四肢肌肉收缩性和被动力学特性的改变是肌肉疾病的重要生物标志物。本文描述了用于测量小鼠趾长伸肌和胫骨前肌这些特性的生理检测方法。
本文内容
摘要
摘要
身体运动主要由骨骼肌的机械功能提供。骨骼肌由许多被肌内结缔组织包裹的肌纤维束组成。每条肌纤维包含多条沿肌纤维长轴纵向排列的肌原纤维。肌原纤维是肌肉的收缩装置，由重复的收缩单位（称为肌节）构成。一个肌节包含由Z盘和肌联蛋白（titin）分隔的肌动蛋白和肌球蛋白细丝。骨骼肌的机械功能由肌肉的收缩性和被动特性定义。收缩性特性用于表征肌肉收缩过程中产生的力量大小、力量生成时间以及肌肉舒张时间。任何影响肌肉收缩的因素（如肌动蛋白与肌球蛋白细丝之间的相互作用、钙离子稳态、ATP/ADP比值等）都会影响肌肉的收缩性特性。被动特性指的是肌肉在无收缩状态下的弹性和黏性特性（即刚度和黏度）。这些特性由细胞外和细胞内的结构成分（如肌联蛋白）以及结缔组织（主要是胶原蛋白）决定1-2。收缩性和被动特性是肌肉功能不可分割的两个方面。例如，肘关节屈曲动作是通过上臂前侧肌群的收缩和上臂后侧肌群的被动拉伸共同完成的。要真正理解肌肉功能，必须同时研究其收缩性和被动特性。
肌肉的收缩性和（或）被动力学特性在肌肉疾病中常常受损。一个典型的例子是杜氏肌营养不良症（DMD），这是一种由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）缺乏引起的严重肌肉消耗性疾病3。抗肌萎缩蛋白是一种细胞骨架蛋白，可在肌肉收缩过程中稳定肌细胞膜（肌膜）4。在缺乏抗肌萎缩蛋白的情况下，力传递过程中产生的剪切力会损伤肌膜。这种膜撕裂会引发一系列连锁反应，导致肌细胞死亡和收缩装置的丧失。因此，肌肉力量下降，死亡的肌纤维被纤维化组织所取代5。这一后续变化会增加肌肉的刚度6。准确测量这些变化对于评估疾病进展以及确定新型基因、细胞或药物干预治疗效果具有重要意义。本文中，我们介绍两种方法，用于评估趾长伸肌（extensor digitorum longus, EDL）肌肉的收缩性和被动力学特性，以及胫骨前肌（tibialis anterior, TA）肌肉的收缩特性。
方案
1. 评估EDL肌肉的收缩性与被动特性 离体
测量EDL肌肉的收缩性和被动特性 离体 使用 Aurora Scientific 体外 肌肉测试系统。参考 表1 用于材料和设备。
1.1 仪器设备准备
- 通过将氧合管固定到夹套式组织浴槽上，组装组织浴槽系统。将组装好的浴槽连接到肌肉固定装置上。将气体管路连接至氧合管。将水循环管路固定到夹套式组织浴槽上，并将针阀插入浴槽的排水口。
- 开启循环水浴并调节温度至 30 °C 7。使 95% O2-5% CO2 混合气体以 5 PSI（每平方英寸磅力）的压力通过氧合管。用任氏液缓冲液充满浴槽。通过调节氧合管阀门，持续通气至少 10 分钟以平衡缓冲液。
- 打开仪器（刺激器、双模式杠杆系统和信号接口）。根据制造商说明加载动态肌肉控制（DMC）软件。
1.2 EDL 肌肉解剖
所有动物实验必须获得机构动物护理和使用委员会的批准。
- 通过腹腔注射麻醉剂混合液，剂量为每克体重2.5 μl（参见材料部分）。在整个手术过程中，通过夹捏脚趾检查麻醉深度。必要时追加初始剂量的10%以维持动物处于麻醉状态。剃除后肢毛发。在解剖操作前，将小鼠置于加热垫上，维持核心体温在37 °C。使用热探针持续测量直肠温度以监测体温。
- 将小鼠仰卧位固定于解剖板上（图1）。剥离腿部皮肤以暴露后肢肌肉。用两枚裁缝针将腿部固定在硅胶板上，一枚固定足部，另一枚固定股薄肌。在小鼠身体上方放置加热灯，以维持核心体温在37 °C。持续用任氏液（Ringer's buffer）灌流所有暴露的肌肉，并通过真空管线引流多余的液体。
- 在体视显微镜下向足部方向解剖皮肤，暴露趾长伸肌（TA）远端肌腱和伸肌韧带。轻柔地去除覆盖在TA肌肉表面的筋膜。切断伸肌韧带以释放远端TA肌腱。
- 切断远端TA肌腱，并利用该肌腱剥离TA肌肉。小心地从近端附着点处分离TA肌肉。在趾短伸肌（EDL）旁放置一小块浸有任氏液的棉球，以吸收TA肌肉血管破裂引起的出血。使用真空管线清除多余的缓冲液和血液。
- 在远端EDL肌肉的肌腱连接处（MTJ），使用丝线缝合双重重叠方结，随后打一个环结（图2）。在股二头肌远端部分做切口，暴露近端EDL肌肉。在近端EDL肌腱的MTJ处重复相同的结扎操作（图2）。使用同一根缝线，以双重重叠方结将杠杆臂钩连接至近端或远端的结扎处。剪除剩余的缝线。
- 在近端缝合结上方切断近端EDL肌腱。用钩子提起EDL肌肉，并切断肌肉下方的血管组织。在远端缝合结下方切断远端EDL肌腱，从而将EDL肌肉从后肢完全取出。用一块浸有任氏液的棉球覆盖暴露的后肢组织。
- 将钩子连接至杠杆臂。将肌肉垂直对齐于两个电极之间。将远端缝线固定在固定柱上。抬高组织浴槽，使肌肉完全浸没于任氏液中。使用粗/细调节双位移平台调整静息张力至1.0 g，并让肌肉至少平衡稳定10分钟。
1.3 测量趾长伸肌的收缩特性和被动特性
使用表2在DMC软件中为以下每项测量设置参数。使用动态肌肉分析（DMA）软件分析数据。
1.3.1 测量趾长伸肌的收缩特性
- 以150 Hz频率刺激EDL肌肉三次，每次间隔60秒，以稳定肌肉8。
- 在不同静息张力下刺激EDL肌肉，以确定其最适长度（Lo）。最适长度是指肌肉产生最大单收缩张力时的长度。每次刺激后让肌肉松弛2分钟。
- 将静息张力调整至Lo。测量单次电刺激下的肌肉力量。确定绝对单收缩力（Pt）、达到峰值张力的时间（TPT）以及Pt的半舒张时间（½ RT）。刺激后让肌肉松弛2分钟。
- 将静息张力调整至Lo。测量在不同刺激频率（50、80、100、120、150和200 Hz）下产生的强直收缩肌肉力量。确定肌肉力量达到最大时的绝对最大强直收缩力（Po）。测量Po的TPT和½ RT9。
- 让肌肉松弛5分钟。将静息张力调至Lo。进行10轮离心收缩，每轮之间休息2分钟。计算每轮离心收缩后Po的相对力量损失。
- 将EDL肌肉从装置上取下，并在缝合处切断肌腱。测定肌肉湿重，并计算肌肉横截面积（CSA）6,10。
1.3.2 测定趾长伸肌的被动特性
- 解剖对侧的趾长伸肌（EDL），并按照第1.2节第2至7步所述方法将其连接至装置。
- 对EDL肌肉实施六步拉伸方案，将肌肉逐步拉伸至初始长度（Lo）的160%，每次增加10% Lo。分析其应力-应变曲线6。
- 通过测量肌肉在拉伸并维持在10% Lo后不同时间段的应力松弛率（SRR），评估EDL肌肉的黏性特性：从峰值至峰值后0.1秒（pp）、0.1至0.2秒pp、0.2至0.5秒pp、0.5至1秒pp，以及1至1.5秒pp。
- 研究结束时，在小鼠仍处于麻醉状态下，采用颈椎脱位和/或断头法实施安乐死。将EDL肌肉从装置上取下，并在缝合处切断肌腱。测定肌肉湿重，并计算肌肉横截面积（CSA）6,10。
2. 胫骨前肌收缩特性的评估 原位
使用Aurora Scientific in situ 肌肉测试系统测量TA肌肉的收缩特性。有关材料和设备，请参见表1。
2.1 仪器设备准备
- 使用循环水浴将温控动物载物台加热至 37 °C。
- 打开仪器（刺激器、双模式杠杆系统和信号接口），并根据制造商说明加载 DMC 软件。
2.2 胫骨前肌的准备 原位 力测量
- 按照第1.2节中步骤1至3所述，麻醉小鼠，剃除后肢毛发并暴露胫前肌（TA肌）。
- 使用丝线在髌韧带上打双重重结。在远端TA肌的肌腱连接处（MTJ）打一个双重重结，随后打一个环结（图2）；使用同一根缝线，在距离远端TA肌腱结约10 mm处留出一个环，再打另一个双重重结，并将第二个双重重结置于环的一侧。
- 移除后肢的固定针，将动物置于俯卧位。暴露股二头肌，沿中线做切口以暴露坐骨神经。在坐骨神经近端打一个双重重结，剪断缝线一端，并在结的上方切断神经。利用缝线将坐骨神经轻轻向膝关节方向牵拉，清除周围结缔组织，使其约5 mm长度游离。操作过程中切勿牵拉神经，并持续用任氏液（Ringer's buffer）灌流神经表面。
- 按照步骤1至3准备对侧TA肌。用一块浸有任氏液的棉布覆盖一侧暴露的后肢。持续用预热至37 °C的任氏液灌流双侧后肢，并通过真空管路吸除多余液体。
- 将动物俯卧固定于动物平台。将膝关节夹持器安装至动物平台，使用髌韧带缝线通过双重重结将双侧膝关节固定于金属针上。用裁缝针将双侧足部固定在硅胶板（sylgard block）上。将动物平台固定于温控载物台上。调节加热灯位置，以维持动物核心体温在37 °C。
- 将电极架固定于动物平台，利用缝线将坐骨神经放置于电极上。确保电极远离后肢肌肉。在未覆盖侧后肢的MTJ缝合处切断远端TA肌腱。将远端TA肌腱的缝线环连接至杠杆臂的挂钩上。用温热的浸有任氏液的棉布覆盖暴露的后肢肌肉。
2.3 测量胫骨前肌的收缩特性
- 使用表2在DMC软件中设置参数。按照第1.3.1节所述相同方案测定TA肌肉的收缩特性。使用DMA软件分析数据。
- 完成收缩特性测量后，将远端TA肌腱缝合环从张力调节臂的挂钩上取下。取出TA肌肉，测定肌肉湿重，并计算横截面积（CSA）10。
- 根据上述步骤1至3，测定对侧TA肌肉的收缩特性。研究结束后，按照机构指南实施小鼠安乐死。
结果
以下结果来自我们此前的报告6,9。数据以均值±均值标准误表示。表3展示了4至6月龄正常BL10小鼠和抗肌萎缩蛋白缺陷型（mdx）小鼠EDL肌肉的形态计量学特性。图4展示了BL10小鼠和mdx小鼠EDL肌肉的代表性收缩和被动特性。EDL肌肉的收缩特性通过以下参数描述：比（绝对力除以横截面积）收缩力（图4A）、比最大强直力（图4B）、绝对最大强直力的收缩达峰时间（TPT）和半舒张时间（½ RT）（图4C和图4D）。TPT和½ RT也可由绝对收缩力计算得出。应力-应变曲线（图4E）和应力松弛率（SRR）（图4F）用于描述EDL肌肉的被动特性。
缺失肌营养不良蛋白对趾长伸肌的收缩性和被动特性具有显著影响6,9。mdx小鼠的趾长伸肌其特异性单次收缩力和强直收缩力均显著降低。mdx趾长伸肌的收缩达峰时间（TPT）显著缩短，而半舒张时间（½ RT）则显著延长。应力-应变曲线表明，mdx趾长伸肌的刚度显著增加。mdx趾长伸肌在达到峰值应力前产生的抵抗力量（被动应力）显著更高，而在峰值之后的应力下降速度也更快。此外，与BL10趾长伸肌相比，mdx趾长伸肌的应力松弛率（SRR）显著升高。
统计分析
两组之间的统计学显著性差异采用学生t检验进行分析。对于多组之间的统计学显著性差异，建议使用SAS软件（SAS Institute Inc., Cary, NC）进行单因素或双因素方差分析（ANOVA），并随后进行Bonferroni post hoc 检验。当p < 0.05时，认为差异具有统计学显著性。
表1. 材料与仪器。
| 实验 | 静息张力（克） | 脉冲频率（Hz） | 脉冲宽度（ms） | 刺激持续时间（ms） | 拉伸长度 | 拉伸持续时间（ms） | 拉伸速率 | 评论 |
| 1. 评估EDL肌肉的收缩性和被动特性 离体 | ||||||||
| 1.3.1 测定趾长伸肌的收缩特性 | ||||||||
| 1. 预热 | 1.0 | 150 | 0.2 | 300 | 每次刺激之间让肌肉休息 60 sec。这些初步的强直性收缩有助于稳定肌肉，为后续测量做好准备。 | |||
| 2. 最佳肌肉长度（Lo） | 0.5、1.0、1.5 和 2.0 | 1 | 0.2 | 300 | 每次刺激之间让肌肉放松30秒。使用数显卡尺测量肌肉的最适长度。 | |||
| 3. 单次抽搐力 (Pt) | 调节静息张力至 Lo | 1 | 0.2 | 300 | ||||
| 4. 强直性肌肉收缩力 | 调节静息张力至 Lo | 50、80、100、120、150 和 200 | 0.2 | 300 | 每次刺激之间让肌肉放松1分钟。确定产生最大绝对强直收缩力（Po）的频率。 | |||
| 5. 离心收缩 | 调节静息张力至 Lo | 使用产生最大强直收缩力（Po）的频率 | 0.2 | 700 | 10% Lo | 刺激持续时间的最后200毫秒 | 0.5 Lo/秒 | 重复离心收缩10个循环，每个循环之间休息2分钟。 |
| 6. EDL 肌肉的横截面积 | CSA = （肌肉质量 (g) / [1.06 g/cm3 x（Lo × 0.44）]。1.06 g/cm3 是肌肉密度，0.44 是 EDL 肌纤维长度与 Lo 的比值。 | |||||||
| 1.3.2 测定趾长伸肌的被动特性 | ||||||||
| 六步拉伸方案 | 调节静息张力至 Lo | 10% Lo | 2 cm/sec | 以10% Lo为增量重复拉伸方案，直至达到160% Lo。每次拉伸循环之间间隔1.5秒。 | ||||
| 2. SRR | 调节静息张力至 Lo | 10% Lo | 2 cm/sec | SSR 通过将某一时间段内两个时间点之间的应力差除以相应的时间间隔来计算。 | ||||
| 2.3 测定趾长伸肌的收缩特性 | ||||||||
| 1. 预热 | 4.0 | 150 | 0.2 | 300 | 每次刺激之间使肌肉休息 60 秒。 | |||
| 2. 最佳肌肉长度（Lo） | 3.0、4.0、5.0、6.0 和 7.0 | 1 | 0.2 | 300 | 每次刺激之间让肌肉放松 30 秒。使用数显卡尺测量肌肉的最适长度。 | |||
| 3. 胫骨前肌的横截面积 | CSA = （肌肉质量 (g) / [1.06 g/cm3 x（Lo × 0.6）。0.6 是趾长伸肌（TA）肌纤维长度与 Lo 的比值。 | |||||||
表2. 评估EDL和TA肌肉机械性能的参数。
| 品系 | 年龄（月） | 体重 (g) | EDL 肌肉重量 (mg) | EDL 肌肉最佳长度 (mm) | EDL 肌肉横截面积 (mm2) |
| BL10 | 6 | 32.03 ± 0.57 | 13.90 ± 0.77 | 14.09 ± 0.04 | 2.12 ± 0.12 |
| mdx | 6 | 35.44 ± 0.42* | 16.73 ± 0.42* | 13.93 ± 0.05* | 2.57 ± 0.07* |
表3. EDL肌肉的形态计量学特性。 *，mdx小鼠的数值与同龄BL10小鼠相比具有显著差异。
图 1. 自制小鼠解剖板的示意图。 解剖板由厚度为 ½ 英寸的有机玻璃制成，并在机构车间加工完成。 点击此处查看大图。
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图 2. 一系列数字图像，展示在肌腱-骨连接处（MTJ）打双重重方结后接环结的步骤。 星号：EDL 肌肉；箭头：EDL 肌肉的远端肌腱。
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图3. 自制平台的示意图 原位 TA肌肉功能检测 亚克力动物平台和不锈钢膝关节固定器设计用于安装在809B上 原位 小鼠实验装置 *，不锈钢棒（货号 MPR-2.0，Siskiyou，Grants Pass，OR）； #，通用电极夹持器（货号：MXB，Siskiyou，Grants Pass，OR）；§，电极连接杆（货号：MPR-3.0，Siskiyou，Grants Pass，OR）； **，Sylgard 块。 单击此处查看大图.
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图4. EDL肌肉收缩性与被动特性的代表性结果。 趾长伸肌的收缩特性 其特征包括比 twitch 力（A）、比强直力（B）、达到峰值张力的时间（C）和半松弛时间（D）。EDL 肌肉的被动特性通过应力-应变曲线（E）和 SSR 进行评估。* mdx 小鼠与同龄的BL10小鼠存在显著差异。
讨论
在此方案中，我们展示了用于测量趾长伸肌（EDL）肌肉收缩与被动特性的生理学检测方法，以及胫骨前肌（TA）肌肉收缩特性的检测方法。肌肉生理学研究中的一个主要问题是目标肌肉的供氧。对于较大的肌肉（例如 TA 肌肉），其 原位 该方法更受青睐，因为林格氏液中的氧气扩散可能无法到达肌肉中心区域 体外 检测 原位 该方法不会干扰正常的血液供应，避免了与缺氧相关的非生理性人工效应。趾长伸肌（EDL）是生理学研究中最常用的肌肉之一。通过该方法可实现整个肌肉的充分氧合 体外 系统由于肌肉体积较小。此外， 体外 系统提供一个封闭环境，用于调控离子（Ca 2+，钠+ 和 K+）以及对肌肉产生最佳力量所必需的化学物质（ATP 和葡萄糖）。这为研究这些变量对力量产生的影响提供了极好的机会。
准确测量肢体肌肉的收缩性和被动特性对于研究骨骼肌功能至关重要。这些特性的特征性改变通常被视为多种肌肉疾病的标志。这些参数的变化也是判断实验性治疗是否有效的关键指标。
披露
Aurora Scientific 已支付开放获取费用。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（AR-49419，DD）、肌肉萎缩症协会（DD）以及美国国立卫生研究院培训基金T90DK70105（CH）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织-器官浴槽 | Radnoti LLC, CA, USA | 水套式组织浴槽（货号 #158351-LL），氧气分散管（货号 #160192），鲁尔阀（货号 #120722） | |
| 循环水浴装置 | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| 混合气体 | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 和 5% CO2 | |
| 体外 肌肉功能检测装置 |  Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | 该系统包括刺激器（型号 #701A）、双模式杠杆系统（型号 #300C 或 305C）、信号接口（型号 #604B）以及用于垂直安装组织浴槽的测试装置（型号 #800A） | |
| 体外 肌肉功能检测软件 | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | 动态肌肉控制（DMC）软件和动态肌肉控制数据分析（DMA）软件 | |
| 用0.9% NaCl配制的小鼠麻醉混合液 | 参照机构指南 | 氯胺酮（25 mg/ml）、赛拉嗪（2.5 mg/ml）和乙酰丙嗪（0.5 mg/ml）。在整个手术过程中，可能需要补充初始剂量的10%，以维持动物的麻醉状态。 | |
| Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
| 定制的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）解剖板 | 自行设计 | 参见 图1 | |
| 加热灯 | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15瓦灯泡，用于在解剖过程中保持小鼠体温 | |
| Ringer's缓冲液 | 化学试剂购自Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 成分（单位：mM）：1.2 NaH2PO4（货号 #S369）、1 MgSO4（货号 #M63）、4.83 KCl（货号 #P217）、137 NaCl（货号 #217）、24 NaHCO3（货号 #S233）、2 CaCl2（货号 #C79）和10葡萄糖（货号 #D16）。分别溶解各化学试剂，并按上述顺序混合。4 °C保存。 | |
| 立体解剖显微镜 | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| 解剖工具 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 粗镊子、粗剪刀、精细镊子（直头和45 °角） | |
| 编织丝线缝合线 #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
| 定制不锈钢钩 | Small Parts, Inc. | 2英寸长，S/S 304V（直径0.18英寸），适用于力传感器305C；或2.5英寸长，S/S 304V（直径0.012英寸），适用于传感器300C（货号 ASTM A313） | |
| 在体 肌肉功能检测系统 | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | 该系统（809B，在体 小鼠装置）包括刺激器（型号 #701B）、双模式杠杆系统（型号 #305C）、信号接口（型号 #604A）以及温控脚板装置（型号 #809A） | |
| 体外 肌肉功能检测软件 | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | 动态肌肉控制（DMC）软件和动态肌肉控制数据分析（DMA）软件 | |
| 定制的胫骨前肌（TA）检测动物平台 | 自行设计 | 参见 图2 | |
| 定制不锈钢钩 | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5英寸长，S/S 304V（直径0.18英寸） |
| 定制25G铂电极 | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | 将两根厚0.016英寸的铂丝焊接到两根24G电线 | |
表1. 材料与设备。 |
参考文献
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重印与许可
