方法文章

新生儿脑室下区电穿孔

DOI：

10.3791/50197

⸱

2013年2月11日

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们展示出一种微创技术，新生儿脑室下区电。该技术包括新生幼崽的侧脑室注射质粒DNA和通电时提供神经干细胞和基因操纵

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经干细胞（NSCs）线的产后侧脑室，并产生多种细胞类型，包括神经元，星形胶质细胞和室管膜细胞。了解，利用其独特的修复潜力更好地理解大脑和中枢神经系统紊乱的分子通路的负责NSC的自我更新，承诺和分化是至关重要的。往前哺乳动物系统操纵的方法需要耗费时间和昂 ​​贵的基因工程的努力在整个动物的第2级。因此，绝大多数研究探讨NSC分子在体外或在无脊椎动物中的功能。

在这里，我们展示了技术操作简单，快速的新生儿的NPC，被称为新生儿脑室下区（SVZ）电。十年前制定类似的技术来研究胚胎神经干细胞，并资助研究cortical开发3,4。最近研究产后的啮齿动物前脑5-7。这种技术的结果SVZ神经干细胞在强大的标签和他们的后代。因此，产后SVZ电哺乳动物国科会基因工程提供了成本和时间效益的替代方案。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本程序是在按照与耶鲁IACUC要求。科学家应确保IACUC准则的批准，随后根据其机构的要求。

1。第1节。制备DNA，解决方案和玻璃吸管

  1. 生成高纯度（OD 260/280> 1.80），高浓度（微克/微升> 2.5）内毒素的DNA。
  2. 准备0.9％的生理盐水溶液和无菌过滤器，通过一个22微米的过滤器。
  3. 将10厘米火抛光的高硼硅玻璃毛细管（OD:1.5毫米，1.10毫米）到一个模型中PP-830成茂PC-10玻璃吸管车夫与康泰尔线。设置拉马一步加权拉在70.5°C。打破圆形钳的提示和检查锯齿状刀刃在解剖显微镜下。锥技巧和在紫外线灯下为15分钟。被拉移液器应标记的前端边缘在2毫米。
  4. 准备0.1％重量/体积快速绿色的解决方案无菌过滤通过混合0.9％的生理盐水溶液用干燥的快绿。

2。第2节。动物制备，玻璃吸管装载和质粒注射液

  1. 0-1幼崽分别从笼子里取出出生后，到玻璃培养皿预冷至4°C，然后湿冰的地方。
  2. 大约5分钟后，确定麻醉状态的，利用脚捏响应。如果没有运动时，幼崽脑室注射。
  3. 重要的是要注意，快速绿色，DNA，和盐溶液的组合可以导致的玻璃移液管的迅速蒸发，结晶，和封锁。因此，生成的储备液和等分试样1-2微升到石蜡紧接之前注射。
  4. 拉玻璃吸管吸出整个等份量。
  5. 保持你少惯用手的拇指和食指之间的小狗的头。
  6. 灯的开启D保持头部的小狗，外面的光线。如果需要，用盐水头，以减少反射的光的量由小狗。心室现在应该亮起。
  7. 你的惯用手，将针插入侧脑室最接近（ 图1A和1B）。注射的部位应是约从人字缝和眼睛和2毫米矢状缝外侧等距。拉移液管插入到2毫米大关的一个P0小狗，应保证焊透入侧脑室。巧合的是，你可能会看到回填土的CSF释放颅内压到吸管。为了降低颅内压，这有助于在注射质粒，放松你的抓地力头的pup.Step 2.8。约0.5μL的质粒注入侧脑室，使用高压空气喷射器（Picospritzer，帕克）。

3。第3节。电穿孔和恢复

  1. 硒t为5平方脉冲，50毫秒/脉冲在100伏，950毫秒的间隔电压电穿孔发生器。质粒电穿孔的空间特异性取决于由电荷转移的方向性。应给予密切关注的位置沿SVZ 8的干细胞群的异质性。已被确定为腹，背和头端尾部的位置9,10增殖和细胞的命运率的差异。
  2. 一旦该质粒被注入到PBS，浸涂镊子电极。这一步是为了最大限度地提高电荷转移和防止烧伤引起的电阻率。
  3. 放置的正电极上的背侧壁小狗质粒注射的部位（ 图1C和1D）同侧靠近耳朵。将负极放在对侧半球腹外侧的小狗的鼻子。
  4. 按启动电流传输脉冲脚灯巫婆脚踏板和扫背的电极，横向〜25°角的时间间隔。
  5. 广场电穿孔的幼崽到5分钟的加热垫。轻轻转动幼崽，每30秒有轻度刺激。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新生儿脑室下区电在几乎所有的放射状胶质连续的背，背外侧和侧脑室下区继"清扫"运动的镊子电极（ 图1E）的标签。然而，电可定制的要求，在各自的实验，但不扫电极，并使用特定的位置和方向，详细的视频。例如，由于背侧局部放射状胶质不同于那些衬心室的横向部分，一个可以选择只有一个单一的区域9,10 electroporate。更多特殊性的也可以使用较小的电极。

前三个星期内，11质粒DNA被迅速稀释。因此，确定采用质粒DNA的基因组修饰的细胞不被推荐。为了绕过这个限制，Cre重组酶表达载体introduced随着GFP到小鼠体内，其中有一个停止序列两侧的熏鲑鱼P位点上游的一个基因组表达荧光蛋白（tdTomato）的12。重组后，停止序列被删除，荧光蛋白的表达（ 图1F）。由四星期后电为数不多的GFP表达质粒的细胞室管膜下区，而被视为多tdTomato阳性细胞。当切片嗅球同样显而易见的是在tdTomato表达细胞相比，少得多的表达GFP的细胞是本，但是都获得成熟...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们详细新生儿SVZ电的技术，这种技术能够迅速和有力的标记和操作SVZ干细胞和它们的后代。有几个优点，在与其它技术相比，电穿孔具有。首先，考虑的重点标记的细胞，一个是能分辨细胞自主和非细胞自主的影响。其次，使用诱导系统的遗传操作，允许一个用来比较的效果之前或之后突触融合。此外，人们可以绕过使用多个质粒与含有loxP位点的质粒通过电穿孔CRE表达小鼠。第四，报告基因的质粒可用于研究转录的转录。转录活性，在这种情况下，可以仅在被操纵的细胞测量，加入特异性分区域被显微切割时，可被引入。第五，在短暂的标签过境扩增细胞继续扩散和稀释Øf"birthdating"标记胸苷类似物11的类似的方法可被用作质粒。第六，尽管细胞的瞬态标签可以被看作是一个缺点，该技术应是适合于转座的转座子对诱导基因组整合13。另外，持续的神经再生，可改变Cre重组酶诱导小鼠的基因组修饰基因两侧的loxP位点7,11。使用此协议，新生神经元被确定了四个Rosa26R一站式tdTomato的小鼠中，停止盒两侧loxP位点12个月后，电穿孔。两者合计，新生儿的的SVZ电是一个具有成本效...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作是由国防部（理念发展奖，W81XWH-10-1-0041，AB），CT干细胞补助金（AB），和国立健康NRSA 10668225（DMF）的补助金。本发明的材料的基础工作部分由康涅狄格州的支持下，康涅狄格干细胞研究资助计划。它的内容是完全的责任作者的观点，并不一定代表国家的康涅狄格州，康涅狄格州或CT创新公共健康部的官方意见，公司的资助者不参与研究设计，数据收集分析，决定，公布，或准备的稿子。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
的试剂的名称 公司 目录编号 评论（可选）
重抛光的高硼硅管萨特仪器 BF150-110-10
双级玻璃微普勒成重 PC-10H
固绿菲舍尔科学 0521192205
ECM 830方波脉冲发生器哈佛设备 45-0052
Tweezertrodes 哈佛设备 45-0488
光纤光源 Fisher Scientific则 12-562-36
卤钨灯灯 USHIO美国公司 1002247
Picospritzer II 帕克工具 052-0312-900

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883(2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517(2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13(2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380(2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

DNA

相关文章