从培养细胞中制备染色体

摘要

染色体可从活细胞（如淋巴细胞或皮肤成纤维细胞）以及包括人类和小鼠在内的生物体中分离。这些染色体标本可进一步用于常规G显带及分子细胞遗传学实验，例如荧光原位杂交 原位 荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）和光谱核型分析（SKY）

摘要

染色体（细胞遗传学）分析广泛用于检测染色体不稳定性。在进行G显带及荧光原位杂交等分子技术后 原位 杂交（FISH），该检测具有强大的能力，可对单个细胞进行分析，以检测涉及基因组部分区域获得或丢失的异常 以及涉及一条或多条染色体的重排。在人类中，染色体异常的发生率约为每160例活产婴儿中有1例^1,2，60-80% 的所有流产^3,4，10% 的死产^2,5，13% 的先天性心脏病患者⁶，3-6%的不孕症病例²，以及许多发育迟缓的患者中 和出生缺陷⁷恶性肿瘤的细胞遗传学分析在研究人员和临床医生中常规使用，因为克隆性染色体异常的观察已被证实具有诊断和预后意义。^8,9.  染色体分离对于包括非人灵长类动物和啮齿类动物在内的生物体的基因治疗和干细胞研究具有重要价值^10-13.

染色体可从活体组织的细胞中分离获得，包括血液淋巴细胞、皮肤成纤维细胞、羊水细胞、胎盘、骨髓以及肿瘤标本。染色体在有丝分裂的中期阶段进行分析，此时染色体最为凝缩，因而更清晰可见。染色体分离技术的第一步是通过秋水仙胺（Colcemid）孵育，破坏纺锤纤维，以阻止细胞进入后续的后期阶段。随后，细胞经低渗溶液处理，并用卡诺氏固定液（Carnoy's fixative）固定，以保持其肿胀状态。然后将细胞滴加到载玻片上，可用于多种实验操作。G显带技术包括胰蛋白酶处理，随后用吉姆萨染料染色，从而形成特征性的明暗相间的带型。相同的染色体分离方法也可用于制备适用于荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）、比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）和光谱核型分析（spectral karyotyping, SKY）^14,15的细胞样本。

引言

染色体分析是一种在全球范围内广泛使用的传统技术，用于诊断由染色体不稳定性和重排所导致的遗传性疾病和恶性肿瘤^1,2,8,9此外，通过结合经典细胞遗传学技术与分子细胞遗传学方法（如荧光原位杂交），可提高对先天性及肿瘤获得性遗传异常诊断与研究的分辨率。 原位 荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）和光谱核型分析（SKY）^14,15近年来，这些技术已被用于评估干细胞研究中相关的染色体不稳定性。多个实验室已报道，在长期培养的胚胎干细胞（ES）以及来自不同生物体的成体干细胞中存在非整倍体等核型异常。近期证据表明，某些细胞系本身即倾向于发生染色体不稳定性，无论其培养条件如何。因此，在建立和/或维持人、小鼠或恒河猴干细胞系时，建议将染色体分析作为质量控制过程的一部分。大量研究报告指出，人们日益关注利用常规细胞遗传学和分子细胞遗传学技术来监测培养条件下干细胞、恶性细胞或不同生物体细胞的染色体稳定性。^10-13这些方案正越来越多地被非遗传学实验室用于对其培养的细胞进行快速染色体评估¹³我们介绍了从多种细胞类型制备染色体的基本操作流程，该方法适用于临床与科研目的，并可用于来源于不同生物体的细胞。

方案

1. 贴壁细胞的染色体收获

1. 标准方案
   1. 根据特定的细胞培养条件培养细胞。当细胞进入对数生长期（80%汇合度）时，向细胞培养瓶中加入10 μl/ml秋水仙胺。建议细胞数量不少于2 × 10⁶个。
   2. 将细胞在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育45分钟。使用无菌移液管将培养基转移至15 ml锥形管中，暂存备用。
   3. 向培养瓶中加入2 ml HBSS缓冲液，轻轻洗涤细胞。晃动缓冲液后用移液管吸除，弃去。
   4. 加入1 ml胰蛋白酶，确保其覆盖整个培养瓶表面。胰蛋白酶处理时间仅需约2分钟。待大部分细胞脱落时，将之前收集在锥形管中的培养基重新加回细胞中。
   5. 将细胞悬液以10 ml等分量转移至15 ml锥形管中。在200 × g下离心10分钟。弃去上清液，重悬细胞沉淀。
   6. 向锥形管中剩余的细胞沉淀加入10 ml已预热至37 °C的0.075 M KCl溶液。以中等速度涡旋振荡管子，使KCl与细胞充分混匀。
   7. 在37 °C孵育10分钟。在25 °C、200 × g下离心5分钟。弃去上清液（保留约0.5 ml），重悬细胞沉淀。
   8. 在涡旋振荡的同时，小心加入5 ml新鲜的卡诺固定液（甲醇:冰醋酸 = 3:1）。随后在不涡旋的情况下再加入5 ml固定液，最终总体积为10 ml。
   9. 在200 × g下离心5分钟。弃去上清液，重悬细胞。向每管中加入5 ml固定液。
   10. 在200 × g下离心5分钟。弃去上清液，重悬细胞。向每管中加入5 ml固定液。细胞现在可在4 °C保存长达一年。
2. 方案修改：淋巴母细胞系的染色体收获
   1. 根据特定的细胞培养条件培养细胞。（根据培养细胞量选择合适的培养瓶）。当细胞进入对数生长期（细胞传代后约2天），向细胞培养瓶中加入10 μl/ml秋水仙胺。
3. 方案修改：全血来源的染色体收获
   植物血凝素（PHA）是一种来源于红芸豆的凝集素，是人类T细胞的强效有丝分裂原¹⁶。在培养物中加入PHA后72小时，约45%的细胞处于S期，此时有丝分裂活性达到高峰，是进行染色体研究的最佳收获时机。分析B细胞时可使用其他有丝分裂原，如商陆有丝分裂原（1–10 μg/ml）^17,18。
   1. 采集至少1 ml全血至绿色头盖的肝素钠抗凝管中。采血后3天内使用。使用前将血液在室温下保存。
   2. 将0.25 ml全血加入含L-谷氨酰胺的10 ml完全RPMI培养基中（含20%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1%fungizone和1%PHA）。在37 °C、5% CO₂条件下培养。
4. 方案修改：骨髓来源的染色体收获
   骨髓细胞的细胞遗传学分析在多种恶性血液系统疾病中具有重要价值，因为发现染色体异常克隆可能对特定类型的白血病具有诊断意义。染色体研究还可用于评估疾病进展（如原始细胞危象的发生）以及治疗反应。由于骨髓细胞本身处于活跃分裂状态，无需添加有丝分裂原刺激^9,19。对于急性白血病，通常同时设立24小时和48小时培养体系。
   1. 采集至少1 ml骨髓至绿色头盖的肝素钠抗凝管中。将0.25 ml骨髓加入含L-谷氨酰胺的10 ml完全RPMI培养基中（含20%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1%fungizone）。在37 °C、5% CO₂条件下培养。

2. 载玻片制备与固相染色

快速评估一张代表性玻片即可在进行G显带、FISH、CGH或SKY等后续操作前，提供有关收获物质量的信息。一些实验室倾向于对细胞进行全染色，以实现快速收获和染色体评估。 Alternatively，也可使用相差显微镜进行此项分析。玻片制备的最佳条件为湿度约50%，室温（20–25 °C）。

1. 在 25 °C 条件下，以 200 × g 离心细胞 5 分钟。弃去上清液，仅保留 0.3–0.5 ml。
2. 轻轻重悬细胞沉淀后，从距离载玻片约 2 英寸的高度，将三滴细胞悬液滴加至倾斜约 45° 的载玻片上，使悬液沿玻片自然流下。向载玻片上添加一大滴新鲜的 Carnoy 固定液。
3. 用纸巾擦干载玻片背面，然后静置晾干至少 10 分钟，确保载玻片完全干燥。
4. 配制新鲜的吉姆萨染色液（Gurr 缓冲液与吉姆萨染液按 3:1 比例混合）。将载玻片置于染色架上，完全浸没于吉姆萨染色液中，染色 5 分钟。用蒸馏水冲洗载玻片，沥干后自然晾干。
5. 在载玻片上滴加 4 滴 Permount 封片剂，并加盖盖玻片，确保盖玻片下无气泡。可用纸巾吸除多余的 Permount。
6. 使用光学显微镜在 10X 和 100X 放大倍数下观察细胞。若中期细胞丰富且分散良好，其余载玻片可用于其他实验操作。

3. 使用胰蛋白酶和吉姆萨染色进行G显带（GTG）

胰蛋白酶是一种蛋白水解酶，可使转录活性较高的DNA区域中的常染色质组蛋白变性。经吉姆萨染色后，这些区域呈现为浅色带。转录活性较低或无转录活性的高度浓缩染色质（异染色质）其大部分组蛋白不受胰蛋白酶作用，因此在吉姆萨染色后呈现深色。必须首先对一张玻片进行G显带，以监测实验条件，并根据需要调整后续玻片的胰蛋白酶处理时间。

1. 向4个Coplin瓶中分别加入以下溶液。
   第1瓶 = 30 ml 1x HBSS 和 4 ml 10x胰蛋白酶（0.5%）
   第2瓶 = 50 ml 1x HBSS
   第3瓶 = 45 ml 1x HBSS 和 5 ml 胎牛血清
   第4瓶 = 50 ml 1x HBSS
2. 将每张载玻片浸入第1瓶中5秒，迅速在第2瓶中漂洗，然后将每张载玻片置于第3瓶中至少30秒，再迅速在第4瓶中漂洗，随后让载玻片自然干燥。
3. 配制新鲜的吉姆萨染色液（Gurr缓冲液与吉姆萨染液按3:1比例混合）。将载玻片放置于染色架上，用吉姆萨染色液完全覆盖每张载玻片，染色5分钟。
4. 按照染色时的相同顺序，用蒸馏水漂洗载玻片。静置干燥约10分钟，确保载玻片完全干燥。
5. 在载玻片上滴加4滴Permount封片剂，并加盖盖玻片。确保盖玻片下无气泡。可用纸巾擦去多余的Permount封片剂。
6. 使用光学显微镜在10X和100X放大倍数下观察细胞。根据第一张载玻片的染色结果，调整其余载玻片的胰蛋白酶处理时间。

结果

高质量的中期分裂相对于染色体分析至关重要。成功的实验应获得染色体分散良好且形态适宜的细胞。经过适当G显带处理的染色体应呈现出特征性的明暗相间的带型模式。

图 1. 一次成功的染色体铺展，其中染色体长度适中、分散良好、彼此易于区分，并具有明显的明暗带型对比。 良好的染色体形态有助于识别单条染色体，并评估是否存在提示染色体不稳定的重排现象。

讨论

我们已采用本实验流程从多种生物体的细胞中分离染色体，包括来源于人类、恒河猴、大鼠和小鼠的各种细胞类型^11,20-22。本文提供了标准操作方案，但针对这些不同类型的细胞，某些关键步骤和变量可能需要进行调整。在染色体制备和G显带过程中，有几个具体步骤对于确保结果的最佳质量至关重要。其中一个可能影响实验结果的变量是秋水仙胺（Colcemid）的孵育时间。秋水仙胺处理时间不足会导致中期分裂相较少，染色体较长且相互重叠；而孵育时间过长则会使染色体变短变粗，难以进行分析。另一个重要变量是低渗溶液的摩尔浓度。0.075 M的氯化钾溶液可使细胞适度膨胀，从而获得良好的染色体铺展效果，同时避免细胞裂解。在加入卡诺固定液（Carnoy's Fixative）时，必须在混匀的同时将前5 ml 缓慢加入细胞沉淀中。这一步可确保在储存样品或制片前彻底去除多余的蛋白质。如果细胞混匀不充分，则会在沉淀物表面形成黄色的蛋白质层，这可能在后续操作中引起问题。

正确的玻片制备至关重要。在将重悬的细胞沉淀滴加到玻片上时，应确保玻片倾斜约45°角，并且滴管与玻片之间保持足够的距离（至少2英...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS缓冲液	Gibco	24020-117
0.5%胰蛋白酶EDTA 10倍浓缩液	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
缓冲片剂 "GURR"	Gibco	10580-013
吉姆萨染液	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrifuge 5810	Eppendorf
甲醇	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
冰醋酸	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05