代谢记忆是指即使通过药物实现正常血糖后，糖尿病并发症仍持续进展的现象。本文描述了一种独特的糖尿病斑马鱼模型，可用于研究代谢记忆中可通过有丝分裂遗传的表观遗传组分 体内.
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摘要
摘要
糖尿病目前影响着3.46亿人，预计到2030年这一数字将上升至4亿。来自实验室研究和大规模临床试验的证据表明，即使通过药物手段实现了血糖控制，糖尿病并发症仍会通过“代谢记忆”现象持续进展。基因表达可通过表观遗传改变而稳定变化，这种变化不仅使细胞和生物体能够快速响应不断变化的环境刺激，还赋予细胞在刺激消除后“记忆”这些经历的能力。因此，这些机制在代谢记忆现象中所起的作用目前正受到广泛研究。
我们最近报道了一种Ⅰ型糖尿病斑马鱼模型的建立，并对该模型进行了表征，结果显示糖尿病斑马鱼不仅表现出已知的继发性并发症，包括与糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病以及伤口愈合受损相关的病理变化，同时还表现出尾鳍再生能力受损。该模型的独特之处在于，斑马鱼能够再生受损的胰腺，并恢复至接近正常的血糖状态，类似于人类患者在胰腺移植后所预期的恢复情况。此外，通过多次尾鳍截断实验，可实现对纯粹表观遗传效应的分离与研究 体内 在排除先前糖尿病状态可能带来的复杂因素的情况下，尽管在胰腺再生后血糖恢复正常，但糖尿病继发的鳍再生障碍和皮肤伤口愈合缺陷仍会无限期持续。在鳍再生受损的情况下，即使在子代鳍组织中经历多轮再生，该病理特征仍然持续存在。这些现象提示，在代谢记忆状态下存在一种潜在的表观遗传机制。本文介绍了成功建立鱼类糖尿病模型及代谢记忆模型所需的方法，并讨论了该模型的优势。
引言
糖尿病（DM）是一种严重且日益严重的健康问题，可因疾病特异性的微血管（视网膜病变、肾病、神经病变、伤口愈合受损）和大血管（心脏病和中风）并发症而导致预期寿命缩短。 1一旦发生，即使血糖得到控制，糖尿病并发症仍会持续进展 2,3 这一现象被称为代谢记忆或遗留效应。在20世纪90年代初期，随着“糖尿病控制与并发症试验（Diabetes Control and Complications Trial, DCCT）”的推进，该现象在临床上被确认，并在此后得到多项其他临床试验的支持。 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14动物模型在糖尿病并发症及代谢记忆相关病理生理学研究中发挥了关键作用。事实上，糖尿病并发症的持续性最早是在犬类糖尿病视网膜病变模型中被记录，此后通过多种实验模型的大量证据进一步证实了这一现象 体外 培养系统与动物模型 15,16,17,18,19,20,21这些研究表明，初期的高血糖阶段会导致靶器官/细胞出现永久性异常（包括基因表达异常），并从机制上提示表观基因组的参与。
表观基因组包含特定细胞类型的所有染色质修饰，决定了细胞独特的基因表达谱。染色体修饰在发育过程中具有动态性，支持细胞分化，响应外界刺激，可通过有丝分裂稳定遗传22,23，并在疾病状态下发生改变24,25,26。这些表观遗传机制包括：组蛋白的翻....
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方案
所有操作均遵循《实验动物护理原则》（美国国立卫生研究院出版物编号85-23，1985年修订版）以及罗莎琳德·富兰克林大学动物护理与使用委员会批准的动物实验方案08-19进行。
本手稿中使用了两个重要缩写：1）DM：指处于急性（300 mg/dl）高血糖状态且持续至少3周的鱼类。2）MM：指曾为21天（见实验方案）DM状态的鱼类，通过胰腺再生恢复血糖控制。在停药后（14）天内即可实现血糖恢复。此后，这些鱼类即被视为MM鱼类。还需注意，文中所称的对照组鱼类在注射次数（仅注射生理盐水）、不同温度下的孵育时间以及尾鳍截断的次数和时间安排上，均与DM或MM鱼类的处理方式完全相同。
1. 糖尿病斑马鱼模型的建立，DM 鱼
- 准备恢复用水和麻醉用水两个水箱。恢复用水为正常的鱼水。麻醉用水需加入足够的2-苯氧基乙醇，使其在正常鱼水中达到1:1,000的稀释比例。
- 在通风橱内配制0.3%的链脲佐菌素（STZ）溶液：将6 mg STZ加入2 ml 0.09%氯化钠溶液中，并立即置于冰上。该溶液可供约20条鱼在20分钟内完成注射。若超过20分钟，请停止使用并重新配制新鲜的STZ溶液。另取一管分装足量生理盐水用于对照组鱼类。STZ溶解后，后续操作无需在通风橱内进行。
- 用带有27½号针头的½ cc注射器吸取STZ或对照溶液，确保无气泡残留。
- 将每条鱼单独放入麻醉用水....
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结果
I型糖尿病斑马鱼不仅表现出已知的视网膜病变和肾病等继发性并发症，还存在另一种并发症：尾鳍再生能力受损。这种并发症在经历高血糖期后恢复了正常血糖控制的斑马鱼中，由于代谢记忆的存在而持续存在。图2A（对照组）和图2B（代谢记忆组）展示了截肢后72小时再生尾鳍的代表性图像。该缺陷可被量化，如图2C所示，与对照组斑马鱼相比，糖尿病（DM）和代谢记忆（MM）斑马鱼在72小时时再生缺陷约为40%。尽管图2C中的数据截止至90天，但类似的再生缺陷在长达150天时仍可观察到。
| 天数 | 操作步骤 |
| 1 | 糖尿病模型组 = STZ 注射 (350 mg/dl)，对照组 = 生理盐水注射 |
| 3 | 糖....... |
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讨论
糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，最初以高血糖为诊断依据，最终会导致血管损伤，引发多种并发症，即使通过药物干预恢复了正常血糖水平，这些并发症仍会持续存在。这种并发症的持续现象被称为代谢记忆，近年来多项研究探讨了表观遗传机制在其中所起的作用。本文详细介绍了一种可用于建立急性糖尿病斑马鱼模型以及代谢记忆（恢复血糖控制）斑马鱼模型的实验方案。我们进一步描述了可用来区分表观遗传因素与先前糖尿病状态中潜在干扰成分影响的研究方法。需要强调的是，研究人员可在任意时间点使用任何感兴趣的检测方法对斑马鱼进行分析，因此该模型在后续发现性研究中的应用前景极为广泛。
本方案中有若干步骤需要进一步讨论和强调。根据我们的经验，0.3% STZ 溶液在配制后约20分钟内会降解并失去活性。因此，我们建议使用计时器，并每隔20分钟重新配制新鲜溶液。在我们最初尝试建立糖尿病斑马鱼模型时，仅在第一周进行一次注射，成功率约为40%。因此，三次注射并非严格必需，但若进行三次注射，成功率可超过95%。其次，在向斑马鱼注射STZ时，必须确保针头刺入时针尖斜面完全进入鱼体内，以保证溶液正确释放；但需注意避免刺入过深，以防造成内部损伤.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作得到了Iacocca家族基金会的研究资助、Rosalind Franklin大学的启动资金以及美国国立卫生研究院资助DK092721（授予R.V.I.）的支持。作者谨此感谢Nikki Intine在稿件准备过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 链脲佐菌素 | Sigma Aldrich | S0130 | |
| 2-苯氧乙醇 | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 手术刀（10号） | Fisher Scientific | 089275A | |
| 培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| ½ cc 注射器，带 27½ 号针头 | Fisher Scientific | 305620 | |
| QuantiChrome 葡萄糖检测试剂盒 | Bioassay Systems | DIGL-100 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S3014 | |
| 解剖显微镜 | Nikon | TMZ-1500 | 任何型号的解剖显微镜均可。 |
| 成像用相机 | Nikon | Q imaging | 任何相机均可使用。 |
| Image J 软件 | 美国国立卫生研究院 | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | 任何成像软件均可使用。 |
参考文献
- Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
- Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia
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