双血管阻断/低血压：大鼠全脑缺血模型

摘要

双侧颈动脉阻断联合全身性低血压可在大鼠中诱导全脑缺血，导致海马区出现可重复的严重损伤。动物模型表现出可预测的脑损伤模式，恢复迅速，且死亡率相对较低。

摘要

心脏骤停后复苏常导致严重的脑损伤，这是由于脑组织缺血及随后再灌注所引起的。全脑缺血会对某些特定脑区造成损害，这些区域已证实对缺血高度敏感¹。与其他细胞群体相比，海马神经元对缺血性损伤更为敏感，尤其是海马的CA1区对缺血/再灌注特别易损²。

设计治疗干预措施或研究脑损伤相关机制时，需要一种能够以可重复方式产生与临床状况相似损伤的模型。双侧颈动脉闭塞联合低血压（2VOH）是一种可诱导可逆性前脑缺血的模型，能够模拟心脏骤停和复苏过程中可能发生的脑部事件。我们描述的模型改良自 Smith et al.（1984）²，其当前形式首次由 Sanderson et al.（2008）³ 报道，该模型可对选择性易损脑区产生可重复的损伤^3-6。该模型的可靠性取决于在诱导低血压期间对全身血压的精确控制、缺血持续时间、严格的体温调节、特定的麻醉方案以及细致的术后护理。8 分钟的缺血损伤可导致海马 CA1 区神经元发生进行性细胞死亡，该过程在再灌注后 6 至 24 小时内逐步发展，而其他较不易受损的脑区则得以保留。这种进行性细胞死亡在再灌注 7 至 14 天后可被轻松量化，因为此时 CA1 区神经元几乎完全丧失。

除了这种脑损伤模型外，我们还介绍了一种利用简单而全面的方法对CA1区损伤进行定量分析的技术。重要的是，该定量分析可通过配备普通摄像头的显微镜和免费的ImageJ（NIH）软件插件完成，从而无需使用价格昂贵的体视学分析软件和配备电机的显微镜载物台来进行损伤评估。

引言

心脏骤停和中风导致的脑损伤是死亡和长期残疾的主要原因。尽管对心脏骤停患者实施心肺复苏每年在美国能够成功恢复约7万名患者的自主循环^7,8，但其中至少60%的患者会因严重的脑损伤而在住院期间死亡，仅有3%-10%的复苏后患者能够恢复以往的生活方式^9,10。显然，阐明全脑缺血后导致脑损伤的机制，并设计有效的治疗干预措施以最大程度减轻神经损伤，具有极为重要的意义。

脑缺血可通过多种方法建模。最常用的方法是在啮齿类动物中通过阻断脑部主要血管——大脑中动脉，从而产生局灶性缺血性卒中^11,12。尽管局灶性脑缺血在临床上具有重要意义，但它并不能准确地用于研究心脏骤停/复苏所导致的脑损伤。为了模拟这一临床情况，需要使整个脑组织发生缺血，随后恢复血流。为更贴近这种临床表现，研究人员通过实验诱导心脏骤停，随后进行心肺复苏（CPR）和除颤来实现复苏^13,14。该模型具有临床相关性，但复苏时间的不可预测性可能增加实验数据的变异性，使结果解释变得困难。此外，该模型伴随较高的死亡率，进一步增加了验证假设所需的动物数量。因此，采用一种更具可重复性、稳定性和可存活性的损伤方式来研究全脑缺血和/或再灌注的脑部反应可能是更优选择。

可以在保留全身部分血流的同时诱导脑部的全脑缺血。这种方法可降低死亡率，同时允许研究脑组织损伤的机制²。为了实现全脑缺血，必须中断或显著限制向脑部供血的四条血管的血流，即两条颈内动脉和两条椎动脉。这些血管通过一个称为威尔斯环（Circle of Willis）的血管结构为脑部供血，该结构形成一个吻合环路。这种血管解剖结构使得在近端血管发生阻塞时，脑部仍能维持一定程度的灌注。因此，要诱导完全的脑缺血，必须阻断所有供血血管的血流。颈动脉的阻断可通过微创的颈部腹侧切开术并使用动脉瘤夹夹闭一定时间来实现。而椎动脉的血流中断则较为困难，因为它们被包埋在脊柱的横突孔内。研究人员已通过在颈动脉阻断和脑缺血前24–48小时对椎动脉进行电凝处理来解决这一问题（即4VO模型）¹⁵。与此方法不同的是，Smith等et al.提出了一种通过系统性降低平均动脉压（MAP）至40 mmHg，从而减少经椎动脉的灌注，使其血流丧失或显著降低的方法来诱导全脑缺血²。当该方法与颈动脉阻断联合使用时，可在前脑引起广泛的缺血，导致脑损伤模式与心脏骤停幸存者高度相似。在对该方法的进一步优化中，本文所呈现的模型要求在整个8分钟缺血期间将MAP严格控制在30 mmHg ± 1 mmHg范围内。我们发现，这一改进提高了该模型所诱导脑损伤的可重复性，同时保留了Smith等et al.原始技术的低死亡率优势。

由本模型引起的细胞死亡的精确表型及组织损伤的总体程度，直接取决于缺血持续时间¹⁶。在经历8分钟缺血后，CA1区神经元表现出延迟性细胞死亡，提示在再灌注阶段存在一个可用于治疗干预的时间窗^15,17。再灌注开始时，神经元迅速恢复功能，且无即刻可检测到的细胞死亡¹⁸。然而，这种损伤会启动细胞死亡级联反应（凋亡），并在再灌注后4–6小时导致线粒体释放促凋亡蛋白，包括细胞色素c^3,19。在再灌注后6至24小时之间，海马CA1区神经元已进入不可逆的死亡过程，凋亡性细胞死亡程序被完全执行¹⁹。需要指出的是，导致缺血性损伤的细胞死亡表型仍存在很大争议。早期研究认为坏死是主要的细胞死亡表型^20,21，而其他研究则报告凋亡为主要机制^22,23。总体而言，现有证据表明，细胞死亡表现为从经典凋亡到坏死的一系列连续性表型谱。具体的细胞死亡方式取决于多种因素，其中每种表型所占比例与损伤的严重程度等因素密切相关^24,25。在再灌注24小时时，濒死细胞表现出核固缩、胞质浓缩，并有明显的细胞内容物聚集迹象，同时线粒体功能形态丧失。死亡细胞进一步被免疫细胞（如巨噬细胞和/或小胶质细胞）吞噬并清除出海马CA1区。在再灌注4–7天后，死亡细胞已被完全清除，仅残留炎性细胞和活化的胶质细胞^17,26。因此，再灌注7天是定量评估海马CA1区神经元死亡的理想时间点，此时可使用简单的非特异性细胞染色方法（如焦油紫或苏木精-伊红染色），根据形态学纳入标准进行细胞计数。在此晚期再灌注时间点仍存在的细胞可计为存活细胞，从而提供脑损伤程度的评估指标。

如果要利用该模型测试治疗干预措施，建议实验设计遵循STAIR标准（卒中治疗学术产业圆桌会议）²⁷。在设计和开展研究时应遵循这些指南，但此处不予详述。

方案

1. 准备

所有动物实验必须符合机构指南，并在开始前获得相应动物护理委员会的批准。本文所述所有操作程序均已通过韦恩州立大学机构动物护理与使用委员会的批准，并遵循《实验动物护理与使用指南》中提出的动物伦理待遇指南以及美国政府关于实验、研究和培训中所用脊椎动物的使用与护理原则。在开始手术前，准备好必要的手术材料和术后恢复笼具。该手术为存活手术，因此必须采用无菌技术。

1. 制备血管导管时，截取一段8英寸长的聚乙烯50（PE50）管，将钝化的23号针头插入其中一端。导管可单独购买预灭菌产品，也可批量购买后根据需要使用环氧乙烷进行灭菌。
2. 将该针头固定在三通旋塞阀的一个端口上，并在另一端口连接另一个三通旋塞阀。通过灌注肝素化生理盐水溶液对旋塞阀和导管进行肝素化处理。将一支10 ml生理盐水注射器连接至与导管垂直且远离导管方向的旋塞阀端口。将靠近导管远端的旋塞阀连接至压力传感器管路，用生理盐水填充整个系统，并排除所有气泡。
3. 按照动物使用规范设置恢复笼具。恢复室应保持安静，人员走动应尽量减少。重要提示：在开始手术前，应开启下排风台或类似的废气清除系统，以过滤挥发的异氟烷。

2. 手术准备

在全脑前脑缺血的2VOH模型中，使用Sprague-Dawley大鼠（300-350 g）。麻醉通过异氟烷诱导并维持，同时辅以亚解离剂量的氯胺酮。我们观察到，仅用异氟烷维持麻醉会导致术后恢复期间癫痫发作的发生率增加。癫痫发作可能加重神经损伤和死亡率，从而影响该模型的可重复性。在麻醉中添加氯胺酮可显著降低异氟烷的使用剂量，达到外科手术所需的麻醉深度。使用恒温加热毯可严格调控核心体温。手术操作包括颈动脉切开与分离，以及股动脉切开与插管。

注意：在每次手术过程中，保持详细的记录非常重要。手术前或手术期间发生的核心温度、血压或其他生理变量的变化可能会显著影响实验结果，通过分析记录可确保个体之间和组别之间的操作一致性。通过在手术前对动物进行禁食，可以改善动物生理参数的一致性。建议实验人员确定最适合其研究需求的方法，以获得最稳定的术前血流动力学和血清葡萄糖浓度。

1. 将大鼠放入诱导室中，通入含5%异氟烷的30%氧气/70%氧化亚氮混合气体以诱导麻醉。使用啮齿类喉镜插入12号导管，并以含2.5%异氟烷的30%氧气/70%氧化亚氮混合气体进行通气。通气频率应为每分钟80次呼吸，每次潮气量2.5 ml。
2. 腹腔注射氯胺酮（20 mg/kg，溶于生理盐水），并将异氟烷浓度降至1.5%。重要提示：在整个操作过程中必须持续监测麻醉深度，以确保达到充分的外科麻醉水平。检测麻醉深度时，可夹捏后肢脚趾间组织，同时观察足底反射。若足底反射消失，则表明麻醉充分。股动脉插管后，血压可作为评估麻醉水平的指标。在维持外科麻醉水平的前提下，应尽可能降低异氟烷剂量，以减少缺血后癫痫发作的风险。
3. 将在颈部和骨盆区域进行切口。剃除颈部及右侧骨盆（即大腿与腹部交界处）的毛发。将大鼠仰卧位置于恒温加热毯上，并使用外科润滑剂插入直肠温度计。眼部应涂抹保护性润滑剂。可使用60瓦灯泡辅助调节体温，但灯泡与动物之间的距离不得小于8英寸。重要提示：体温高于或低于正常生理温度（37 °C）会显著影响最终的神经损伤程度。应将核心体温维持在37 °C ± 0.5 °C范围内。
4. 用聚维酮碘对切口区域进行消毒，并以70%乙醇冲洗。重复此步骤两次。在大鼠体表覆盖手术巾，并剪开小孔暴露切口区域。重要提示：颈动脉和股动脉的分离应避免对周围肌肉组织造成创伤，这有助于改善术后恢复，并减少术后镇痛药物的使用需求。
5. 在确认麻醉充分后，使用10号手术刀沿颈部正中线做一切口，随后用止血钳钝性分离腮腺组织，直至暴露覆盖气管的正中肌群——胸骨舌骨肌。再次采用轻柔的钝性分离技术，双侧分离胸骨舌骨肌与胸骨乳突肌。这两组肌肉形成一个三角形凹陷，可作为定位包含颈动脉的神经血管束的解剖标志。颈总动脉在此处分叉为颈内动脉和颈外动脉。需在分叉近端分离并暴露颈总动脉。
6. 轻柔地分离上述两组肌肉，定位颈动脉。可通过观察搏动辅助识别该血管。在两侧颈动脉下方分别穿过一段约5英寸长的3-0丝线，用于结扎。清除血管周围的筋膜组织。注意：迷走神经和交感神经链位于颈部神经血管束内，在分离颈动脉时应小心操作，避免对其造成损伤。
7. 使用剪刀在腹股沟区域做第二个切口，沿后肢大腿肌肉与腹部交界处的凹陷线进行。沿腹肌下方及大腿肌肉方向进行钝性分离，直至暴露腹股沟韧带，从而显露股神经血管束。小心地在股动脉下方穿过一段约5英寸长的3-0丝线，完成股动脉的分离。清除周围筋膜，使约5–7 mm长度的血管充分暴露。
8. 在暴露动脉的远端打一个永久结。注意：永久结应先打一个摩擦结，再打一个方结（共两个结），此原则适用于所有缝线结扎。在动脉近端再绕置一根3-0丝线，并打一个松结。
9. 牵拉近端动脉处的缝线以阻断血流，通过拉紧缝线实现闭塞。使用眼科剪在血管顶部做一小切口。若牵拉力度不足，将导致出血，此时可通过加强牵拉力度止血。关闭三通阀上的导管通路。
10. 使用血管导入器将导管插入血管，使其穿过血管切口并向中线方向推进7–9 mm。当导管到达预定位置后，收紧近端的松结，将导管与血管固定。随后解除对血管的牵拉，使其自然回位。
11. 静脉注射0.3 ml肝素（100 U/ml，溶于生理盐水）。用少量生理盐水冲洗导管，清除其中的血液，防止凝血。开启压力监测仪并校准设备。打开三通阀，使传感器能够检测血压。为获得精确的血压测量值，校准后不得再改变系统的位置。
12. 应调整异氟烷剂量，使平均动脉压（MAP）维持在110 mmHg至130 mmHg之间。该平均动脉压值应能反映适当的外科麻醉深度。

3. 缺血实验方案

如前所述，有四条血管为大脑提供灌注。单纯阻断两侧颈动脉近端不会导致脑缺血，因为椎动脉将通过基底动脉环（Willis环）进行代偿。研究表明，颈动脉阻断结合诱导的全身性低血压可限制椎动脉的灌注，从而引起脑缺血。本文描述了通过抽血造成低血压，同时夹闭颈动脉以产生可控且可逆的脑缺血的实验方案。见图1。

样本组个体间的血氧和二氧化碳水平、葡萄糖浓度及pH值可能存在差异，从而导致损伤程度不同。监测这些生理参数可减少梗死范围的变异性。如前所述，温度是另一个需要调控的重要参数，然而在实验性缺血期间，由于灌注显著受限，脑温可能与核心体温不一致²⁸。我们特定的手术设置使得在缺血期间脑温的变化与核心体温的变化相一致。然而，实验人员必须通过热电偶或其他方法监测脑温，以经验性地确定这一对应关系，从而实现操作的标准化。如果核心体温不能反映脑温，则在整个实验过程中必须将脑温维持在正常水平，而不受核心体温的影响。

随机分组要求外科医生在此时将动物随机分配至缺血组或假手术对照组。假手术组的操作步骤与缺血组动物完全相同，但不进行血压降低和颈动脉阻断。假手术对照组必须接受与缺血组动物相同剂量的麻醉，且麻醉持续时间应相匹配。如果实验包含需要在缺血前或缺血后接受麻醉处理的治疗组，则假手术组和未治疗的缺血组也应与治疗组的麻醉剂量和持续时间保持一致。

1. 准备好止血夹和止血夹施加器。止血夹应完全闭塞血管，同时不造成任何创伤。当血流动力学稳定后，可诱导缺血。将一支10 ml含肝素的注射器连接到三通阀上，方向垂直且靠近导管。注射器内应含有0.3 ml（30单位）肝素化生理盐水，以防止抽出的血液凝固。
2. 设置计时器为1分钟，打开三通阀至肝素化注射器，使血液得以抽出。
3. 通过拉动注射器活塞抽取血液。若吸力过大，血管会塌陷或紧贴导管开口，导致无法抽出血流。应在1分钟内成功抽出7–9 ml血液。若未达到此量，可将导管进一步送入动脉并重试。我们发现，必须抽出7–9 ml血液才能使平均动脉压（MAP）降至约30 mmHg，此为目标血压以实现缺血。重要提示：确保抽出的血液保持在37 °C，以避免在回输过程中发生降温。
4. 在完成1分钟的采血（应抽出7–9 ml血液）后，对颈总动脉施加止血夹，并启动8分钟计时器。立即检查血压。若平均动脉压未达到30 mmHg，应缓慢输注或抽出血液，使血压维持在30 mmHg ± 1 mmHg范围内。在整个缺血期间持续调整以维持平均动脉压为30 mmHg。重要提示：在整个缺血方案过程中持续记录血压。未能将血压降至30 mmHg可能限制缺血效果。在回输期间密切监测核心温度和/或脑温，因温度升高或降低均可能影响脑损伤程度。
5. 8分钟结束后，通过移除止血夹并以每分钟2 ml的速度缓慢回输血液，开始再灌注。
6. 血液回输完成后，可将导管从股动脉中移除。为避免术后出血，应在动脉切口近端打两个独立的结进行固定。
7. 使用反向切割针和5-0 VICRYL缝线，采用间断缝合方式关闭切口。该缝线可自行吸收，无需拆除。注意：在操作过程中，若使用较低浓度异氟烷无法达到足够麻醉深度，可追加一次剂量的氯胺酮。

4. 镇痛与恢复

在恢复期以及手术过程中，动物福利是首要考虑的因素。术后护理应遵循所在机构的具体指南。经历全脑缺血的动物容易发生癫痫发作。为了尽量减少癫痫发作，恢复环境应尽可能减少刺激，例如噪音和视觉干扰。根据本机构的动物使用规程，我们为此目的将术后动物安置在独立的房间内饲养72小时。

1. 缝合切口后，可将大鼠逐渐脱离呼吸机。关闭异氟烷，继续以30%氧气/70%氧化亚氮通气，直至大鼠开始对抗呼吸机自主呼吸。
2. 在肩胛骨之间皮下注射0.5 mg/kg的丁丙诺啡溶于5 ml生理盐水。
3. 快速回输血液可能增加右心室前负荷，从而升高肺循环压力，导致肺水肿。其表现包括呼吸困难和呼吸时出现爆裂音。应用呼气末正压有助于改善肺水肿。
4. 当自主呼吸控制恢复后，拔除气管插管，移除体温计，并关闭加热毯。此时可将动物放入恢复笼中。恢复笼应放置在水循环加热毯（34 °C）上，使笼子的一半区域覆盖于加热毯上方，再灌注的前24小时均应保持此状态。将动物置于笼底位于加热毯上方的区域，以帮助维持体温。当动物开始从麻醉和镇痛状态中恢复时，会自行在笼内移动以调节体温。术后动物应单独饲养。
5. 动物应可自由饮水。术后两天内，饮水中应含有4 mg/kg的液体泰诺（Tylenol）溶液。除啮齿类动物饲料外，笼内还需提供加糖早餐麦片，以促进进食并防止体重下降。
6. 用布单遮盖笼子的一半，并密切监测术后恢复情况。
7. 在动物从麻醉中恢复期间，需密切监测其是否出现痛苦迹象。呼吸费力或不规律可能是痛苦的表现，可能由肺水肿或插管过程中气道受到刺激引起。布托啡诺可使动物镇静，降低活动水平，但轻度活动应在1小时内开始恢复。我们发现，动物通常在拔管后4小时内开始进食零食和饮水。到12小时时，应恢复正常行为和摄食活动。另一项痛苦指征是体重下降；任何48小时内体重减轻不得超过原始体重的20%，若观察到过度体重下降，应实施安乐死。
8. 如果出现癫痫发作，则必须进行人道干预。此类癫痫发作活动通常在再灌注后24至48小时出现。癫痫发作可导致脑损伤加重，且该损伤独立于缺血性损害。 本身因此，癫痫发作活动应在研究开始前即被设定为排除标准 ²⁹癫痫发作可能在无人看护时发生，因此识别其征兆非常重要。发作后，垫料可能会被弄乱甚至抛出笼外。发作后的癫痫大鼠表现为精神萎靡、呼吸急促费力，和/或出现鼻部瘀伤或出血。

注意： 任何疼痛或痛苦的迹象均需立即使用镇痛药缓解。若单次镇痛给药后症状未缓解，或连续第四次给予镇痛药后症状仍持续，则对该动物实施安乐死并将其排除出研究。术后应检查手术伤口是否正常愈合，持续观察八天。

5. 组织采集与处理

通过心脏灌注多聚甲醛固定脑组织。经过大体切片和冷冻保护后，我们将脑组织进行速冻，并在冷冻切片机上切片。这些脑切片使用焦油紫（Cresyl violet）染色，并在光学显微镜下成像。

1. 将动物放入诱导室，通入30%氧气/70%氧化亚氮混合气体，并加入5%异氟烷以诱导麻醉。对动物进行气管插管，并以30%氧气/70%氧化亚氮混合气体加5%异氟烷维持通气。
2. 准备灌注所需材料。取一个烧杯加入100 ml 4 °C的1×磷酸盐缓冲液（PBS），另取一个烧杯加入100 ml 4 °C的4%多聚甲醛（PFA）。通过灌注泵先以PBS冲洗脑组织，再用PFA灌注。将管路分别插入两个烧杯中，并通过三通阀连接，以便从PBS灌注平稳切换至PFA灌注。在管路上安装钝化的18号针头，并用PBS充满管路。确保针头和管路中无气泡，因空气可能形成栓塞，阻碍灌注。同时，准备好盛有PFA的小容器，用于脑组织的浸没固定。
3. 使用容量足够容纳至少200 ml液体的液体收集盘。此时动物应已持续吸入异氟烷足够长时间（至少3分钟），以达到深度麻醉状态。
4. 重要：确保动物已达到手术麻醉水平。
5. 通过腹部切口打开胸腔。夹闭降主动脉。暴露心脏后，将钝化的18号针头从心尖插入升主动脉。在右心耳处做一小切口，以便灌注液流出。
6. 启动灌注泵，流速设为50 ml/min，先灌注PBS。当100 ml PBS灌注完成后，转动三通阀，切换为灌注100 ml PFA。
7. 取出脑组织，注意避免损伤。
8. 将脑组织置于组织切片模具中，在小脑与大脑之间进行切割。对前脑进行冠状切片，分别在大脑皮层前缘和后缘约3毫米处切开，得到三个脑片，其中中间部分包含海马体。
9. 将脑片放入盛有足量PFA的玻璃瓶中，确保完全浸没。在PFA中浸没固定 exactly 2 小时。
10. 为防止冷冻造成组织损伤，需用含30%蔗糖的PBS溶液替换PFA进行冷冻保护。当组织样本完全沉入蔗糖溶液中时，表明冷冻保护完成（约需24–48小时）。
11. 为快速冷冻脑片，将盛有2-甲基丁醇的烧杯置于干冰中冷却10分钟。将脑片放入冷却的甲基丁醇中5分钟，随后转移至可密封容器中，于-80 °C保存，直至进行冰冻切片。
12. 使用冰冻切片机将脑组织切成20 μm厚的切片，在三个脑图谱坐标位置各收集至少3张切片（《立体定位坐标中的大鼠脑》Paxinos 和 Watson，图谱切片29、31、33，或Bregma -2.8 mm、-3.3 mm 和 -3.8 mm）。将切片贴附于带电荷的载玻片上，干燥后于-80 °C保存。
13. 使用焦油紫染色（pH 3.5条件下0.1%溶液）对9张脑切片进行染色，每个脑图谱坐标位置染3张。
14. 使用显微镜连接的相机以40倍放大倍数拍摄海马体CA1区图像，并插入一条与CA1神经元层面平行的300 μm比例尺。将图像保存为TIFF格式文件。

6. 脑损伤定量分析

ImageJ 是美国国立卫生研究院提供的一款免费程序，可用于计数和定量有活力的神经元，从而反映脑损伤的程度。

1. 使用 ImageJ 的“cell counter”插件打开显微镜 TIFF 图像。选择一种标记颜色，并在比例尺边界内计数神经元。神经元的计数基于简单的纳入标准（如神经元形态：大而呈锥体形）或排除标准（如小胶质细胞/星形胶质细胞形态：小而圆形或长管状）。
   重要提示：在对不同切片及不同操作者进行神经元计数时，必须保持纳入/排除标准的一致性。
2. 记录神经元计数结果，并保存 cell counter 窗口。
3. 应由两位独立的操作者分别完成神经元计数，以获得一致且准确的计数结果。
4. 每只动物所有 9 张图像的平均神经元计数将作为一个单一的平均“神经元计数”，该数值将作为用于统计分析的 CA1 海马区损伤的定量指标。组间比较可采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey's HSD 检验进行事后（post hoc）分析；若数据不符合正态分布，则采用基于秩次的 Kruskal-Wallis 单因素方差分析，随后进行 Dunn's 事后（post hoc）检验，以在统计学上评估组间差异。具体的统计分析方法应根据各自的研究设计确定，此处提供的方法可能不适用于特定的研究假设。

结果

全脑缺血/再灌注的2VOH模型可导致海马CA1区神经元死亡。图2展示了再灌注后14天处理的8分钟全脑缺血所造成的损伤。图2A和2B比较了假手术组与缺血后脑组织的海马切片，染色方法为焦油紫染色。图2A显示假手术大鼠的海马结构正常，包括完整的CA1区。图2B显示经历缺血/再灌注损伤的海马，其中齿状回、CA2和CA3区形态基本未受影响，而海马CA1区中选择性易损的神经元无法存活于缺血/再灌注损伤，仅残留散在的神经元。然而，在海马CA1区可明显观察到浸润的巨噬细胞和/或小胶质细胞（Iba-1阳性细胞）以及反应性星形胶质细胞（GFAP阳性细胞）显著增多。使用NeuN对神经元进行特异性免疫荧光标记，Iba-1标记巨噬细胞/小胶质细胞，GFAP标记星形胶质细胞，进一步证实了这些结果。

图2C展示了在40倍放大倍数下CA1区显微镜图像的示例性神经元计数区域。上方图显示假手术对照组的CA1区，下方图...

讨论

本文所述模型可产生脑缺血损伤，这种损伤可能由心脏骤停和复苏引起，所造成的损伤与人类情况相似。该方法是多种全局性脑缺血造模方案之一。我们主要采用此方案，因其具有相对较低的死亡率、动物恢复迅速以及结果可重复性强等优点。心脏骤停/复苏模型可以说是临床相关性最强的模型，但在技术上最难实现稳定重复。四血管阻断（4VO）模型是另一种常用的全局性脑缺血实验方案，其优势在于缺血期间可完全阻断全部四条供血血管。然而该模型也存在一些缺点，包括需要进行多次手术以及可能引发神经保护性预处理效应。已有改良的4VO模型，可在单次手术过程中实现四条血管的短暂阻断以诱导缺血，但该手术在技术上仍然具有较高难度³⁰。

2VOH 的不同操作方式已被证明会产生一系列不同的结果^31,32。缺血持续时间和低血压程度是影响结果的主要变量。有文献报道，如果血压降低不足，大鼠产生的损伤可能不一致或呈单侧性³⁰。我们发现，30 mmHg 是最佳的低血压程度，因为它能产生可靠的缺血效应，同时不会引起明显的外周损伤。该模型所产生的缺血属于重度缺血，但按照本方案操作可降低原...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料名称
5-0 VICRYL 缝合线，反向切割	Ethicon	J391H
手术刀，10号	Swann-Morton	6601
纱布海绵	Fisher	22-362-178
18G × 1½ 英寸针头	BD	305201
23G × 1 英寸针头	BD	305145
26G × 3/8 英寸针头	BD	305110
18G × 1¼ 英寸导管	EXEL	26735
1 ml 注射器	BD	309659
10 ml 注射器	BD	309604
60 ml 注射器	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
0.9% 生理盐水，塑料静脉输液袋	Henry Schein	1537468
3-0 丝线缝合线	Henry Schein	1007842
Puralube 眼科软膏	Henry Schein	3390017
聚维酮碘（Betadine）	Henry Schein	6903564
无菌毛巾单	Moore Medical	14170
聚乙烯管，50	Intramedic	427411
三通旋塞阀	Smiths medical	MX9311L
药物名称
AERRANE（异氟烷，isoflurane）	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid（对乙酰氨基酚，Tylenol）	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet（氯胺酮，ketamine）	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic（丁丙诺啡，butorphanol）	Lloyd Labs	4881
肝素（Heparin）	APP Pharmaceuticals	504011
化学名称
多聚甲醛颗粒	Electron Microscopy Sci.	19202
2-甲基丁烷	Sigma	270342
醋酸克雷斯紫	Sigma	C5042
蔗糖	Sigma	S9378
软件
ImageJ	NIH