利用定量实时 PCR 检测在竞争性小鼠骨髓移植模型中供体细胞的植入情况

摘要

在缺乏明确表型标志物的小鼠骨髓移植模型中，确定供体细胞植入情况具有挑战性。我们描述了一种定量分析雄性供体细胞在雌性移植受体小鼠中植入程度的方法。该方法适用于所有小鼠品系，可用于造血干细胞（HSC）功能的研究。

摘要

小鼠骨髓移植模型是评估造血干细胞（HSC）功能以及鉴定调控HSC的基因/分子的重要工具。在这些移植模型系统中，HSC的功能通过其细胞植入并重建经致死剂量照射的受体小鼠的能力来确定。通常，通过流式细胞术使用针对供体特异性细胞表面蛋白的抗体来检测供体细胞的贡献/植入情况。然而，该方法高度依赖于细胞表面标志物的特异性及其区分供体来源细胞与受体来源细胞的能力，而这类标志物并非在所有小鼠品系中都可用。考虑到市场上存在的多种遗传修饰小鼠品系背景，这种基于细胞表面标志物/流式细胞术的方法在缺乏明确表面标志物以区分供体细胞与同源受体细胞的小鼠品系中存在显著局限性。本文报道了一种基于PCR的技术，用于测定移植受体小鼠中供体细胞的植入/贡献情况。我们将雄性供体骨髓HSC移植至经致死剂量照射的同源雌性小鼠体内。在移植后不同时间点采集外周血样本，实验结束时获取骨髓样本。提取基因组DNA，并利用定量实时PCR扩增Y染色体特异性基因Zfy1。通过已知雄性细胞比例的标准曲线，计算雌性受体小鼠中雄性供体来源细胞的植入水平。 与 女性DNA。以Bcl2作为参考基因以标准化总DNA量。我们的数据表明，该方法可可靠地测定供体细胞的植入情况，为评估小鼠骨髓移植模型中造血细胞重建提供了一种简便且实用的检测手段。由于无需流式细胞术等昂贵设备，本方法可在大多数实验室常规开展。

引言

小鼠骨髓（BM）移植模型最早于20世纪60年代建立¹。该模型被广泛用于研究供体造血干细胞（HSC）在受体小鼠体内的生物学特性。小鼠骨髓移植模型为我们提供了关于HSC功能及其调控机制的宝贵知识，在HSC研究中具有不可替代的作用。许多实验室采用同种异体骨髓移植模型（如C57Bl/6J^H2b-Balb/C^H2d）或同源移植模型（如C57Bl/6J^CD45.2-B6.SJL^CD45.1），用于研究基因对HSC活性的功能影响²、药物处理对HSC功能的作用³，以及移植物抗宿主病（GvHD）等与移植相关的疾病⁴。

细胞表面标志物（如MHC单倍型或CD45.1）常用于区分供体来源的细胞与受体来源的细胞。C57Bl/6J^{H2b, CD45.2}、Balb/C^H2d 和 B6.SJL^CD45.1 是骨髓移植中最常用的小鼠品系，因为可通过流式细胞术检测CD45.1 vs. CD45.2 或 H2b vs. H2d 来轻松评估供体细胞的贡献。然而，其他许多品系（如FVB/NJ⁵ 和 C3H）也常用于构建基因工程转基因或基因敲除小鼠。这些小鼠可能被回交至近交系，并维持在混合的遗传背景/MHC背景下。在此类情况下，由于可能缺乏供体特异性的细胞表面标志物，确定供体细胞的植入情况及造血干细胞（HSC）功能可能会较为困难。

利用Y染色体特异性DNA探针通过Southern印迹法在性别不匹配的骨髓移植中检测供体雄性细胞，最初由Miwa博士的研究团队建立⁶。随后，针对Y染色体性别决定区的实时PCR被发现是一种准确且高特异性的方法，可用于定量母体血液系统中的雄性胎儿细胞⁷。Schwarzenberger博士的研究团队将此概念应用于小鼠骨髓移植模型，开发出一种实时PCR技术以测定供体细胞的植入情况⁸。我们进一步改进了该方法，用于FVB/NJ小鼠骨髓移植模型中供体细胞植入的检测。目前，本课题组广泛采用该方法研究Pim1激酶在造血干细胞生物学中的作用。

方案

1. 骨髓细胞分离

1. 使用 CO₂ 法处死雄性供体 FVB/NJ 小鼠和雌性 FVB/NJ 小鼠，随后进行颈椎脱位。雌性 FVB/NJ 小鼠的骨髓细胞将用作竞争性细胞。
2. 使用小型剪刀和镊子从小鼠体内分离股骨和胫骨，并将其置于含有 6 ml 冰冷 RPMI1640 培养基（含 5% 热灭活 FBS）的 60 mm 组织培养皿中。用纸巾擦除肌肉和其他组织，并在培养皿中将每根骨两端剪断。
3. 将 3 ml 注射器上安装 23G 针头，针头插入骨端，用含 5% 热灭活 FBS 的 RPMI1640 冲洗骨髓至培养皿中。用同一针头反复吹打，使骨髓组织充分分散。将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。
4. 以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，加入 1 ml 室温红细胞裂解缓冲液（155 mM 碳酸氢钾、10 mM 氯化铵、0.1 mM EDTA，pH = 7.4），室温孵育 5 分钟，然后加入 5–10 ml 含 5% 热灭活 FBS 的 RPMI1640 培养基。
5. 将细胞悬液过细胞滤器，收集滤过液至新管中。以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清；细胞沉淀中不应残留红色。无红色表明红细胞已完全去除。将细胞沉淀重悬于 10 ml 含 5% 热灭活 FBS 的 RPMI1640 培养基中，轻轻涡旋以确保细胞悬液均匀。取适量样品，用血细胞计数板计数细胞。根据骨髓移植所需量计算所需细胞体积，分装足够数量的细胞，并按 5:2 的比例混合雄性供体细胞与竞争性雌性细胞。以 400 × g 离心 5 分钟，用 PBS 洗涤，最后重悬于 PBS 中，使供体细胞终浓度为 5×10⁶/ml，竞争性细胞终浓度为 2×10⁶/ml。

2. 竞争性骨髓移植

1. 在骨髓移植前4-6小时，使用137Cs γ射线照射器对雌性受体小鼠（8-12周龄）进行单次11 Gy剂量的照射。
2. 将经照射的雌性小鼠放入小鼠固定器中，通过尾静脉注射0.1 ml总体积的混合供体细胞和竞争细胞，使每只小鼠接受5×10⁵个供体细胞和2×10⁵个竞争性骨髓细胞。

3. 样本采集

在骨髓移植后数周，于麻醉条件下通过小鼠眼后静脉采集体积约为 50 μl 的雌性受体小鼠外周血样本。样本收集至含 EDTA 涂层的采血管中。通常在实验结束时（移植后至少 4 个月）也可采用与前述相同的方法（步骤 1）收集骨髓样本；通常取单侧胫骨骨髓细胞的 20–40% 即可获得足量 DNA。同时采集年龄匹配的正常雌性和雄性小鼠的血液或骨髓样本，用于制备标准曲线。

4. 基因组DNA提取

1. 加入4× 室温红细胞裂解缓冲液体积（约 200 μl) 向每份血液样本中加入适量溶液，充分混匀，在室温下孵育5分钟。加入1 ml PBS，然后离心以去除大部分裂解的红细胞。
2. 使用血液DNA提取试剂盒（QIAmp DNA Blood extraction kit）提取DNA。将洗脱缓冲液（AE）在37℃预热。 °C以提高洗脱DNA的产量。标准曲线所用的雄性和雌性DNA以相同方法进行分离。
3. （可选）在存在 3 M 醋酸钠（pH=5.5）的条件下，可采用乙醇沉淀法进一步纯化或浓缩基因组 DNA。随后将 DNA 沉淀重悬于 40–50 μl 用于分析的蒸馏水，立即使用或于 -20℃ 保存 °用于将来使用。
4. 使用 Nanodrop ND-1000 分光光度计测定 DNA 浓度。OD 260/280 在 1.8–2.0 之间的样品用于后续分析。
5. 用无DNA酶的H稀释DNA₂0 至 4 ng/μl，总体积为50 μl.

5. 标准曲线制备

将雄性DNA和雌性DNA稀释至浓度为4 ng/μl，并根据表1配制DNA混合物

女性背景中男性DNA的百分比	4ng/μl 男性DNA体积（μl）	4ng/μl 女性DNA体积（μl）	总体积（μl）
0.2	1	499	500
0.5	1	199	200
2.5	5	195	200
12.5	25	175	200
50	100	100	200
87.5	175	25	200
100	200	0	200

表1. 标准曲线的样品制备。处死8-12周龄的正常雄性和雌性FVB/NJ小鼠，收集血液和骨髓细胞。分别提取雄性和雌性细胞的DNA，并重悬于浓度为4 ng/μL的溶液中。将雄性和雌性DNA以不同比例混合，制备DNA标准样品混合物。

6. 实时荧光定量 PCR

1. 通过将SYBR Green supermix试剂与引物和基因组DNA混合来设置PCR反应板。每个反应的总体积为20 μl，包含每种引物各400 nM，以及5 μl血液细胞基因组DNA（4 ng/μl × 5 μl = 20 ng）。DNA样本和标准品均设置三个重复。引物序列见表2。

基因名称	正向引物	反向引物
Bcl2	5′-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA	5′- CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1	5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA	5'- CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

表2. 小鼠 Bcl2 和 Zfy1 的 RT-PCR 引物序列。

2. 使用 Biorad iQ5 PCR 仪进行 PCR 反应，反应条件如下：95 °C 预变性 3 分钟，随后进行 42 个扩增循环（95 °C 变性 10 秒，58 °C 退火 25 秒，72 °C 延伸 15 秒），最后进行熔解曲线分析。
3. 通过 Bio-Rad iQ5 2.1 标准版光学系统获取循环阈值（Ct）值。计算 δCt 值（Ct^Zfy1 - Ct^Bcl2），Zfy1 的表达水平以 2^-δCt 的数值表示。
4. 利用已知性别比例的男性/女性标准混合样本的 2^-δCt 读数，为每组反应建立标准曲线。标准曲线通过将三个重复样本的 2^-δCt 值的平均值对混合物中已知的男性 DNA 百分比作图，并采用线性回归拟合生成。

结果

图1和图2 展示了使用2的平均值绘制的标准曲线示例^-δCt 针对男性DNA百分比。 图1A 显示 Bcl2 和 Zfy1 扩增子的特异性熔解温度，定位于 78.5 °C 和 88.5 °C，分别。Bcl2 用作参考基因，以标准化每次 PCR 反应中上样 DNA 的总量。各标准样品的 Bcl2 扩增曲线（对数视图）相互重合，不受男性 DNA 浓度影响，表明上样 DNA 量相等图1B）。然而，随着样本中雄性DNA含量的增加，Zfy1扩增曲线向左迁移（图1C）。为了验证我们的方法，我们检测了接受来自野生型（WT）小鼠骨髓细胞移植的小鼠体内雄性供体细胞的植入情况 与 Pim 三重敲除（TKO）小鼠在移植后不同时间点的分析。分别对移植后6周的外周血和16周的骨髓样本进行了检测。Pim TKO小鼠的造血干细胞在重建经致死剂量辐照的小鼠过程中存在缺陷（An, N 等，稿件正在修订中）。与移植了野生型（WT）细胞的小鼠相比，移植了Pim三重敲除（TKO）细胞的受...

讨论

本研究的目的是向读者提供一种基于PCR的技术，用于在竞争性小鼠骨髓移植模型中定量供体细胞的植入情况。已有若干研究报道使用RT-PCR在移植模型中检测供体细胞^9-10。Schwarzenberger博士的研究团队首次建立了一种利用实时PCR扩增Y染色体特异性序列的小鼠骨髓移植模型⁸。该方法曾被用于研究Gli-1在造血干细胞活性中的功能¹¹。随后，我们对该方案进行了进一步优化，并以可视化形式提供了详细、分步的实验操作流程。本方案的可视化呈现有助于读者更轻松地遵循操作步骤。我们还比较了使用骨髓样本基因组DNA与外周血DNA所得的PCR结果。骨髓样本与血液样本的供体植入数据基本一致，但通常骨髓样本中的变异较小。这可能是由于外周血红细胞裂解后残留的血红蛋白影响了血液样本中基因组DNA的纯度或质量所致。

我们基于 PCR 的技术在定量供体细胞植入方面具有多个优势。首先，该技术可在大多数实验室中开展，除实时荧光定量 PCR 仪外，无需其他特殊且昂贵的设备。我们进一步优化了 PCR 反应体系，采用 SYBR Green 超级混合液替...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	16140-017	热灭活
氯化铵	MP Biomedicaals	194806
碳酸氢钾	Fisher	P184-500
QIAamp DNA Blood mini试剂盒	Qiagen	51106
细胞滤网	BD bioscience
iQ SYBR Green 超级混合液	Biorad	170-8882
iQ5 实时 PCR 仪	Biorad
分光光度计	Nanodrop ND-1000	ND-1000