我们展示了一种被称为新生鼠侧脑室下区电穿孔的微创技术。该技术包括将质粒DNA注射到新生幼鼠的侧脑室内，并施加电流以递送并遗传操控神经干细胞
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本文内容
摘要
摘要
神经干细胞（NSCs）排列于出生后侧脑室壁，可分化为多种细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和室管膜细胞1理解负责神经干细胞自我更新、定型与分化的分子通路，对于发挥其修复大脑的独特潜力以及更深入地认识中枢神经系统疾病至关重要。以往对哺乳动物系统的操控方法需要在整体动物水平上进行耗时且昂贵的基因工程操作2因此，绝大多数研究都探讨了NSC分子的功能 体外 或在无脊椎动物中。
本文展示了操作新生神经前体细胞（NPCs）的一种简单快速的技术，称为新生期侧脑室下区（SVZ）电穿孔。类似的技術在十年前已開發，用於研究胚胎期神经干细胞（NSCs），並促進了皮層發育相關研究3,4。近年來，該技術被應用於研究出生後嚙齒類前腦5-7。此技術可實現對SVZ神經幹細胞及其子代細胞的高效標記。因此，出生後SVZ電穿孔為哺乳動物神經幹細胞的基因工程提供了成本低、耗時短的有效替代方案。
方案
该操作程序符合耶鲁大学动物护理与使用委员会（IACUC）的要求。科研人员应确保根据所在机构的规定，获得并遵循IACUC指南的批准。
1. 第1节 DNA、溶液和玻璃移液管的制备
- 制备高纯度（OD 260/280 > 1.80）、高浓度（μg/μl > 2.5）且无内毒素的DNA。
- 配制0.9%生理盐水溶液，并通过22 μm滤膜进行无菌过滤。
- 将10 cm长的火焰抛光硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm）放入Narishige PP-830型PC-10玻璃微电极拉制仪中，使用kanthal金属丝。设置拉制仪在70.5 °C条件下进行单步加权拉制。用圆头镊子折断尖端，并在解剖显微镜下检查是否有毛刺边缘。对尖端进行斜面打磨，并置于紫外灯下照射15分钟。拉制后的移液管应在距尖端边缘2 mm处做标记。
- 通过将无菌过滤的0.9%生理盐水溶液与干燥的快绿粉末混合，配制0.1%（质量/体积）的快绿溶液。
2. 第2节 动物准备、玻璃微电极填充与质粒注射
- 将出生后第0-1天的幼鼠从鼠笼中单独取出，置于预先冷却至4 °C的玻璃培养皿上，然后放置于湿冰上。
- 约5分钟后，通过足部夹捏反应判断麻醉状态。若无肢体活动，则对幼鼠进行脑室内注射。
- 需注意，快绿染料、DN....
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结果
新生小鼠侧脑室下区电穿孔可导致毗邻背侧、背外侧和外侧侧脑室下区的几乎所有放射状胶质细胞被标记，此过程需使用镊形电极进行“扫掠”移动（图1E）。然而，电穿孔操作可根据具体实验需求进行调整，例如不进行电极扫掠动作，并按照视频中详述的特定位置和方向进行电极放置。例如，由于位于背侧的放射状胶质细胞与衬于脑室侧壁的放射状胶质细胞存在差异，研究者可选择仅对单一区域进行电穿孔9,10。此外，使用更小的电极还可进一步提高靶向特异性。
质粒DNA在最初的三周内会迅速被稀释11。因此，不建议使用质粒DNA来鉴定基因组修饰的细胞。为了克服这一局限性，可将表达CRE重组酶的质粒与GFP一同导入小鼠体内，这些小鼠在基因组表达的荧光蛋白（tdTomato）上游含有一段被lox P位点包围的终止序列12。发生重组后，终止序列被移除，荧光蛋白得以表达（图1F）。电穿孔四星期后，脑室下区中表达GFP质粒的细胞已很少见，而表达tdTomato的细胞则明显更多。对嗅球进行切片观察也显示，.......
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讨论
本文详细介绍了新生小鼠侧脑室下区（SVZ）电穿孔技术，该技术可用于快速、高效地标记并操控SVZ干细胞及其子代细胞。与其他方法相比，电穿孔具有多项优势。第一，由于细胞标记具有局灶性，因此能够区分细胞自主性与非细胞自主性效应。第二，利用可诱导系统进行遗传操作，可比较突触整合前或整合后的影响。此外，可通过向表达CRE的转基因小鼠电穿孔含有loxP位点的质粒，从而避免使用多种质粒。第四，可使用基因报告质粒研究转录激活作用；此时，仅在被操作的细胞中测量转录活性，若结合显微解剖特定亚区，还可进一步提高特异性。第五，由于持续增殖和质粒稀释，迁移放大细胞（transit amplifying cells）呈现短暂标记，该特性可作为类似胸苷类似物标记的“出生日期”（birthdating）方法11。第六，尽管细胞的短暂标记可能被视为缺点，但该技术可通过转座酶-转座子系统实现基因组整合，从而克服此局限13。此外，也可利用CRE重组酶改变持续的神经发生过程，对loxP位点侧翼包围等位基因的小鼠实现基因组修饰7,11。采用本方案，在Rosa26R-Stop-tdTomato小鼠中，可在电穿孔后长.......
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披露
作者无任何披露事项。
致谢
本研究工作得到了美国国防部（创意发展奖，W81XWH-10-1-0041，A.B.）、康涅狄格州干细胞研究基金（A.B.）以及美国国立卫生研究院NRSA 10668225（D.M.F）的资助。当前内容部分基于康涅狄格州干细胞研究资助计划下康涅狄格州政府支持的研究工作。其内容完全由作者负责，不代表康涅狄格州、康涅狄格州公共卫生部或CT Innovations公司官方观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 重抛光硼硅酸盐玻璃管 | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| 双级玻璃微电极拉制仪 | Narishige | PC-10H | |
| 快绿染料 | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 方波脉冲发生器 | 哈佛仪器公司 | 45-0052 | |
| 镊状电极（Tweezertrodes） | 哈佛仪器公司 | 45-0488 | |
| 光纤光源 | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| 钨卤素灯 | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II 微量压力注射仪 | Parker Instruments | 052-0312-900 |
参考文献
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in....
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重印与许可
