体裂解活性。该实验通过检测红细胞膜在不同环境pH条件下的破裂程度来评估其效应。

摘要

构成内体-溶酶体囊泡的磷脂双分子层可能成为生物药物递送至细胞内靶点的障碍。为了克服这一障碍，已设计出多种合成药物载体，能够主动破坏内体膜并将货物分子递送至细胞质。本文中，我们介绍一种溶血试验，可用于快速、高通量地筛选细胞内药物递送系统的细胞相容性及内体裂解活性。

在溶血试验中，将人红细胞与待测材料在特定 pH 值的缓冲液中共同孵育，以模拟细胞外、早期内体及晚期内体-溶酶体环境。孵育后通过离心步骤沉淀完整的红细胞，随后分光光度法测定释放到上清液中的血红蛋白含量（最佳动态范围检测波长为 405 nm）。然后，相对于去污剂裂解的阳性对照样品，计算红细胞破坏的百分比。在此模型系统中，红细胞膜作为包裹内体-溶酶体囊泡的脂双层膜的替代物。理想的结果是在生理 pH 值（7.4）下几乎不发生溶血，而在内体-溶酶体 pH 范围（约 pH 5–6.8）内发生显著溶血。

引言

尽管细胞内存在许多潜在的高影响力治疗靶点，但将药物递送至细胞内仍面临重大挑战。通常情况下，药物（尤其是生物制剂）会被细胞内吞并转运至囊泡中，这些囊泡要么通过内体-溶酶体途径导致其内容物降解，要么通过胞吐作用将药物重新排出细胞外via exocytosis。1 在后一过程中，囊泡内部的pH值会酸化至约5-6，这是该区室中发挥作用的酶（如溶菌酶）发挥最佳活性的最适pH值。2

近年来，已有一些材料被专门设计用于利用内体的酸化特性，以促进其载荷向细胞质的递送。其中一种方法采用合成的聚合物胶束纳米颗粒，其核心在生理 pH 值（即 7.4）下呈两性离子且净电荷为中性。然而，在 pH 6.0–6.5 条件下，这些聚合物会发生质子化，获得净正电荷，从而破坏胶束核心的稳定性，暴露出的聚合物片段可与内体膜相互作用并使其破裂。研究表明，这种作用可促进肽类和核酸类治疗药物从内体逃逸，使其能够到达细胞质中的靶点。3,4 其他旨在介导内体逃逸并破坏膜屏障的方法还包括“融合性”肽或蛋白质，它们可介导磷脂双分子层的膜融合或瞬时孔道形成。5 另一种研究较为深入的方法是使用阴离子烷基丙烯酸的均聚物，例如聚丙烯酸（poly(propylacrylic acid)），在这些聚合物中，侧链羧酸基团的质子化状态决定了其在内体-溶酶体 pH 范围内转变为疏水性、可破坏膜的活性状态。6,7

一种用于筛选内体裂解行为的有用模型系统是 离体 pH依赖性溶血实验8 在此模型系统中，红细胞膜作为包绕内体-溶酶体囊泡的脂质双层膜的替代物。这一可推广的模型已被其他研究者用于评估穿膜肽及其他聚合物基因递送系统的内体裂解行为。8-11 在本实验中，人红细胞与待测材料在特定 pH 的缓冲液中共同孵育，以模拟细胞外环境（7.4）、早期内体（6.8）以及晚期内体-溶酶体（< 6.8）环境。通过定量孵育期间释放的血红蛋白量来衡量红细胞裂解程度，并以去污剂裂解的阳性对照样品中释放的血红蛋白量作为基准进行归一化。

通过筛选少量可能具有内体裂解活性的测试材料，可以推断：在 pH 7.4 条件下不引起溶血，但在 pH < 6.5 时显著增加溶血的样品，将是用于胞质药物递送的最有效且细胞相容性最佳的候选材料。符合这些标准的材料预期在正常生理 pH 下保持惰性，不会无差别地破坏脂质双分子层膜（i.e. 避免引起细胞毒性），只有在被细胞内吞进入内体-溶酶体区室后遭遇局部 pH 下降时才被激活并发挥作用。

在本实验方案中，从人类供体分离红细胞，并在pH 5.6、6.2、6.8或7.4条件下与实验性内体裂解药物递送剂共同孵育。完整红细胞经离心沉淀后，收集上清液（含裂解红细胞释放的血红蛋白），检测血红蛋白的特征性吸光度。 通过 酶标仪（图1).

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方案

1. 缓冲液和测试试剂的准备与灭菌

  1. 150 mM NaCl 缓冲液：将 4.383 g NaCl 晶体溶解于 500 ml 纳米纯水中。
  2. pH 缓冲液：通过混合适量的一碱和二碱磷酸氢二钠，配制 pH 为 5.6、6.2、6.8 和 7.4 的磷酸盐缓冲液。如果样品需要在较低 pH 值（即 pH < 5.6）下测试，则应使用更合适的缓冲液，例如柠檬酸盐缓冲液。缓冲液配方 readily available，此处已提供一个参考示例。12
  3. 使用瓶顶式真空过滤装置对上述所有缓冲液进行灭菌，并重新检测缓冲液的 pH 值。
  4. 20% Triton X-100（阳性对照）：将 20 ml 纯 Triton X-100 与 80 ml 纳米纯水混合。剧烈涡旋并超声处理以溶解。使用前于室温下静置过夜。

2. 红细胞的制备

  1. 从匿名人类献血者获取 25 ml 血液，直接采集至经 K2-EDTA 涂层的真空采血管中，以防止凝血。

注意：所有操作步骤必须事先获得相应机构审查委员会（IRB）的批准，且静脉穿刺和采血必须由经过培训的采血人员执行，以最大限度降低对供体的风险。标准采血操作流程已在其他文献中发表。13

  1. 以500 × g离心血液5分钟，标记离心管中红细胞压积（红色，下层）和血浆（淡黄色，上层）的界面位置。
  2. 轻柔地吸出血浆 通过 使用移液器加入漂白剂中，然后丢弃至生物危害废物容器中。
  3. 用150 mM NaCl溶液将血细胞比容管填充至标记线（血浆原始液面位置）。盖紧管帽，轻轻颠倒数次以混匀。在500 × g条件下离心5分钟。
  4. 重复步骤 2.3–2.4，再次洗涤血细胞。然后吸除上清液，加入 pH 7.4 的 PBS 重悬。颠倒混匀。
  5. 将血液均匀分装至四个试管中，每个试管对应待检测的一个pH值。根据待检测的pH值（5.6、6.2、6.8、7.4）标记试管。
  6. 将血液样本管在500 × g离心5分钟。在管壁上标记液面位置，然后吸除上清液。
  7. 用适当 pH 的缓冲液（如 2.6 中所示）将每根试管加至标记线处。
  8. 标记四个50 ml离心管（每个待测pH值对应一个），并用移液器将49 ml相应pH的PBS加入各离心管中。
  9. 加入1 ml红细胞（相同pH）至相应试管中，进行1:50稀释。肉眼观察稀释后的血液，应呈浑浊状，静置后会沉淀。若无沉淀形成，则表明细胞已裂解。

3. 裂解实验96孔板设置与定量

  1. 配制所有实验性药物递送剂的储备液，浓度为待测试目标终浓度的20倍（检测体系中将加入10 μl药物递送剂和190 μl稀释的红细胞，使药物递送剂在最终测试体系中被稀释20倍）。建议配制20、100和800 μg/ml的储备液，分别对应终浓度为1、5和40 μg/ml。
  2. 将每种储备液各10 μl用移液器加入V型底96孔板中。为获得最佳结果，每个样品建议设三复孔或四复孔。

注意：为方便起见，建议为每个待测 pH 值分别准备一块 96 孔板，每个样品（在每个浓度下）在每块板上设置 n=3–4 的重复。

  1. 对于阳性对照孔，加入 10 μl 的 20% Triton X-100。
  2. 对于阴性对照孔，加入 10 μl 磷酸盐缓冲液。使用与待测样品相同 pH 的缓冲液。
  3. 用移液器向每孔加入 190 μl 稀释后的红细胞（见 2.10），确保在转移过程中细胞储备液保持均匀。提示：可使用多通道移液器以简化操作。
  4. 将酶标板在 37 °C 下孵育 1 小时（可选：使用轨道摇床或振荡器）。
  5. 以 500 × g 离心 5 分钟，使完整的红细胞沉淀。注意：从离心机中取出酶标板并转移至下一步操作时，应小心操作，避免扰动细胞沉淀。
  6. 使用多通道移液器，将每孔中的 100 μl 上清液转移至透明平底 96 孔板中。注意：若任何样品的细胞沉淀意外被扰动，可重新离心后再进行上清液转移。
  7. 使用酶标仪测定上清液的吸光度。注意，可选用的检测波长范围为 400 - 541 nm。

注意： 不同的酶标仪可能具有不同的饱和点和灵敏度，因此测量波长的选择取决于是否能够将实验样品的溶血数据相对于去污剂处理诱导的最大溶血进行可靠归一化。这需要准确测量阳性对照样品的吸光度值。

  1. 使用 Microsoft Excel 或类似的数据分析软件，计算针对每个 pH 值设置的阴性对照样品（步骤 3.4）的背景吸光度读数的平均值。将该背景吸光度值从在同一 pH 值下测定的所有其他样品中减去。
  2. 背景扣除后，计算阳性对照去污剂处理样品（步骤 3.3）的平均吸光度。然后将所有实验数据点归一化至该平均吸光度值，该值应代表 100% 溶血。最后，将每个孔的数值乘以 100%，以计算相对于去污剂对照组每个孔中发生的溶血百分比。

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结果

通常，表现出理想pH依赖性溶血行为的试剂在药物、核酸或其他生物活性分子的胞质递送方面具有最高的潜力。这一点在图2所示的试剂#1中得到了体现，该试剂在pH 7.4时溶血作用极低，但在内体pH范围（< 6.5）下溶血行为显著增强。某些试剂可能在生理pH范围内即表现出明显的溶血行为（如试剂#2在40 μg/ml时；图2），提示这些试剂可能不具备血液相容性，并在这些浓度下可能具有细胞毒性。

在大多数情况下，溶血也具有剂量依赖性，因为随着受试材料浓度的增加，溶血水平相应升高，尤其是在较低的pH范围（5.6 - 6.2）内更为明显。

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讨论

基于在内体中遇到的 pH 值（图 1；pH 6.8 — 早期内体，pH 6.2 — 晚期内体，pH 5.6 — 溶酶体）下红细胞裂解的情况，可快速有效地筛选具有内体裂解功能的 pH 响应性聚合物或其他试剂14-17。pH 依赖性溶血实验已被用于评估载体介导生物大分子治疗剂（例如 肽、siRNA、寡脱氧核苷酸（ODNs）、蛋白质）从内体释放的能力，该实验的结果可预测其作为细胞内药物递送载体的性能表现3,4,8,18,19。因此，该实验是一种有效的筛选方法，可用于评估聚合物药物载体通过 pH 依赖性膜破坏机制介导细胞内药物递送的能力。

如实验步骤所述，溶血通过检测经实验试剂处理的红细胞上清液的分光光度值来判断。因此，上清液中除血红蛋白外，还可能含有其他来源于红细胞的胞质成分，包括蛋白质和碳水化合物。尽管这些其他成分可能对分光光度检测产生微弱信号，但100%溶血的校准是基于经Triton X-100处理所得的红细胞裂解液。假设同一供体的红细胞含有相似水平的血红蛋白及其他生物分子，则可以合理推断...

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披露

机构审查委员会批准：涉及人类受试者的研究程序已获得范德堡大学机构审查委员会（IRB；方案编号 #111251）的批准。无利益冲突声明。

致谢

作者感谢美国国防部国会指定医学研究项目（#W81XWH-10-1-0445）、美国国立卫生研究院（NIH R21 HL110056）和美国心脏协会（#11SDG4890030）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Vacutainer - K2EDTA 真空采血管Fisher Scientific22-253-145用于血液采集
BD Vacutainer 血液采集针，20.5 号Fisher Scientific02-665-31用于血液采集
BD Vacutainer 采血管支架 / 针头连接器Fisher Scientific22-289-953用于血液采集
BD 品牌异丙醇消毒棉片Fisher Scientific13-680-63用于血液采集
BD Vacutainer 无乳胶止血带Fisher Scientific02-657-6用于血液采集
盐酸（浓）Fisher ScientificA144-500用于调节 D-PBS 的 pH 值
Triton X-100Sigma-AldrichT8787阳性对照
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）Invitrogen14190
Nalgene MF75 无菌一次性瓶顶过滤器组件，含 SFCA 膜Fisher Scientific09-740-44A
BD 96 孔板，平底，组织培养处理聚苯乙烯Fisher Scientific08-772-2C用于实验结束时的读板
BD 96 孔板，圆底，组织培养处理聚苯乙烯Fisher Scientific08-772-17用于红细胞与实验试剂的孵育

参考文献

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细胞质药物递送内体膜破坏血红蛋白释放测定分光光度分析Triton X 对照生理 pH 7.4内体 pH 范围药物载体筛选
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