本文描述了一种用于评估聚合物基因递送纳米颗粒的纳米颗粒追踪分析（NTA）和高通量流式细胞术的实验方案。NTA 用于表征纳米颗粒的粒径分布以及每个颗粒所携带质粒的数量分布。高通量流式细胞术则可对一系列基因递送生物材料库进行转染效率的定量评估。
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摘要
摘要
利用聚合物纳米颗粒进行非病毒基因递送已成为治疗遗传性疾病基因疗法的一种有吸引力的方法1，同时也是再生医学领域的一项重要技术2。与存在显著安全问题的病毒载体不同，聚合物纳米颗粒可被设计为无毒、无免疫原性、无致突变性，且更易于合成，具有化学上的多样性，能够携带较大的核酸载荷，并具备可生物降解和/或环境响应的特性。阳离子聚合物通过静电相互作用与带负电荷的DNA自组装，形成尺寸约为100 nm的复合物，通常称为聚合物纳米颗粒。用于构建纳米级阳离子基因递送颗粒的生物材料包括聚赖氨酸、聚磷酸酯、聚酰胺胺和聚乙烯亚胺（PEI）；其中PEI是一种现成的、不可降解的阳离子聚合物，常用于核酸递送1,3。聚（β-氨基酯）（PBAEs）是一类较新的阳离子聚合物4，具有水解可降解性5,6，已被证明在向难转染细胞类型递送基因方面具有良好效果，例如人视网膜内皮细胞（HRECs）7、小鼠乳腺上皮细胞8、人脑癌细胞9以及大血管（人脐静脉，HUVECs）内皮细胞10。
本文介绍了一种利用纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）表征聚合物纳米颗粒的新方案。该方法可同时获得颗粒的粒径分布以及每个颗粒所携带质粒数目的分布11。此外，还提供了一种高通量96孔板转染实验方法，用于快速筛选聚合物纳米颗粒的转染效率。在本方案中，以聚β-氨基酯（poly(beta-amino ester)s, PBAEs）作为模型聚合物，人视网膜内皮细胞（human retinal endothelial cells, HRECs）作为模型人类细胞。该方案可轻松适用于在多孔板体系中评估任意类型的聚合物纳米颗粒及其对特定细胞类型的转染效果。
引言
确定每个纳米颗粒所结合的质粒数量，对于设计高效的基于纳米颗粒的基因递送策略至关重要，尤其是在干细胞重编程研究中，通常需要将多个质粒共递送至同一细胞靶标12。目前已有少数方法用于计算单个纳米颗粒相关的质粒数量，但这些方法在估算技术上均存在局限性13-16。量子点（QD）标记结合透射电子显微镜（TEM）已被用于估算壳聚糖基纳米颗粒中每个颗粒的质粒数量。然而，该QD技术的估算过程较为复杂，原因包括：需对DNA进行标记，可能改变其自组装特性；包封的未标记DNA可能无法被直接检测；在颗粒的二维TEM图像中，质粒与QD可能存在重叠；以及其他简化的假设条件13。另一种适用于颗粒内存在有序微区结构的方法，曾被用于通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）、X射线散射和动态光散射（DLS）研究脂质多胺-DNA复合物14,15。遗憾的是，本研究中所涉及的聚合物纳米颗粒等材料不适用于该方法。在另一项研究中，Collins et al. 采用流动颗粒图像分析技术研究含(Lys)16的肽/DNA复合物；然而，该方法仅适用于评估较大的微米级颗粒16。因此，我们近期开发了一种新颖且灵活的检测方法，用于定量每个纳米颗粒所携带的质粒数量11。
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方案
1. 细胞接种
- 切勿使细胞生长至过度融合。转染原代细胞时应使用早期代次的细胞。
- 转染前24小时，用胰酶消化细胞，使用血细胞计数板计数细胞，并用培养基稀释细胞悬液以达到所需细胞密度（细胞数/体积）。使用储液槽和多通道移液器将细胞接种至透明、经组织培养处理的平底96孔板中。所选密度应确保在转染当天细胞融合度达到70–80%。例如，如表1所示，本实验中展示的转染数据所用细胞稀释至25至50个细胞/μl。
2. 细胞转染
- 聚合物和DNA储备液的稀释。将聚合物和DNA储备液在室温（RT）下解冻。使用十二通道移液器，在透明的96孔板中分别用适当的溶剂将聚合物储备液和DNA储备液稀释至所需浓度，以获得目标的聚合物质量与DNA质量之比（wt/wt）。本实验中选用的溶剂为25 mM醋酸钠缓冲液（pH=5.2）。
- DNA稀释。通常，将储存浓度为1 mg/ml的DNA用醋酸钠缓冲液稀释至0.03至0.06 mg/ml，加入透明非组织培养处理的96孔板中（每种配方使用一个孔）。表2展示了用于转染接种于96孔板中细胞（来自步骤1）四重复孔的单个配方典型的DNA稀释方案。
- 聚合物稀释。将100 mg/ml的聚合物/DMSO溶液根据所需浓度用醋酸钠缓冲液稀释，以获得目标的聚合物与DNA质量比（wt/wt）。聚(β-氨基酯)（PBAEs）用于基因递送时常用的质量比范围为20至100。PBAE聚合物首先稀释至10 mg/ml，随后按表3所示稀释方案进行操作。聚合物稀释可在与DNA稀释板样品方向一致的透明非组织培养处理的96孔板中进行。
- 纳米颗粒形成。使用十二通道移液器将PBAE溶液加入等体积的质粒DNA溶液中，并剧烈混合。室温下孵育10分钟，使复合物自组装完成。
- 纳米颗粒转染。自组装完成后，使用十二通道移液器将20 μl纳米颗粒逐滴加入每孔培养基中。设置未处理孔或使用市售转染试剂处理的孔作为对照。转染后的细胞在37 °C孵育2至4小时，随后更换新鲜培养基（100 μl/孔）。孵育时间的选择取决于细胞系、培养条件和转染系统。不同孵育时间对转染效率和细胞毒性的影响将通过步骤3所述分析方案进行定量评估。
3. 转染效率与细胞毒性的分析
转染效率在转染后48小时通过荧光显微镜进行视觉分析，并使用流式细胞仪进行定量。细胞毒性在转染后24小时通过荧光显微镜进行视觉分析，并使用CellTiter 96 AQueous One试剂盒进行定量。
- 荧光显微镜观察。使用适当的荧光通道，目视分析各孔中转染的报告基因（例如 EGFP 或 DsRed）的表达情况。为每个孔采集图像，选择能够恰当代表特定转染体系转染效率的视野（图 1）。记录所观察到的任何细胞毒性现象。
- 流式细胞术。
- 使用多通道移液器为流式细胞术准备 96 孔板。用 PBS 洗涤，每孔加入 30 μl 胰蛋白酶/EDTA 进行消化，再加入 170 μl FACS 缓冲液（PBS + 2% FBS）中和，反复吹打混匀各孔（包括边缘区域），然后将每孔全部 200 μl 液体转移至圆底或 V 底 96 孔板中对应的孔。
- 在 4 °C 条件下，以 130 × g 离心 5 分钟。
- 从每孔中移除 170 μl 上清液，并用移液器轻轻重悬细胞，避免产生气泡。若使用碘化丙啶（propidium iodide, PI）等活死染料，向每孔中加入 10 μl FACS 缓冲液+PI（FACS 缓冲液:PI 按 50:1 稀释；PI 储液浓度为 1 mg/ml）。立即置于冰上并避光保存。
- 启动 C6 Accuri 流式细胞仪、HyperCyt 96 孔板附件及 HyperView 软件。在 HyperView 的 Design 和 Protocol 选项卡中选择合适的板型、板布局及其他设置（如震荡/吸取/冲洗/再震荡时间）。对于上述实验流程，使用以下参数：预进样前冲洗 1 分钟，预进样前震荡 30 秒（2,400 rpm）；吸取时间为 15 秒（15 rpm）；每孔后探针冲洗 2 秒；每 12 孔进行一次孔间震荡，持续 12 秒（2,400 rpm）。孔间震荡对于保持细胞在液体中的均匀分散至关重要，同时也有助于通过在每组孔之间插入定时暂停（本例中为 12 秒）来更有效地处理数据。
- 使用 HyperView 的 Well Identification 选项卡处理数据，并将其分配至相应的孔（图 2）。为准确识别各个孔，可使用软件中的噪声滤波器，并在高级设置中启用基础事件均匀性滤波器。
- 通过适当的设门策略定量分析活细胞中阳性转染细胞的百分比，以区分不同细胞群（图 3）。首先在 FSC 与 SSC 散点图上查看流式数据，以区分细胞与碎片（图 3A）。若使用了碘化丙啶（PI），则对单个细胞群设门，并在 FSC 与 FL3 图上查看数据，以区分活细胞与死细胞，并圈定活细胞群。为定量转染细胞数量，将活细胞群在相应的荧光通道（例如，GFP 在 FL1 通道）中进行分析。利用未处理组的数据，对未处理细胞设门以确定背景信号水平（图 3B）。随后利用该门控策略，结合散点图和等高线图（图 3C 和 图 3D）分离出阳性转染细胞群。由于不同细胞的荧光表达程度存在差异，阳性转染细胞可能呈现连续性分布。
- CellTiter 96 AQueous One 检测
- 另取一块 96 孔板，以完全相同的方式进行转染，用于细胞毒性检测。
- 将 1 ml CellTiter 96 AQueous One 检测试剂与 10 ml 新鲜培养基预先混合。吸除细胞上清液后，使用多通道移液器每孔加入 110 μl 预混的检测试剂+培养基混合液。
- 在 1 至 4 小时内每隔 1 小时测量一次 490 nm 处的吸光度，直至未处理组孔的吸光度值处于检测的线性范围。设置四个仅含检测试剂+培养基的对照孔，用于获取背景吸光度值。
- 计算每种条件下四个重复孔的吸光度平均值，并从每个平均值中减去背景平均吸光度。将各处理组的校正后平均值相对于未处理组的校正后平均值进行归一化，以确定细胞存活率百分比。
4. 使用纳米颗粒追踪分析法进行纳米颗粒粒径测定及每颗粒质粒计算
- 通过将稀释液泵以大约最大速度的1/5向前运行，同时将样品泵以大约最大速度的1/10向后运行，对Nanosight NS500的流体系统进行预冲洗。持续操作直至流体系统被稀释液完全冲洗干净。
- 准备待分析的纳米颗粒。对于PBAEs，分别将储备质粒DNA（1 mg/ml）和储备PBAE（100 mg/ml）用醋酸钠缓冲液（25 mM，pH 5）在Eppendorf管中稀释。
- 将质粒DNA浓度稀释至0.06 mg/ml。聚合物浓度可根据所需的聚合物与DNA质量比（wt/wt）进行调整（例如，对于60 wt/wt的颗粒，聚合物应稀释至3.6 mg/ml）。
- 将聚合物溶液加入等体积的质粒DNA溶液中，并剧烈混合。在室温下孵育混合物10分钟，以允许其自组装。
- 将纳米颗粒溶液用PBS稀释100倍，使纳米颗粒浓度处于NTA检测的合适范围内，并获得至少500 μl的终体积。
- 通过将进样管插入样品Eppendorf管中，将样品加载至Nanosight仪器中（图4A）。注意避免引入气泡。
- 在捕获模式下，逐步提高相机水平直至可见颗粒。调节焦距，使颗粒呈现平滑外观（图4A和图4B）。
- 在标准模式下，先将相机水平调至超过屏幕上所有颗粒均可见的程度，然后降低相机水平至仍能观察到全部颗粒的最低水平。若需中间值，可切换至高级模式，并将相机快门和增益调节至适当水平。
- 目视检查以确保屏幕上显示的颗粒数量在20–100个之间。纳米颗粒追踪的理想颗粒数约为50个。若颗粒过多或过少，应冲洗NS500系统，调整PBS中的稀释倍数，并重新加载样品。
- 根据标准模式表格调整捕获时长。通常30–60秒为合适的捕获时间（图4B）。
- 加载下一个样品时，先冲洗系统，再重新加载新样品。
- 视频采集完成后，通过打开视频文件进入数据处理阶段。
- 可调节多个参数以优化视频处理效果（图4C）。目标是选择合适的参数，使屏幕上的每个颗粒均被准确识别，表现为每个颗粒上方出现红色十字标记（图5）。
- 提高屏幕增益以更清晰地观察颗粒。在标准或高级模式下，通过勾选相应选项启用参数自动调节。若自动设置未能有效识别颗粒，则取消勾选并手动设定参数（图4C）。
- 当屏幕上所有颗粒均被识别后，点击软件中的“处理”按钮以处理视频文件（图4C）。该步骤将提供颗粒尺寸分布、平均尺寸以及颗粒浓度。
- 为确保颗粒浓度测量准确，可改变PBS稀释倍数（例如将稀释倍数提高2倍），并重复上述步骤。建议对同一样品进行多个稀释梯度的测量，以确保浓度测定结果的准确性。理想的测量范围为107–109 颗粒/ml。
- 通过进行纳米颗粒的凝胶电泳并检测是否存在游离DNA，验证所有质粒是否均已包载入纳米颗粒中。若并非所有质粒均被包封，可采用标准方法测定DNA吸光度，以定量总包封质粒量。
- 为计算每个颗粒平均包载的质粒数，将总包封质粒浓度除以NTA测得的颗粒浓度。为估算质粒/颗粒的样本分布，首先利用NTA测得的颗粒尺寸直方图，计算每个1 nm粒径区间的体积分数；将该体积分数分布乘以总质粒量，得到各区间内的质粒数量；再将各区间质粒数除以对应区间的颗粒数，即可获得各粒径对应的质粒/颗粒数（图6）。
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结果
图1 显示了HREC细胞成功转染EGFP质粒后的荧光显微镜图像。明场图像有助于确认细胞保持正常的形态。此外，可使用MTS或其他类似的细胞活力检测方法评估纳米颗粒的毒性7。如文中所述，可通过流式细胞术定量转染效率。当使用HyperCyt多孔板连接装置时，需对数据进行适当处理，以准确识别各个孔位。如图2右侧面板所示，当细胞数量充足（每孔数千个细胞）且流路系统正常运行时，无论是人工还是软件均更容易分辨出各个孔位。然而，若细胞数量过低或流路系统存在问题，则识别各个孔位将变得困难得多（图2左侧面板），此时实验很可能需要重复。更换HyperCyt的管路通常可解决样本流速异常的问题。获得各孔的独立数据后，可使用大多数常见的流式细胞术分析软件对导出的.FCS文件进行分析。图3展示了使用FlowJo软件通过与未处理孔进行比较，圈定阳性转染细胞群的方法。
通过纳米颗粒追踪分析（Nanosight NTA）测量，PBAE 纳米颗粒的尺寸通常在 10...
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讨论
上述方案描述了评估纳米颗粒制剂转染效率的方法，以及表征纳米颗粒粒径和DNA载量的方式。每个颗粒所携带的质粒数量是一个重要的参数，可用于预测颗粒的有效性，也可用于剂量确定。纳米颗粒追踪分析可在多种不同的水溶液中进行，例如不同盐浓度的溶液。通常在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行该表征，以模拟生理盐水环境。尽管在PBS中测定粒径可较好地估计纳米颗粒在培养基或生理盐水中的实际尺寸，但样品中血清的含量可能影响纳米颗粒的尺寸和稳定性17。因此，在不同浓度血清条件下对颗粒进行表征，对某些应用而言也十分重要。为了在血清中对颗粒进行表征，由于血清蛋白会产生较高的背景散射，建议增加一个额外步骤。在此情况下，应对颗粒进行荧光标记，以便通过荧光滤光技术，将颗粒与血清蛋白区分开来，实现特异性追踪。
质粒每粒子定量方法具有足够的通用性，可适用于不同的纳米颗粒制剂，包括其他聚合物或无机颗粒系统。由于不同材料的光散射行为各异，视频采集和处理参数可能需要进行调整。此外，纳米颗粒追踪分析（NTA）的灵敏度也可能随材料的不同而变化。上述所述的质粒每粒子检测方案是一种快速且有效的纳米颗粒表征方法。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 TEDCO MSCRF（2009-MSCRFE-0098-00）和 NIH R21CA152473 项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 1×磷酸盐缓冲液（PBS） | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| 胰蛋白酶（Trypsin） | Invitrogen | 25300 | |
| 乙酸钠缓冲液 | Sigma-Aldrich | S7899 | 用去离子水稀释至25 mM |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP 质粒DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed 质粒DNA | Addgene | 21718 | |
| 支化聚乙烯亚胺（PEI） | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One 溶液 | Promega | G3580 | |
| 材料 | |||
| 透明平底96孔板，无菌 | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| 透明圆底96孔板，无菌 | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12通道Finnpipette移液器 | Thermo Scientific | NA | 5–50 和 50–300 μl |
| 荧光显微镜 | Zeiss | NA | 型号：AX10 |
| C6 Accuri 流式细胞仪 | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt 进样装置 | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
参考文献
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