人们对了解派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中特定细胞亚群的免疫学功能日益关注，PPs 是肠道相关淋巴组织的主要诱导部位。本文概述了制备 PP 单细胞悬液用于流式细胞术分析以及制备 PP 冷冻切片用于免疫染色的并行实验方案。
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摘要
摘要
派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues, GALT）的重要组成部分，在肠道免疫监视和稳态维持中发挥核心作用。肠道腔内的颗粒性抗原和微生物持续被滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）中的PP M细胞取样，并转运至下方的树突状细胞（dendritic cells, DCs）、巨噬细胞和淋巴细胞构成的网络中。本文描述了小鼠PPs的两种实验方案：（i）将PPs解离为单细胞悬液并进行流式细胞术分析；（ii）制备冷冻切片用于免疫染色。对于流式细胞术，PPs通过机械法解离后，经70 μm细胞筛过滤，以获得不含上皮细胞和大块碎片的单细胞悬液。从20–25个PPs（来自四只小鼠）开始，这一快速且可重复的方法可得到一群细胞 >2.5 × 106 细胞与 >90%细胞活力。对于冷冻切片，新鲜分离的派伊尔结（Peyer's patches）需浸入最佳切割温度（OCT）包埋剂中，置于液氮中速冻，随后使用冷冻切片机进行切片。组织切片（5–12 μm）经空气干燥后，用丙酮或甲醇固定，再进行免疫标记。
引言
派尔集合淋巴结（Peyer's patches，PPs）是人类和小鼠小肠中遍布的、由有序排列的淋巴滤泡组成的肉眼可见的集合体。图1是启动针对饮食抗原、共生细菌、微生物病原体以及口服疫苗黏膜免疫应答的主要部位 1-4与其他外周淋巴组织（如肠系膜淋巴结）不同，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）缺乏输入淋巴管。因此，PPs中的适应性免疫应答是由来自肠腔的抗原所驱动的。肠腔抗原的取样由滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）完成，FAE由肠上皮细胞和一类称为M细胞的抗原取样细胞共同组成。在FAE下方的上皮下穹隆区（sub-epithelial dome, SED），分布着树突状细胞（dendritic cells, DCs）的网络，其间混杂有巨噬细胞、B细胞和CD4⁺ T细胞。+ T细胞 5-9每个派伊尔集合淋巴结（PP）淋巴滤泡的核心是滤泡树突状细胞（FDCs）和富含B细胞的中央生发中心，其周围为富含T细胞的滤泡间区。PP对抗原的摄取可诱导产生IgA+ B细胞浆母细胞和CD4+ 效应细胞和记忆细胞定植于周围的固有层，为抵御多种黏膜病原体提供免疫保护。
解析与抗原取样、加工及呈递相关的复杂免疫事件在派伊尔集合淋巴结（PPs）中是一项艰巨的任务，考虑到PP细胞仅占肠黏膜中总淋巴细胞的极小部分。为协助这一研究 体外 在此环境中对细胞进行表征，我们提供了一种制备小鼠PP细胞总悬液用于流式细胞术和功能分析的方案，以及一种制备PP冷冻切片用于免疫荧光显微镜和免疫组织化学的方案。我们关于小鼠PP细胞的分离、表征及免疫染色的方案并非新颖 本身，这一点已得到充分证明，因为有大量可追溯至25年多前的文献均引用了这些技术 5,6,9-11相反，我们的方案为首次收集PPs的研究人员提供了一种简化的（且可视化的）方法。我们所描述的技术易于掌握，可快速获得大量细胞，且具有 >90% 细胞活力。该冷冻切片方案可获得高度可重复的连续切片，非常适合免疫荧光染色和共聚焦成像。此外，本方案还补充了另外两种近期 JoVE 文章。第一篇由Fukuda及其同事撰写，描述了使用结扎回肠环实验来评估病原菌被派伊尔集合淋巴结M细胞摄取的情况 12另一种方法由Geem及其同事描述，介绍了从小鼠肠道黏膜中分离和鉴定树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的技术，但其分析中明确排除了派伊尔集合淋巴结（PPs）。 13.
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方案
动物饲养在常规的无特定病原体条件下，并完全遵循瓦兹沃思中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行处理。
1. 口服灌胃
- （可选）使用22 G ×1.5英寸钝端饲喂针（Popper Scientific，New Hyde Park，NY）对选定的小鼠品系进行抗原或目标微生物的灌胃。每只小鼠的给药体积不应超过400 μl。
2. 用于流式细胞术的PP细胞分离
- 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南，通过 CO2 窒息法对小鼠实施安乐死。
- 手术前用 70% 乙醇或碘伏清洁腹部。沿腹中线进行标准剖腹手术，从肋骨基底部约 1.5 cm 处开始，使用外科剪做一单个（1 cm）切口。暴露腹腔并识别盲肠。在回肠-盲肠交界处剪断末端小肠，并轻柔地完整取出肠道。在将肠道从腹腔取出时，注意不要过度拉伸肠组织。
- 将小肠置于湿润的纸巾或 Kimwipe 上。用生理盐水轻轻润湿小肠，以防止组织脱水。在小肠对系膜侧肉眼识别各个派伊尔结（PP）（图 1）。通常，单只小鼠有 5 至 10 个可见的派伊尔结，从十二指肠（近端）到回肠（远端）均匀分布。平均而言，四只小鼠可获得 23 个派伊尔结。
- 使用弯头外科剪，轻柔地切除各个派伊尔结，并将其放入冷的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。注意，剪刀应弯曲面朝上，置于派伊尔结上方，然后轻柔地施加于组织。仅切除派伊尔结（不包括周围组织），并转移至冷的 HBSS 中。
注意：从本节第 2 部分起，所有孵育和离心步骤均应在 4 °C 下进行，以保持细胞活力。 - 将派伊尔结转移至 5 ml 脾脏解离培养基中，在 37 °C 下孵育 15–20 分钟，同时以 250 rpm 剧烈振荡。过长的孵育时间会负面影响细胞活力。
- 为获得单细胞悬液，将派伊尔结置于无菌（经高压灭菌）的 70 μm 尼龙网细胞筛上，使用 1 ml 注射器推杆底部用力研磨组织使其通过滤网。或者，将派伊尔结夹在两张无菌磨砂玻璃载玻片（经高压灭菌并封装于纸袋中）之间，以来回轻柔研磨组织。使用无菌移液管将细胞悬液转移至 5 ml Falcon 管中。
- 向细胞悬液中加入 EDTA，使其终浓度为 1 mM。在室温下于摇床上孵育 5 分钟。
- 将细胞悬液倾倒通过第二个 70 μm 细胞筛，以去除任何残留的细胞聚集体或组织碎片。将细胞收集至 15 或 50 ml 锥形管中。
- 对细胞进行轻柔离心（500 × g 离心 5 分钟）。弃去上清液，并将细胞重悬于流式缓冲液中，该缓冲液为含 1% 胎牛血清（FCS）的磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 为测定细胞数量和活力，将细胞以 1:10 比例稀释于台盼蓝溶液中，并使用光学显微镜和血细胞计数板进行显微观察。或者，可使用 Countess 细胞计数仪（Invitrogen）或类似仪器自动计数细胞数量并评估细胞活力。
起始使用 20–25 个派伊尔结时，本方案应可获得 >2.5 × 106 个总细胞。相当于每只小鼠约 0.8–1.2 × 106 个细胞。
用于流式细胞术的细胞抗体标记
- 将细胞（每孔 105 个）加入 96 孔圆底板的各孔中。
- 将板进行轻柔离心（1,000 × g 离心 5 分钟），然后通过轻轻翻转板去除上清液。
- 用 Fc 封闭缓冲液重悬细胞，在冰上孵育 15 分钟。尽管市面上有多种商用 Fc 封闭缓冲液（例如 大鼠抗小鼠 CD16/CD32，BD Biosciences），我们在此步骤中仅使用来自大鼠 B 细胞杂交瘤（ATCC 2.4.G2）的用过培养基，该细胞系可分泌针对小鼠 Fcγ 受体的单克隆 IgG1 抗体。
- 同上，将板进行轻柔离心（1,000 × g 离心 5 分钟），并通过轻轻翻转板去除上清液。
- 将荧光标记抗体直接按所需稀释比例加入细胞悬液中，在冰上持续振荡孵育 30 分钟。
- 将板进行轻柔离心（1,000 × g 离心 5 分钟），并通过轻轻翻转板去除上清液。
- 用 100 μl 流式缓冲液洗涤细胞。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，然后通过轻轻翻转板去除上清液。
- 用 400 μl 固定缓冲液重悬细胞，该缓冲液由 300 μl 流式缓冲液与 100 μl 含 1% 多聚甲醛的 PHEM 缓冲液（60 mM PIPES、25 mM HEPES、10 mM EGTA、4 mM MgCl2，pH 6）组成。
- 使用 FACSCalibur 或同等仪器对细胞进行流式细胞术检测，并使用 Cell Quest Pro 软件 5.2 版本分析结果。
3. PP 冷冻切片的制备
- 在组织取材前，将最佳切割温度（OCT）包埋剂加入7x7x5 mm的塑料底模中。同时准备一个液氮池（>750 ml），置于杜瓦瓶或冰桶中。
- 处死小鼠并按上述方法进行剖腹手术。取出肠道并置于湿润的纸巾上。
- 为分离派伊尔结（Peyer's patches, PPs）以进行冷冻切片，截取包含单个PP的长约0.5 cm的小肠横段，并将组织转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。用PBS轻轻冲洗这些肠段的管腔，以去除不必要的粪便残渣。
- 将肠组织段垂直放入含有OCT的底模中。将模具浸入液氮中，使组织完全冻结（1–2分钟）。当OCT由透明变为白色时，表明组织已完全冻结。若需更缓慢的冷却过程（例如，以减少OCT开裂），可将模具浸入由液氮蒸气冷却的异戊烷浴中。注意：操作液氮时应佩戴合适的安全护目镜。
- 用镊子将已冻结的底模从液氮中取出，于室温下放置片刻（约10–15秒），直至OCT块边缘略微软化。随后将模具翻转，轻压底部，使冻结的OCT组织块脱模并落入一张洁净的4×4 cm铝箔上。立即用铝箔包裹组织，并放入标记好的样本袋中，储存于液氮或干冰中。或者，可将组织转移至冷冻冰箱（<-20 °C）。组织应在一周内使用，否则随着时间推移，组织块会变脆。
冷冻切片
- 使用 Leica CM3050S 冷冻切片机或同等设备对组织进行冷冻切片。冷冻切片机舱内温度应设定为 -21 °C。
- 力求获得厚度为 12–14 μm 的切片。
- 将切片转移至 Fisher SuperFrost Plus（或同等）载玻片上，并使用标准低倍光学显微镜进行肉眼观察。若在同一张载玻片上收集多个切片，应确保切片紧密聚集，以便后续染色操作。
- 将载玻片置于室温下的玻片盒中保存，并尽量在数日内使用。
冷冻切片的抗体标记及共聚焦显微镜分析
- 将载玻片浸入组织染色缸或支架中的丙酮（或甲醇）中，孵育 2 分钟。长时间孵育可能导致组织从载玻片上脱落。
- 将载玻片转移至新的染色缸中，用 PBS-T（含 0.05% Tween-20 的 1× PBS）洗涤 3 次，每次 3 分钟。
- 使用 ImmEdge 疏水笔在组织切片周围画圈。这可确保在孵育过程中试剂和抗体局限于该区域。
- 在加湿孵育盒中，将载玻片与封闭缓冲液（含 2% 山羊血清的 PBS）于 37 °C 孵育 30 分钟，并避光。
- 在加湿孵育盒中，将载玻片与 Fc 封闭缓冲液（见上文）于 37 °C 孵育 10 分钟。
- 将载玻片浸入 PBS-T 中漂洗，并用 Kimwipes 或其他吸水纸擦干切片周围区域。注意不要触碰实际的组织切片。
- 在组织切片上覆盖一抗溶液，并在加湿孵育盒中于 37 °C 孵育 30 分钟。一抗通常用封闭缓冲液稀释至终浓度为 20 μg/ml。建议使用直接标记的一抗，因为在此步骤中最多可直接混合三种抗体。直接标记的一抗还可省去额外的二抗孵育步骤。
- 将载玻片浸入 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
- 如有必要，在湿盒中加入相应的二抗，于 37 °C 孵育 30 分钟。
- 将载玻片浸入 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
- 按照上述方法，在 PHEM 缓冲液中加入 1% 多聚甲醛，将载玻片孵育 4 分钟。
- 用 PBS 冲洗载玻片 1 分钟。
- 使用 Kimwipes 或其他吸水纸擦干切片周围区域。注意不要触碰实际的组织切片。用移液器或滴管，将一滴 Prolong Gold 封片剂轻轻滴加在切片上。将盖玻片覆盖在封片剂上，注意避免产生气泡。用吸水纸吸去多余的封片剂。
- 用市售指甲油将盖玻片密封固定在显微载玻片上，并静置晾干。
- 使用 Leica TCS SP5 或同等性能的共聚焦显微镜观察载玻片。
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结果
对总胰岛细胞（PP细胞）的单分散悬浮液进行流式细胞术分析，可明确区分细胞样品质量的优劣。在细胞活力超过80%的良好制备样品中，绝大多数细胞表现出较高的前向散射（FSC），表明细胞体积较大，同时侧向散射（SSC）较低，表明细胞颗粒度较小（图2A）。在本实验中，我们还通过在室温下（而非冰上）进行胰岛细胞分离步骤，并在最后一步使用含1% FCS的PBS（而非PHEM缓冲液）孵育细胞，人为制备了“质量较差的细胞样品”。在这些质量较差的样品中，大多数细胞表现出低FSC和高SSC，且位于设定门控R1之外（图2B）。这些细胞可能正在经历凋亡和/或坏死。
图3展示了使用多达四种不同荧光染料偶联的单克隆抗体混合物，以区分派伊尔集合淋巴结（PP）单细胞悬液中的多种细胞类型。通过分化群（CD）标记物CD19和B220进行标记显示，B细胞约占门控PP细胞群体的60%（图3A）。通过CD3与CD4（图3B）或CD3与CD8（
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讨论
本文提供了用于流式细胞术和功能分析的PP单细胞悬液制备，以及用于免疫染色的冷冻切片制备的平行实验方案。只要具备流式细胞仪和冷冻切片机，这两种方法均具有高度可重复性且易于实施。对于初次进行该实验的研究人员需特别指出，与脾脏相比，派伊尔结（PP）的总细胞得率相对较低。尽管如此，我们所描述的方案通常可从单只小鼠获得0.8–1.2 × 106个总PP细胞。虽然可以扩大样本量，但我们通常不汇集超过20–25个PP，因为根据我们的经验，过度汇集会导致细胞聚集，且细胞得率（及活力）显著下降。另一方面，我们也不建议使用少于15个PP进行本实验方案，因为需要达到一定的细胞数量阈值，才能成功完成整个细胞分离流程。如果下游功能实验对细胞活力要求较高，我们建议取少量分离后的细胞进行碘化丙啶染色，以便更准确地从总PP细胞群体中圈定活细胞群。最后需要指出的是，若需对特定细胞亚群进行过继转移或in vitro分析，本方法同样适用于细胞分选应用。
用于冷冻切片的PP组织收集相对简单，但PP组织的实际切片过程可能具有挑战性。例如，必须确保PP组织在模具中正确摆放（即垂直于模具...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Renjie Song（Wadsworth中心流式细胞术核心实验室）在细胞分析方面的协助，以及Helen Johnson（Wadsworth中心动物组织病理学核心实验室）在石蜡切片制备方面的帮助。我们感谢Richard A. Cole博士（Wadsworth中心光学显微镜核心实验室）在共聚焦显微镜使用和图像采集方面的协助。我们谨向Andy Bentley（Wadsworth中心摄影与插图实验室）在动画制作方面的帮助表示感谢。
MDJ 由生命科学研究基金会和霍华德·休斯医学研究所（HHMI）博士后奖学金资助。SA 由瓦兹沃思中心-健康研究公司内部博士后奖学金资助。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 HD061916 和 GM082978 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| OCT包埋剂 | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 毫米底模 | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge笔 | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus 载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 4951 | |
| Edge Rite 刀片 | 赛默飞世尔科技 | 4280L | |
| 抗小鼠 CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| 抗小鼠 CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| 抗小鼠 CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| 抗小鼠 CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| 抗小鼠 CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| 抗小鼠 CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| 不含酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS） | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm细胞滤筛 | BD Falcon | 352350 | |
| 脾脏解离培养基 | 干细胞技术 | 7915 | |
| 山羊血清 | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc阻断 | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | 来自2.4.G2细胞系的上清液 |
| 弯头剪刀 | F.S.T | 14061-09 | |
| 冷冻切片机 | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess 细胞计数仪 | Invitrogen | ||
| 苏木精 | Richard Allan | 7211 | |
| 伊红 | Richard Allan | 71304 | |
| 甲醛 | Starplex Scientific | 3661 | |
<强>表1. 本研究中使用的试剂与设备。 |
参考文献
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