用于基因递送研究的原位膀胱癌模型

摘要

将肿瘤细胞植入其起源器官可作为评估新型疗法的一种有效临床前模型。MB49 膀胱癌细胞可通过膀胱内灌注在膀胱内生长。本方案展示了用于肿瘤植入和腺病毒递送的小鼠膀胱插管技术。

摘要

膀胱癌是泌尿生殖道第二常见的癌症，亟需能够降低复发和进展风险的新型治疗策略。肿瘤微环境可显著影响肿瘤的发展及对治疗的反应。因此，通常希望将肿瘤细胞培养于其起源器官中。本方案描述了一种膀胱癌原位模型，其中通过导管将MB49小鼠膀胱癌细胞灌注至膀胱内。该模型中成功植入肿瘤细胞需要破坏保护性的糖胺聚糖层，这可通过物理或化学方法实现。在本方案中，于细胞灌注前使用胰蛋白酶处理膀胱。在肿瘤建立后，也可通过膀胱导管递送治疗药物。本方案介绍了表达荧光素酶报告基因的腺病毒载体的递送方法。尽管本方案已针对短期研究进行了优化，并侧重于基因递送，但小鼠膀胱导管技术具有广泛的应用前景。

引言

膀胱癌是泌尿生殖道中第二常见的癌症，预计2012年将有近75,000例新发病例和15,000例死亡病例¹。由于复发率高，患者需要终身随访，这使得膀胱癌成为治疗成本最高的癌症之一。已侵入肌层的膀胱癌可能通过淋巴系统转移至肝脏、肺或骨骼。晚期肿瘤的多模式治疗在5年后的生存率仅为20-40%。因此，迫切需要有效的治疗策略，以减少表浅性膀胱癌的复发和进展，并改善晚期疾病患者的治疗效果。

新型治疗手段的开发需要在初步研究后利用临床前模型来评估其有效性 体外 评估。肿瘤微环境可显著影响癌症的发展及治疗反应性，这凸显了建立肿瘤在原发器官中发生或可被植入的临床前模型的重要性。一种方法是构建转基因模型，使肿瘤能够自发产生或以器官特异性方式被诱导。近期已发表了一项优秀的转基因膀胱癌模型实验方案。²转基因模型的缺点在于肿瘤发展较慢，且均匀性不如预期。此外，还需考虑维持繁殖群体的成本。一种替代转基因模型的方法是肿瘤细胞的原位移植，其优势在于可在商品化小鼠中快速建立肿瘤。尽管某些人膀胱癌细胞系可进行原位培养（我们已成功使用UM-UC-3），但在免疫功能健全的小鼠体内建立肿瘤可能更具优势。两种可进行原位生长的鼠源性膀胱癌细胞系为MBT-2和MB49。³由于MBT-2细胞被复制型C型逆转录病毒污染⁴我们选择MB49细胞用于本研究。需要注意的是，MB49细胞源自雄性小鼠，而由于解剖学原因，原位移植通常在....

方案

所有涉及动物的实验程序均经过南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会审查并批准。  该实验方案根据美国农业部疼痛类别D获得批准。 

1. 细胞植入

1. 操作前两天，接种 1 x 10⁶ 将MB49细胞接种至T-25培养瓶中。使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基（如需要可添加抗生素）。每组最多五只同时进行麻醉和接种的小鼠使用一个培养瓶即可。
2. 在实验当天，将无菌的0.25%组织培养级胰蛋白酶用无菌DMEM基础培养基按1:2比例稀释至0.125%，以制备用于灌注的胰蛋白酶溶液。每10只小鼠准备1.2 ml即可。置于37 °C 水浴中平衡。
3. 预热加热垫，并将其放置在用于输送异氟烷的麻醉系统鼻罩下方。在加热垫上铺一张干净的吸水垫。
4. 将小鼠放入麻醉系统的诱导室中，使用3%异氟烷诱导麻醉。当小鼠失去意识（通过脚趾夹捏反射消失确认）后，将其转移至鼻罩。确保每只动物呈仰卧位，并正确放置于加热垫上以维持体温。
5. 将异氟烷浓度降低至2%以维持麻醉状态。
6. 在双眼涂抹眼用软膏以防止干燥。
7. 可选步骤：去除腹部毛发。如果下腹部有毛发，则必须去除 体内 将进行生物发光成像。
   1. 在下腹部约2.5厘米范围内均匀涂抹一层足量的脱毛膏（如Veet） 腹部剃毛区域呈....

结果

植入200,000个MB49细胞后8天内，几乎所有小鼠均出现血尿。如图所示 图1，非荷瘤小鼠的膀胱重量为34.7±3.3 mg（范围31–37 mg，n=4），而植入MB49细胞的小鼠膀胱重量增至87.5±19.2 mg（范围77–120 mg，n=10），超过原重量的两倍。在基因递送方面，我们发现病毒灌注后24小时进行成像所获得的信号强于48小时后的信号图 2）。腺病毒递送在不同动物之间具有高度变异性，因此在为统计学目的规划组大小时应考虑这一因素（图2 和 3）。如果无法获得小型动物成像系统，可采用替代方法检测荧光素酶报告基因的表达，即取出膀胱组织并进行匀浆处理 体外 分析。比较 体内 使用IVIS200小动物成像系统进行分析及 体外 使用Steady-Glo试剂盒进行分析，表明数据集之间具有良好的相关性（图 3).

讨论

本方案中描述的主要方法是小鼠膀胱插管，该方法可广泛应用于向膀胱上皮局部递送细胞或任何其他试剂。上述具体方案已针对短期研究（约10天）进行了优化。准确植入细胞数量至关重要，因为细胞数量过多将导致肿瘤生长加快，并可能因肿瘤负荷过大而导致动物死亡。使用200,000个MB49细胞进行灌注时，可能在第14天前需对多达25%的动物实施安乐死，以避免过度的肿瘤负荷。根据我们的经验，小鼠在12天内通常不会因肿瘤负荷而出现不良影响。除嗜睡、毛发凌乱和/或食欲减退等常规指标外，该模型中肿瘤负荷过重的表现还包括排尿困难或无法排尿。

本方案需考虑的重要事项包括实验安排。首先，MB49细胞增殖迅速，接种一百万个细胞并在植入前两天进行培养，可使细胞在灌注当天处于最佳的对数生长期。若实验所需的动物数量超过单日可完成植入的数量，则需相应地在多个不同日期分别准备MB49细胞培养物，以避免细胞过度生长。其次，在技术尚未完全熟练之前，建议使用者先以少量动物进行操作。经验丰富的操作者可在无需助手的情况下，于一天内完成6组、每组5只小鼠的植入操作（每组耗时约1.5小时，含停留时间）。然而在初期阶段，建议配备一名助手负责细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录编号	评论
6-8周龄雌性小鼠	杰克逊实验室	品系名称：C57BL/6J 货号：000664
胰蛋白酶*	MediaTech	MT25-053-CI	通过 Fisher 获得
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	通过 Fisher 获得
FBS	Hyclone	SH30071.03	热灭活
T25 培养瓶*	康宁科斯特	Corning 编号：3056 Fisher: 07-200-63	通过 Fisher 获得
MB49细胞	膀胱癌是泌尿生殖道第二常见的恶性肿瘤，亟需开发能够降低复发率和进展风险的新型治疗策略。肿瘤微环境可显著影响肿瘤的发生发展及对治疗的反应，因此在肿瘤来源的器官中培养肿瘤细胞往往具有重要意义。本实验方案描述了一种膀胱癌原位模型，通过导管将MB49小鼠膀胱癌细胞植入膀胱。该模型中成功植入肿瘤细胞需要破坏膀胱黏膜的保护性糖胺聚糖层，可通过物理或化学方法实现。在本方案中，于细胞灌注前使用胰蛋白酶处理膀胱。在肿瘤建立后，亦可通过膀胱导管递送治疗药物。本方案进一步阐述了表达荧光素酶报告基因的腺病毒载体的递送方法。尽管本方案主要针对短期研究并聚焦于基因递送，但小鼠膀胱导管技术具有广泛的应用前景。	N/A	由 Boehle 博士提供（参见参考文献）11)
Puralube Vet 软膏*	Pharmaderm	Henry Schein 公司 编号：036090-6050059 Fisher: NC9676869	通过 Fisher 获得
脱毛膏：Veet	本地药店
润滑剂： K-Y润滑剂	本地药店
导管*	Exel International	Exel International 编号：26751 Fisher: 14-841-21	通过 Fisher 获得
异氟烷	特雷尔	NDC 66794-011-25	通过医院药房获得
1 ml 滑动接头结核菌素注射器	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-荧光素	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000；请求大规模扩增并进行CsCl纯化 在体内 使用	需要 BSL2 级防护的传染性病原体
Steady-Glo 荧光素酶检测系统	普洛麦格	E2510（10 ml）、E2520（100 ml）或 E2550（10 × 100 ml）
*可通过多家供应商获得
设备
麻醉系统	E-Z Systems，Euthanex Corporation	麻醉系统：EZ7000 5端口小鼠再呼吸装置：EZ109	通过 Fisher 获得
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2