双血管阻断/低血压：大鼠全脑缺血模型

摘要

双侧颈动脉阻断联合全身性低血压可在大鼠中诱导全脑缺血，导致海马区出现可重复的严重损伤。动物模型表现出可预测的脑损伤模式，恢复迅速，且死亡率相对较低。

摘要

心脏骤停后复苏常导致严重的脑损伤，这是由于脑组织缺血及随后再灌注所引起的。全脑缺血会对某些特定脑区造成损害，这些区域已证实对缺血高度敏感¹。与其他细胞群体相比，海马神经元对缺血性损伤更为敏感，尤其是海马的CA1区对缺血/再灌注特别易损²。

设计治疗干预措施或研究脑损伤相关机制时，需要一种能够以可重复方式产生与临床状况相似损伤的模型。双侧颈动脉闭塞联合低血压（2VOH）是一种可诱导可逆性前脑缺血的模型，能够模拟心脏骤停和复苏过程中可能发生的脑部事件。我们描述的模型改良自 Smith et al.（1984）²，其当前形式首次由 Sanderson et al.（2008）³ 报道，该模型可对选择性易损脑区产生可重复的损伤^3-6。该模型的可靠性取决于在诱导低血压期间对全身血压的精确控制、缺血持续时间、严格的体温调节、特定的麻醉方案以及细致的术后护理。8 分钟的缺血损伤可导致海马 CA1 区神经元发生进行性细胞死亡，该过程在再灌注后 6 至 24 小时内逐步发展，而其他较不易受损的脑区则得以保留。这种进行性细胞死亡在再灌注 7 至 14 天后可被轻松量化，因为此时 CA1 区神经元几乎完全丧失。

除了这种脑损伤模型外，我们还介绍了一种利用简单而全面的方法对CA1区损伤进行定量分析的技术。重要的是，该定量分析可通过配备普通摄像头的显微镜和免费的ImageJ（NIH）软件插件完成，从而无需使用价格昂贵的体视学分析软件和配备电机的显微镜载物台来进行损伤评估。

引言

心脏骤停和中风导致的脑损伤是死亡和长期残疾的主要原因。尽管对心脏骤停患者实施心肺复苏每年在美国能够成功恢复约7万名患者的自主循环^7,8，但其中至少60%的患者会因严重的脑损伤而在住院期间死亡，仅有3%-10%的复苏后患者能够恢复以往的生活方式^9,10。显然，阐明全脑缺血后导致脑损伤的机制，并设计有效的治疗干预措施以最大程度减轻神经损伤，具有极为重要的意义。

脑缺血可通过多种方法建模。最常用的方法是在啮齿类动物中通过阻断脑部主要血管——大脑中动脉，从而产生局灶性缺血性卒中^11,12。尽管局灶性脑缺血在临床上具有重要意义，但它并不能准确地用于研究心脏骤停/复苏所导致的脑损伤。为了模拟这一临床情况，需要使整个脑组织发生缺血，随后恢复血流。为更贴近这种临床表现，研究人员通过实验诱导心脏骤停，随后进行心肺复苏（CPR）和除颤来实现复苏^13,14。该模型具有临床相关性，但复苏时间的不可预测性可能增加实验数据的变异性，使结果解释变得困难。此外，该模型伴随较高的死亡率，进一步增加了验证假设所需的动物数量。因此，采用一种更具可重复性、稳定性和可存活性的损伤方式来研究全脑缺血和/或再灌注的脑部反应可能是更优选择。

可以在保留全身部分血流的同时诱导脑部的全脑缺血。这种方法可降低死亡率，同时允许研究脑组织损伤的机制²。为了实现全脑缺血，....

方案

1. 准备

所有动物实验必须符合机构指南，并在开始前获得相应动物护理委员会的批准。本文所述所有操作程序均已通过韦恩州立大学机构动物护理与使用委员会的批准，并遵循《实验动物护理与使用指南》中提出的动物伦理待遇指南以及美国政府关于实验、研究和培训中所用脊椎动物的使用与护理原则。在开始手术前，准备好必要的手术材料和术后恢复笼具。该手术为存活手术，因此必须采用无菌技术。

1. 制备血管导管时，截取一段8英寸长的聚乙烯50（PE50）管，将钝化的23号针头插入其中一端。导管可单独购买预灭菌产品，也可批量购买后根据需要使用环氧乙烷进行灭菌。
2. 将该针头固定在三通旋塞阀的一个端口上，并在另一端口连接另一个三通旋塞阀。通过灌注肝素化生理盐水溶液对旋塞阀和导管进行肝素化处理。将一支10 ml生理盐水注射器连接至与导管垂直且远离导管方向的旋塞阀端口。将靠近导管远端的旋塞阀连接至压力传感器管路，用生理盐水填充整个系统，并排除所有气泡。
3. 按照动物使用规范设置恢复笼具。恢复室应保持安静，人员走动应尽量减少。重要提示：在开始手术前，应开启下排风台或类似的废气清除系统，以过滤挥发的异氟烷。

2. 手术准备

在全脑前脑缺血的2VOH模型中，使用Sprague-Dawley大鼠（300-350 g）。....

结果

全脑缺血/再灌注的2VOH模型可导致海马CA1区神经元死亡。图2展示了再灌注后14天处理的8分钟全脑缺血所造成的损伤。图2A和2B比较了假手术组与缺血后脑组织的海马切片，染色方法为焦油紫染色。图2A显示假手术大鼠的海马结构正常，包括完整的CA1区。图2B显示经历缺血/再灌注损伤的海马，其中齿状回、CA2和CA3区形态基本未受影响，而海马CA1区中选择性易损的神经元无法存活于缺血/再灌注损伤，仅残留散在的神经元。然而，在海马CA1区可明显观察到浸润的巨噬细胞和/或小胶质细胞（Iba-1阳性细胞）以及反应性星形胶质细胞（GFAP阳性细胞）显著增多。使用NeuN对神经元进行特异性免疫荧光标记，Iba-1标记巨噬细胞/小胶质细胞，GFAP标记星形胶质细胞，进一步证实了这些结果。

图2C展示了在40倍放大倍数下CA1区显微镜图像的示例性神经元计数区域。上方图显示假手术对照组的CA1区，下方图.......

讨论

本文所述模型可产生脑缺血损伤，这种损伤可能由心脏骤停和复苏引起，所造成的损伤与人类情况相似。该方法是多种全局性脑缺血造模方案之一。我们主要采用此方案，因其具有相对较低的死亡率、动物恢复迅速以及结果可重复性强等优点。心脏骤停/复苏模型可以说是临床相关性最强的模型，但在技术上最难实现稳定重复。四血管阻断（4VO）模型是另一种常用的全局性脑缺血实验方案，其优势在于缺血期间可完全阻断全部四条供血血管。然而该模型也存在一些缺点，包括需要进行多次手术以及可能引发神经保护性预处理效应。已有改良的4VO模型，可在单次手术过程中实现四条血管的短暂阻断以诱导缺血，但该手术在技术上仍然具有较高难度³⁰。

2VOH 的不同操作方式已被证明会产生一系列不同的结果^31,32。缺血持续时间和低血压程度是影响结果的主要变量。有文献报道，如果血压降低不足，大鼠产生的损伤可能不一致或呈单侧性³⁰。我们发现，30 mmHg 是最佳的低血压程度，因为它能产生可靠的缺血效应，同时不会引起明显的外周损伤。该模型所产生的缺血属于重度缺血，但按照本方案操作可降低原.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料名称
5-0 VICRYL 缝合线，反向切割	Ethicon	J391H
手术刀，10号	Swann-Morton	6601
纱布海绵	Fisher	22-362-178
18G × 1½ 英寸针头	BD	305201
23G × 1 英寸针头	BD	305145
26G × 3/8 英寸针头	BD	305110
18G × 1¼ 英寸导管	EXEL	26735
1 ml 注射器	BD	309659
10 ml 注射器	BD	309604
60 ml 注射器	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
0.9% 生理盐水，塑料静脉输液袋	Henry Schein	1537468
3-0 丝线缝合线	Henry Schein	1007842
Puralube 眼科软膏	Henry Schein	3390017
聚维酮碘（Betadine）	Henry Schein	6903564
无菌毛巾单	Moore Medical	14170
聚乙烯管，50	Intramedic	427411
三通旋塞阀	Smiths medical	MX9311L
药物名称
AERRANE（异氟烷，isoflurane）	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid（对乙酰氨基酚，Tylenol）	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet（氯胺酮，ketamine）	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic（丁丙诺啡，butorphanol）	Lloyd Labs	4881
肝素（Heparin）	APP Pharmaceuticals	504011
化学名称
多聚甲醛颗粒	Electron Microscopy Sci.	19202
2-甲基丁烷	Sigma	270342
醋酸克雷斯紫	Sigma	C5042
蔗糖	Sigma	S9378
软件
ImageJ	NIH