从小鼠派伊尔集合淋巴结中分离并免疫染色淋巴细胞与树突状细胞

摘要

人们对了解派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中特定细胞亚群的免疫学功能日益关注，PPs 是肠道相关淋巴组织的主要诱导部位。本文概述了制备 PPs 单细胞悬液用于流式细胞术分析以及制备 PPs 冷冻切片用于免疫染色的并行实验方案。

摘要

派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues, GALT）的重要组成部分，在肠道免疫监视和稳态维持中发挥核心作用。肠道腔内的颗粒性抗原和微生物持续被滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）中的PP M细胞取样，并转运至下方的树突状细胞（dendritic cells, DCs）、巨噬细胞和淋巴细胞构成的免疫细胞网络。本文描述了小鼠PPs的两种实验方案：（i）将PPs解离为单细胞悬液并进行流式细胞术分析；（ii）制备冷冻切片用于免疫染色。对于流式细胞术，PPs通过机械法解离后，经70 μm细胞筛过滤，以获得不含上皮细胞和大块碎片的单细胞悬液。从20–25个PPs（来自四只小鼠）开始，该方法快速且可重复，可获得大量 >2.5 × 10⁶ 细胞与 >90%细胞活力。对于冷冻切片，新鲜分离的派伊尔结（Peyer's patches）需浸入最佳切割温度（OCT）包埋剂中，置于液氮中速冻，随后使用冷冻切片机进行切片。组织切片（5–12 μm）经空气干燥后，用丙酮或甲醇固定，再进行免疫标记。

引言

派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是人类和小鼠小肠中遍布的、由有序排列的淋巴滤泡组成的宏观聚集体。图1是启动针对饮食抗原、共生细菌、微生物病原体以及口服疫苗的黏膜免疫应答的主要部位 ^1-4与其他外周淋巴组织（如肠系膜淋巴结）不同，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）缺乏输入淋巴管。因此，PPs中的适应性免疫应答是由肠腔来源的抗原所驱动。肠腔抗原的取样由滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）完成，FAE由肠上皮细胞和一种称为M细胞的抗原取样细胞共同组成。在FAE下方的上皮下穹隆区（sub-epithelial dome, SED），分布着树突状细胞（dendritic cells, DCs）的网络，其间混杂有巨噬细胞、B细胞和CD4+ T细胞。⁺ T细胞 ^5-9每个派伊尔集合淋巴结（PP）淋巴滤泡的核心是滤泡树突状细胞（FDCs）和富含B细胞的中央生发中心，其两侧为富含T细胞的滤泡间区。PP对抗原的摄取可诱导产生IgA+ B细胞浆母细胞和CD4+ T细胞应答。⁺ 效应细胞和记忆细胞定植于周围的固有层，为抵御多种黏膜病原体提供免疫保护。

解析与PP中抗原取样、加工和呈递相关的复杂免疫学事件是一项艰巨的任务，考虑到PP细胞仅占肠道黏膜中淋巴细胞总数的一小部分。为协助此项研究 体外 在此环境中对细胞进行表征，我们提供了一种用于制备小鼠PP细胞以进行流式细胞术和功能分析的方案，以及一种用于制备PP冷冻切片以进行免疫荧光显微镜和免疫组织化学分析的方案。我们关于小鼠PP细胞的分离、表征和免疫染色的方案并非新颖 本身，这一点已得到证实，因为有大量可追溯至25年以前的文献引用了这些技术 ^5,6,9-11相反，我们的方案为初次收集PPs的研究人员提供了一种简化的（可视化）方法。我们所描述的技术易于掌握，可轻松获得大量细胞，且具有 >90% 细胞活力。该冷冻切片方案可获得高度可重复的连续切片，非常适合免疫荧光染色和共聚焦成像。此外，本方案还补充了另外两种近期 乔维 文章。第一篇由Fukuda及其同事撰写，描述了使用结扎回肠环实验来评估病原菌被派伊尔集合淋巴结M细胞摄取的情况 ¹²另一种方法由Geem及其同事描述，介绍了从小鼠肠道黏膜中分离和鉴定树突状细胞与巨噬细胞的技术，但明确排除了派伊尔集合淋巴结（PPs）的分析。 ¹³.

方案

动物在常规的无特定病原体条件下饲养，并完全遵循瓦兹沃思中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行处理。

1. 口服灌胃

1. （可选）使用22 G ×1.5英寸钝头喂养针（Popper Scientific，New Hyde Park，NY）对选定的小鼠品系进行抗原或目标微生物的灌胃。每只小鼠的给药体积不应超过400 μl。

2. 用于流式细胞术的PP细胞分离

1. 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南，通过 CO₂ 窒息法对小鼠实施安乐死。
2. 手术前用 70% 乙醇或碘伏清洁腹部。沿腹中线进行标准剖腹手术，从肋骨基底部约 1.5 cm 处开始，使用外科剪做一单个（1 cm）切口。暴露腹腔并识别盲肠。在回肠-盲肠交界处剪断末端小肠，并轻柔地完整取出肠道。在将肠道从腹腔取出时，注意不要过度拉伸肠组织。
3. 将小肠置于湿润的纸巾或 Kimwipe 上。用生理盐水轻轻润湿小肠，以防止组织脱水。在小肠对系膜侧肉眼识别各个派伊尔结（PP）（图 1）。通常，单只小鼠有 5 至 10 个可见的派伊尔结，从十二指肠（近端）到回肠（远端）均匀分布。平均而言，四只小鼠可获得 23 个派伊尔结。
4. 使用弯头外科剪，轻柔地切除各个派伊尔结，并将其放入冷的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。注意，剪刀应弯曲面朝上，置于派伊尔结上方，然后轻柔地施加于组织。仅切除派伊尔结（不包括周围组织），并转移至冷的 HBSS 中。
   注意：从本节第 2 步开始，所有孵育和离心步骤均应在 4 °C 下进行，以保持细胞活性。
5. 将派伊尔结转移至 5 ml 脾脏解离培养基中，在 37 °C 下孵育 15–20 分钟，同时以 250 rpm 剧烈振荡。孵育时间过长将对细胞活性产生不利影响。
6. 为获得单细胞悬液，将派伊尔结置于无菌（经高压灭菌）的 70 μm 尼龙网细胞筛上，使用 1 ml 注射器推杆底部用力研磨组织使其通过筛网。或者，将派伊尔结夹在两张无菌磨砂玻璃载玻片（经高压灭菌并封装于纸袋中）之间，以来回运动的方式轻柔研磨组织。使用无菌移液管将细胞悬液转移至 5 ml Falcon 管中。
7. 向细胞悬液中加入 EDTA，使其终浓度为 1 mM。在室温下于摇床上孵育 5 分钟。
8. 将细胞悬液倾倒通过第二个 70 μm 细胞筛，以去除任何残留的细胞聚集体或组织碎片。将细胞收集至 15 或 50 ml 锥形管中。
9. 对细胞进行轻柔离心（500 × g 离心 5 分钟）。弃去上清液，并将细胞重悬于流式缓冲液中，该缓冲液为含 1% 胎牛血清（FCS）的磷酸盐缓冲液（PBS）。
10. 为确定细胞数量和活性，将细胞以 1:10 比例稀释于台盼蓝溶液中，使用光学显微镜和血细胞计数板进行细胞观察。或者，可使用 Countess 细胞计数仪（Invitrogen）或类似仪器自动测定细胞数量和活性。
    起始使用 20–25 个派伊尔结时，本方案应可获得 >2.5 × 10⁶ 个总细胞。相当于每只小鼠约 0.8–1.2 × 10⁶ 个细胞。

用于流式细胞术的细胞抗体标记

11. 将细胞（每孔 10⁵ 个）加入 96 孔圆底板的各孔中。
12. 将培养板进行轻柔离心（1,000 × g，5 分钟），然后通过轻轻翻转培养板弃去上清液。
13. 用 Fc 封闭缓冲液重悬细胞，在冰上孵育 15 分钟。尽管市面上有多种商用 Fc 封闭缓冲液（例如 大鼠抗小鼠 CD16/CD32，BD Biosciences），我们在此步骤中仅使用来自大鼠 B 细胞杂交瘤（ATCC 2.4.G2）的用过的培养基，该杂交瘤细胞可分泌针对小鼠 Fcγ 受体的单克隆 IgG₁ 抗体。
14. 同上，将培养板进行轻柔离心（1,000 × g，5 分钟），然后通过轻轻翻转培养板弃去上清液。
15. 将荧光标记抗体直接按所需稀释比例加入细胞悬液中，在冰上孵育 30 分钟，并持续振荡。
16. 将培养板进行轻柔离心（1,000 × g，5 分钟），然后通过轻轻翻转培养板弃去上清液。
17. 用 100 μl 流式缓冲液洗涤细胞。
18. 以 1,000 × g 离心 5 分钟，然后通过轻轻翻转培养板弃去上清液。
19. 用 400 μl 固定缓冲液重悬细胞，该缓冲液由 300 μl 流式缓冲液和 100 μl 含 1% 多聚甲醛的 PHEM 缓冲液（60 mM PIPES、25 mM HEPES、10 mM EGTA、4 mM MgCl₂，pH 6）组成。
20. 使用 FACSCalibur 或同等仪器对细胞进行流式细胞术检测，并使用 Cell Quest Pro 软件 5.2 版本分析结果。

3. PP 冷冻切片的制备

1. 在采集组织前，将最佳切割温度（OCT）包埋剂加入 7×7×5 mm 的塑料底模中。同时准备一个液氮池（>750 ml），置于杜瓦瓶或冰桶中。
2. 处死小鼠并按上述方法进行剖腹手术。取出肠道并置于湿润的纸巾上。
3. 为分离派伊尔结（Peyer's patches, PPs）以进行冷冻切片，截取包含单个PP的长约0.5 cm的小肠横断段，并将组织转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。用PBS轻轻冲洗这些肠段的管腔，以去除不必要的粪便残渣。
4. 将肠道组织段垂直放入含有OCT的底模中。将模具浸入液氮中，使组织完全冻结（1–2分钟）。当OCT由透明变为白色时，表明组织已完全冻结。若需更缓慢的冷却过程（例如，以减少OCT开裂），可将模具浸入由液氮蒸气冷却的异戊烷浴中。注意：操作液氮时应佩戴合适的安全护目镜。
5. 用镊子从液氮中取出已冻结的底模，使其在室温下稍作回温（约10–15秒），直至OCT块边缘略微软化。随后将模具翻转，轻压底部，使冻结的OCT组织块脱模并落入一张洁净的4×4 cm铝箔上。立即用铝箔包裹组织，并放入标记好的样本袋中，储存于液氮或干冰中。或者，可将组织转移至冷冻冰箱（<-20 °C）。组织应在一周内使用，否则随着时间推移，组织块会变脆。

冷冻切片

6. 使用 Leica CM3050S 冷冻切片机或同等设备对组织进行冷冻切片。冷冻切片机的腔室温度应设置为 -21 °C。
7. 力求获得厚度为 12–14 μm 的切片。
8. 将切片转移至 Fisher SuperFrost Plus（或同等）载玻片上，并使用标准低倍光学显微镜进行肉眼观察。若在同一张载玻片上收集多个切片，应确保切片集中排列，以便后续染色操作。
9. 将载玻片置于室温下的玻片盒中保存，并尽量在几天内使用。

冷冻切片的抗体标记及共聚焦显微镜分析

10. 将载玻片浸入组织染色缸或支架中的丙酮（或甲醇）中，处理 2 分钟。孵育时间过长可能导致组织从载玻片上脱落。
11. 将载玻片转移至新的染色缸中，用 PBS-T（含 0.05% Tween-20 的 1× PBS）洗涤 3 次，每次 3 分钟。
12. 使用 ImmEdge 疏水笔在组织切片周围画圈。这可确保在孵育过程中试剂和抗体局限于该区域。
13. 将载玻片置于湿盒中，在避光条件下，用封闭缓冲液（含 2% 山羊血清的 PBS）于 37 °C 孵育 30 分钟。
14. 用 Fc 封闭缓冲液（见上文）将载玻片于 37 °C 孵育 10 分钟。
15. 将载玻片浸入 PBS-T 中漂洗，并用 Kimwipes 或其他吸水纸擦干切片周围区域。注意不要触碰实际的组织切片。
16. 在组织切片上覆盖一抗溶液，并在湿盒中于 37 °C 孵育 30 分钟。一抗通常用封闭缓冲液稀释至终浓度为 20 μg/ml。建议使用直接标记的一抗，因为在此步骤中最多可直接混合三种抗体。直接标记的一抗还可省去额外的二抗孵育步骤。
17. 将载玻片浸入 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
18. 如有必要，将载玻片在湿盒中与相应的二抗于 37 °C 孵育 30 分钟。
19. 将载玻片浸入 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
20. 按照上文所述方法，将载玻片在含 1% 多聚甲醛的 PHEM 缓冲液中孵育 4 分钟。
21. 用 PBS 冲洗载玻片 1 分钟。
22. 用 Kimwipes 或其他吸水纸擦干切片周围区域。注意不要触碰实际的组织切片。使用移液器或滴管，轻轻将一滴 Prolong Gold 封片剂直接滴加到切片上。将盖玻片小心地覆盖在封片剂上，避免产生气泡。用吸水纸吸去多余的封片剂。
23. 用市售指甲油将盖玻片密封固定在显微载玻片上，并静置使其自然风干。
24. 使用 Leica TCS SP5 或同等性能的共聚焦显微镜观察载玻片。

结果

对总PP细胞的单分散悬浮液进行流式细胞术分析，可清晰区分优质和劣质细胞样本。在细胞活力超过80%的优质细胞样本中，绝大多数细胞表现出较高的前向散射光信号（FSC），表明细胞体积较大，同时侧向散射光信号（SSC）较低，表明细胞颗粒度较小（图2A）。在本实验中，我们还通过在室温下（而非冰上）进行PP细胞分离过程中的孵育步骤，并在最后一步使用含1% FCS的PBS（而非PHEM缓冲液）孵育细胞，有意制备了“劣质细胞样本”。在这些劣质细胞样本中，大多数细胞表现出低FSC和高SSC，且位于设定门控R1之外（图2B）。这些细胞可能正在经历凋亡和/或坏死。

图3 展示了使用多达四种不同荧光染料偶联的单克隆抗体混合物，以区分派伊尔集合淋巴结（PP）单细胞悬液中的多种细胞类型。通过分化群（CD）标记物 CD19 和 B220 进行标记显示，B细胞约占门控PP细胞群体的60%（图3A）。通过使用抗CD3和CD4（图3B）或抗CD3和...

讨论

本文提供了用于流式细胞术和功能分析的PP单细胞悬液制备，以及用于免疫染色的冷冻切片制备的平行实验方案。只要具备流式细胞仪和冷冻切片机，这两种方法均具有高度可重复性且易于实施。对于初次进行该实验的研究人员需特别指出，与脾脏相比，派伊尔结（PP）的总细胞得率相对较低。尽管如此，我们所描述的方案通常可从单只小鼠获得0.8–1.2 × 10⁶个总PP细胞。虽然可以扩大样本量，但我们通常不合并超过20–25个PP，因为根据我们的经验，过多时会出现细胞聚集，且细胞得率（及活力）会显著下降。另一方面，我们也不建议使用少于15个PP进行本方案操作，因为需要达到一定的细胞总量才能确保细胞顺利通过整个分离流程。如果下游功能实验对细胞活力要求较高，建议对分离得到的少量细胞进行碘化丙啶染色，以便更准确地从总PP细胞群体中圈定活细胞群。最后需要指出的是，若需对特定细胞亚群进行过继转移或in vitro分析，本方法同样适用于细胞分选应用。

收集派伊尔结（PP）组织用于冷冻切片相对简单，但实际切片过程可能具有挑战性。例如，必须确保PP组织在模具中正确放置（即垂直于模具底部...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
7x7x5 mm Base Molds	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge Pen	Vector Labs	H-4000
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	4951
Edge Rite Blade	Thermo Scientific	4280L
Anti-Mouse CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-Mouse CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
Anti-Mouse CD4-PE	BD Pharmigen	553652
Anti- Mouse CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-Mouse CD19-PercP	BioLegend	115531
Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red	Fisher Scientific	14175-079
70 μm cell strainer	BD Falcon	352350
Spleen Dissociation Medium	Stem Cell Technologies	7915
Goat serum	Invitrogen	16210-072
Fc Block	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes obtained from cell line 2.4.G2
Curved Scissor	F.S.T	14061-09
Cryostat	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Countess Cell Counter	Invitrogen
Hematoxylin	Richard Allan	7211
Eosin	Richard Allan	71304
Formalin	Starplex Scientific	3661
Table 1. Reagents and equipment used in this study.