溶血实验可用于快速、高通量地筛选药物递送系统在细胞内货物递送中的细胞相容性及内涵体裂解活性。该实验通过检测红细胞膜在不同环境pH条件下的破裂程度来评估其效应。
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方法文章
体外 红细胞溶血实验用于评估pH响应性内体裂解剂对生物大分子药物的胞质递送效果
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
构成内体-溶酶体囊泡的磷脂双分子层可能成为生物药物递送至细胞内靶点的障碍。为了克服这一障碍，已设计出多种合成药物载体，能够主动破坏内体膜并将货物分子递送至细胞质。本文中，我们介绍一种溶血试验，可用于快速、高通量地筛选细胞内药物递送系统的细胞相容性及内体裂解活性。
在溶血试验中，将人红细胞与待测材料在特定 pH 值的缓冲液中共同孵育，以模拟细胞外、早期内体及晚期内体-溶酶体环境。孵育后通过离心步骤沉淀完整的红细胞，随后分光光度法测定释放到上清液中的血红蛋白含量（最佳动态范围检测波长为 405 nm）。然后，相对于去污剂裂解的阳性对照样品，计算红细胞破坏的百分比。在此模型系统中，红细胞膜作为包裹内体-溶酶体囊泡的脂双层膜的替代物。理想的结果是在生理 pH 值（7.4）下几乎不发生溶血，而在内体-溶酶体 pH 范围（约 pH 5–6.8）内发生显著溶血。
引言
尽管细胞内存在许多潜在的高影响力治疗靶点，但将药物递送至细胞内仍面临重大挑战。通常情况下，药物（尤其是生物制剂）会被细胞内吞并转运至囊泡中，这些囊泡要么通过内体-溶酶体途径导致其内容物降解，要么通过胞吐作用将药物重新排出细胞外via exocytosis。1 在后一过程中，囊泡内部的pH值会酸化至约5-6，这是该区室中发挥作用的酶（如溶菌酶）发挥最佳活性的最适pH值。2
近年来，已有一些材料被专门设计用于利用内体的酸化特性，以促进其载荷向细胞质的递送。其中一种方法采用合成的聚合物胶束纳米颗粒，其核心在生理 pH 值（即 7.4）下呈两性离子且净电荷为中性。然而，在 pH 6.0–6.5 条件下，这些聚合物会发生质子化，获得净正电荷，从而破坏胶束核心的稳定性，暴露出的聚合物片段可与内体膜相互作用并使其破裂。研究表明，这种作用可促进肽类和核酸类治疗药物从内体逃逸，使其能够到达细胞质中的靶点。3,4 其他旨在介导内体逃逸并破坏膜屏障的方法还包括“融合性”肽或蛋白质，它们可介导磷脂双分子层的膜融合或瞬时孔道形成。5 另一种研究较为深入的方法是使用阴离子烷基丙烯酸的均聚物，例如聚丙烯酸（poly(propylacrylic acid)），在这些聚合物中，侧链羧酸基团的质子化状态决定了其在内体-溶酶体 pH 范围内转变为疏水性、可破坏膜的活性状态。6,7<....
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方案
1. 缓冲液和测试试剂的准备与灭菌
- 150 mM NaCl 缓冲液：将 4.383 g NaCl 晶体溶解于 500 ml 纳米纯水中。
- pH 缓冲液：通过混合适量的一碱和二碱磷酸氢二钠，配制 pH 为 5.6、6.2、6.8 和 7.4 的磷酸盐缓冲液。如果样品需要在较低 pH 值（即 pH < 5.6）下测试，则应使用更合适的缓冲液，例如柠檬酸盐缓冲液。缓冲液配方 readily available，此处已提供一个参考示例。12
- 使用瓶顶式真空过滤装置对上述所有缓冲液进行灭菌，并重新检测缓冲液的 pH 值。
- 20% Triton X-100（阳性对照）：将 20 ml 纯 Triton X-100 与 80 ml 纳米纯水混合。剧烈涡旋并超声处理以溶解。使用前于室温下静置过夜。
2. 红细胞的制备
- 从匿名人类献血者获取 25 ml 血液，直接采集至经 K2-EDTA 涂层的真空采血管中，以防止凝血。
注意：所有操作步骤必须事先获得相应机构审查委员会（IRB）的批准，且静脉穿刺和采血必须由经过培训的采血人员执行，以最大限度降低对供体的风险。标准采血操作流程已在其他文献中发表....
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结果
通常，表现出理想pH依赖性溶血行为的试剂在药物、核酸或其他生物活性分子的胞质递送方面具有最高的潜力。这一点在图2所示的试剂#1中得到了体现，该试剂在pH 7.4时溶血作用极低，但在内体pH范围（< 6.5）下溶血行为显著增强。某些试剂可能在生理pH范围内即表现出明显的溶血行为（如试剂#2在40 μg/ml时；图2），提示这些试剂可能不具备血液相容性，并在这些浓度下可能具有细胞毒性。
在大多数情况下，溶血也具有剂量依赖性，因为随着受试材料浓度的增加，溶血水平相应升高，尤其是在较低的pH范围（5.6 - 6.2）内更为明显。
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讨论
基于在内体中遇到的 pH 值（图 1；pH 6.8 — 早期内体，pH 6.2 — 晚期内体，pH 5.6 — 溶酶体）下红细胞裂解的情况，可快速有效地筛选具有内体裂解功能的 pH 响应性聚合物或其他试剂14-17。pH 依赖性溶血实验已被用于评估载体介导生物大分子治疗剂（例如 肽、siRNA、寡脱氧核苷酸（ODNs）、蛋白质）从内体释放的能力，该实验的结果可预测其作为细胞内药物递送载体的性能表现3,4,8,18,19。因此，该实验是一种有效的筛选方法，可用于评估聚合物药物载体通过 pH 依赖性膜破坏机制介导细胞内药物递送的能力。
如实验步骤所述，溶血通过检测经实验试剂处理的红细胞上清液的分光光度值来判断。因此，上清液中除血红蛋白外，还可能含有其他来源于红细胞的胞质成分，包括蛋白质和碳水化合物。尽管这些其他成分可能对分光光度检测产生微弱信号，但100%溶血的校准是基于经Triton X-100处理所得的红细胞裂解液。假设同一供体的红细胞含有相似水平的血红蛋白及其他生物分子，则可以合理推断.......
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披露
机构审查委员会批准：涉及人类受试者的研究程序已获得范德堡大学机构审查委员会（IRB；方案编号 #111251）的批准。无利益冲突声明。
致谢
作者感谢美国国防部国会指定医学研究项目（#W81XWH-10-1-0445）、美国国立卫生研究院（NIH R21 HL110056）和美国心脏协会（#11SDG4890030）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer - K2EDTA 真空采血管 | Fisher Scientific | 22-253-145 | 用于血液采集 |
| BD Vacutainer 血液采集针，20.5 号 | Fisher Scientific | 02-665-31 | 用于血液采集 |
| BD Vacutainer 采血管支架 / 针头连接器 | Fisher Scientific | 22-289-953 | 用于血液采集 |
| BD 品牌异丙醇消毒棉片 | Fisher Scientific | 13-680-63 | 用于血液采集 |
| BD Vacutainer 无乳胶止血带 | Fisher Scientific | 02-657-6 | 用于血液采集 |
| 盐酸（浓） | Fisher Scientific | A144-500 | 用于调节 D-PBS 的 pH 值 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 阳性对照 |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS） | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 无菌一次性瓶顶过滤器组件，含 SFCA 膜 | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96 孔板，平底，组织培养处理聚苯乙烯 | Fisher Scientific | 08-772-2C | 用于实验结束时的读板 |
| BD 96 孔板，圆底，组织培养处理聚苯乙烯 | Fisher Scientific | 08-772-17 | 用于红细胞与实验试剂的孵育 |
参考文献
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th, Garland Science. (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S.
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重印与许可
