人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca2+瞬变和膜电流

摘要

我们描述了一种可用于结合细胞内Ca²⁺浓度测量与电生理膜片钳研究的人类心房肌细胞的分离方法。

摘要

利用膜片钳技术研究心肌离子通道的电生理特性以及探索心肌细胞内 Ca²⁺ 调控异常，需要分离的心肌细胞。此外，利用这些技术对患者来源的心肌细胞进行研究，是阐明心房颤动（AF）等心脏疾病分子基础不可或缺的前提条件¹。本文描述了一种适用于膜片钳研究及同时测量细胞内 Ca²⁺ 浓度的人心房肌细胞分离方法。首先，将接受开胸心脏手术患者所获取的右心耳组织切成小块（“组织块法”），并在无 Ca²⁺ 溶液中洗涤。随后，将组织块在含有胶原酶和蛋白酶并添加 20 μM Ca²⁺ 的溶液中进行消化。之后，通过过滤和离心组织悬液收集分离的心肌细胞。最后，逐步将细胞保存液中的 Ca²⁺ 浓度调整至 0.2 mM。我们简要讨论了分离过程中 Ca²⁺ 及 Ca²⁺ 缓冲体系的作用，并提供了在这些分离的心肌细胞中记录的动作电位和膜电流的代表性结果，以及同步进行的 Ca²⁺ 瞬变测量数据。

引言

利用膜片钳技术研究心脏离子通道的电生理特性以及细胞内钙离子（Ca2+）处理异常，需要分离的心肌细胞。此外，能够利用这些技术研究来自患者的细胞，对于阐明心房颤动（AF）等心脏疾病的分子基础具有不可估量的价值1。本文描述了一种适用于膜片钳实验及同时检测细胞内Ca2+浓度的人心房肌细胞分离方法。首先，将接受开胸心脏手术患者获取的右心耳组织切成小块（“组织块法”），并用无钙溶液洗涤。随后，将组织块在含有20 μM Ca2+的胶原酶和蛋白酶溶液中进行消化。之后，通过过滤和离心收集分离的肌细胞。最后，逐步将细胞保存液中的Ca2+浓度调整至0.2 mM。我们简要讨论了分离过程中Ca2+及其缓冲体系的作用，并提供了在此类分离细胞中记录的动作电位和膜电流的代表性结果，以及与钙瞬变同步检测的数据。²⁺ 处理异常需要分离的心肌细胞。这些细胞通常通过以下方法获得 体外 将心脏组织样本暴露于消化酶（胶原酶、透明质酸酶、肽酶等）中。自1955年首次报道分离出有活性的心肌细胞以来² 已开发出大量用于从不同物种（包括小鼠、大鼠、兔、狗、豚鼠和人）获取单个心房和心室心肌细胞的实验方案。本综述重点介绍人的心房心肌细胞的分离方法。关于其他物种心肌细胞分离的操作步骤，可参考美国Worthington Biochemical Corp.提供的《Worthington组织解离指南》。www.tissuedissociation.com).

人类心房肌细胞的分离方案通常源自 Bustamante 等人et al.³ 所描述的方法。本文提供了一种技术的逐步操作说明，该技术改编自先前发表的方法，旨在获得不仅适用于膜片钳实验，同时也适用于同步细胞内 Ca²⁺ 浓度测量的心房肌细胞。^4-11

方案

实验方案需经当地伦理委员会批准，所有患者均需签署书面知情同意书。本研究已获得海德堡大学曼海姆医学院伦理委员会的批准（编号：#2011-216N-MA），并严格遵守所有机构、国家及国际关于人类受试者福利的指导原则。所有患者均签署了书面知情同意书。

0. 获取人心房组织

在进行体外循环冠状动脉旁路移植术的开胸心脏手术患者中，常规插管操作时通常会切除右心耳尖端，该组织可用于心房心肌细胞的分离。切除后，立即将组织样本转移至含有无钙²⁺转运液的50 ml Falcon管中，转运液内含2,3-丁二酮单肟（表 I；BDM，收缩抑制剂，可防止心肌细胞挛缩）。在转运时间为30至45分钟的情况下，我们未发现冷却或氧合处理在分离心房心肌细胞的数量和质量方面具有明显优势。一般而言，应尽快将样本运送至实验室。然而，若无法避免较长的转运时间，则建议在4 °C条件下使用充氧溶液进行转运，可能更为有利。

1. 准备工作

1. 打开控温循环仪，该仪器用于控制夹套烧杯的温度（表 II）。确保烧杯内的温度达到 37 °C。在整个分离过程中，用玻璃盖盖住烧杯，以维持烧杯内温度恒定。
2. 将胶原酶 I 和蛋白酶 XXIV 分别称量后放入三个玻璃烧杯中，并在室温下保存。这些酶将在使用前立即稀释。
3. 将 20 ml 无 Ca²⁺ 溶液置于培养皿中，并在 4 °C 下保存。
4. 将 250 ml 无 Ca²⁺ 溶液置于 37 °C 水浴中保存。

2. 组织清洗

1. 将组织样本连同转运溶液一同转移至培养皿（约10 cm直径）中，使用剪刀粗略去除脂肪组织。
2. 称取组织样本质量，用于细胞分离的组织量为200至600 mg。剩余组织可置于液氮中冷冻，以备后续生化分析使用。
3. 将组织样本转移至含有20 ml无Ca²⁺溶液（见步骤1.3）的培养皿中，于4 °C下将组织切成约1 mm³大小的小块。
4. 以下步骤应在37 °C并持续通入100% O₂的条件下进行。可将移液枪头连接至氧气管末端，以避免剧烈冒泡，实现平稳持续的气流。
5. 将组织小块连同无Ca²⁺溶液转移至夹套烧杯中，用磁力搅拌子轻轻搅拌约3分钟。
6. 停止搅拌，静置数秒使组织小块沉降。小心地将上清液通过尼龙滤网（200 μm，表 II）过滤。用镊子将滤网上截留的组织小块重新放回烧杯中。
7. 向烧杯中补充无Ca²⁺溶液，并重复步骤2.4和2.5的清洗操作两次。

3. 第一次酶解消化

1. 用含有胶原酶和蛋白酶的 20 ml 酶解液 E1（表 I）重悬组织块，并轻轻搅拌 10 分钟。
2. 加入 40 μl 的 10 mM CaCl₂ 溶液，使 Ca²⁺ 的终浓度为 20 μM。
3. 35 分钟后，将上清液小心地通过尼龙筛网（200 μm，表 II）过滤，使大部分组织块保留在烧杯中。将筛网上截留的组织块返回至烧杯中。

4. 第二次酶解消化

1. 用含有仅胶原酶 I 的 20 ml 酶溶液 E2（表 I）再次重悬组织块。立即加入 40 μl 的 10 mM CaCl₂ 溶液，使最终 Ca²⁺ 浓度为 20 μM。
2. 在第二次消化过程中，使用剪刀间歇性地进一步剪切组织凝块。
3. 5 分钟后，用巴斯德吸管取样，检查细胞解离情况。每 2–3 分钟重复一次，直至出现杆状、有横纹的心肌细胞。
4. 停止搅拌，让组织块静置沉降约 20–30 秒。
5. 小心地将上清液通过尼龙滤网（200 μm，表 II）过滤至一个 50 ml Falcon 管（A 管）中。将滤网上截留的组织块重新放回烧杯中。
6. 用 20 ml 储存液（表 I）¹⁰ 重悬烧杯中的组织块，并使用带移液器的 20 ml 血清移液管进行轻柔的机械吹打，进一步解离细胞。尽量避免产生气泡，因为气泡会损害细胞存活率和质量。
7. 小心地将上清液通过尼龙滤网（200 μm，表 II）过滤至另一个 50 ml Falcon 管（B 管）中。

5. 最终制备及终末 Ca²⁺ 浓度的调整

1. 将Falcon管A和B（见步骤4.5和4.7）在95 × g条件下离心10分钟。
2. 小心吸弃两根离心管中的上清液，注意不要扰动沉淀。弃去上清液。
3. 分别用1.5 ml保存液（表I）重悬两个沉淀（室温）。
4. 向每个Falcon管中分两次加入各7.5 μl的10 mM CaCl₂溶液，并轻轻搅拌。每步操作后孵育10分钟。
5. 再向每个管中加入15 μl的10 mM CaCl₂溶液，使最终Ca²⁺浓度达到0.2 mM。

6. 用荧光Ca²⁺指示剂Fluo-3 AM负载心肌细胞（图1）

1. 将1.5 ml细胞悬液（管A和/或管B）转移至2 ml微量离心管（Eppendorf管）中。
2. 以下步骤应考虑荧光Ca²⁺指示剂Fluo-3对光的敏感性，避免光照。
3. 将50 μg Fluo-3的膜通透性乙酰氧基甲酯衍生物（Fluo-3 AM，表III）溶解于44 μl Pluronic F-127（表III）储备液（20% w/v，无水DMSO中）中，配制成1 mM的Fluo-3 AM储备液，该溶液可在-20 °C下保存最多1周。
4. 向含有1.5 ml细胞悬液的微量离心管（见步骤6.1）中加入15 μl Fluo-3 AM储备液，并轻轻混匀。
5. 将细胞悬液置于不透光的容器中，避光孵育10分钟。
6. 短暂离心，约6,000 rpm。
7. 弃去上清液，并将沉淀物重悬于1.5 ml浴液（表IV）中。
8. 在开始实验前，将细胞悬液静置约30分钟，以完成去酯化过程。

7. 同时进行膜片钳和落射荧光 Ca²⁺ 测量

由于膜片钳测量并非本文综述的主要内容，因此我们建议感兴趣的读者参考其他对此技术有更深入描述的文献。^11-14 为完整起见，我们简要概述一种用于记录动作电位或L型Ca²⁺电流的实验方案，同时结合Ca²⁺瞬变信号的同步记录。

实验过程中，使用快速灌流系统（Octaflow IITM，ALA Scientific Instruments，NY）将心肌细胞在37 °C下用浴液（表IV）持续灌流。在电压钳实验中，通过在浴液中添加4-氨基吡啶（5 mmol/L）和BaCl₂（0.1 mmol/L）以阻断K⁺电流。使用硼硅酸盐玻璃微电极，当充以移液管溶液（表V）时，其尖端电阻应为2–5 MΩ。除心肌细胞的Fluo-3 AM负载（见步骤6）外，Fluo-3也加入至移液管溶液中（表V）。荧光激发波长为488 nm，发射光（<520 nm）被转换为[Ca²⁺]_i，并作如下假设

其中，k_d 为 Fluo-3 的解离常数（864 nM），F 为 Fluo-3 荧光强度；F_max 为每次实验结束时获得的 Ca²⁺ 饱和荧光强度¹²。电生理信号与落射荧光 Ca²⁺ 信号同步记录。在电流钳模式下，以 0.5 Hz 频率、1 毫秒时程、1.2 倍阈值强度的电流脉冲刺激动作电位。在电压钳模式下测量 L 型 Ca²⁺ 电流：钳制电位为 -80 mV，先施加 100 毫秒斜坡脉冲至 -40 mV 以失活快速 Na⁺ 电流，随后以 0.5 Hz 频率施加 100 毫秒测试脉冲至 +10 mV。

结果

图2A展示了从分离的人右心房肌细胞中获得的三个代表性示例。为了定量细胞产量，我们将10 μl细胞悬液（步骤5.5）移液至CellFinder显微镜载玻片上（http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html）。图2B中的平均细胞产量结果明确表明，慢性房颤（cAF）患者样本的细胞产量有降低的趋势（SR与cAF相比，A管：16.5±3.1个细胞/10 μl（n=29） vs. 5.1±2.3个细胞/10 μl（n=10），p<0.05；B管：17.9±3.9个细胞/10 μl（n=29） vs. 5.9±2.0个细胞/10 μl（n=9），p=0.107）。

动作电位测量及胞质Ca²⁺瞬变的同步记录的代表性示例如图3所示。在约90%的被检细胞中，动作电位触发的Ca²⁺释放引起明显且规律的细胞收缩。如先前报道，静息膜电位作为细胞完整性的公认指标，在SR和cAF患者中分别平均为-73.9±2.7 mV（n = 23/10 个心肌细胞/患者）和-77.7±1.8 mV（n = 19/8 个心肌细胞/患者）（p>0.05）¹⁵。图4展示了电压门控L型Ca²⁺电流与胞质Ca²⁺瞬变的代表性同步记录。应用非选择性β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素（1 μM）可增加I_Ca,L和胞质Ca²⁺瞬变的幅度，提示β-肾上腺素能信号转导级联功能完整。

图1. 心肌细胞Fluo-3 AM负载方案流程图（见步骤6.1–6.5）。m/v，质量/体积。

图2. A，在保存液中储存一小时后分离的人右心房心肌细胞。B，在保存液中每10 μl细胞计数所得的细胞得率均值±标准误（见步骤5.5）。n 表示每组内的制备次数。*p<0.05。

图3. 来自窦性心律和慢性心房颤动患者心房肌细胞的动作电位触发的Ca²⁺瞬变（CaT）的代表性记录。顶部：用于刺激的注入膜电流（I_M）（0.5 Hz）。下方：膜电位（V_M）和触发的CaT（底部）的同步记录。（经Voigt 等 2012¹⁵许可重绘）

图4. 在窦性心律患者和慢性心房颤动患者的 心房肌细胞中，异丙肾上腺素（1 μM）对L型Ca²⁺电流触发的Ca²⁺瞬变（CaT）的代表性记录。顶部：电压钳制方案（0.5 Hz）。下方：全膜总电流（I_M，主要反映L型Ca²⁺电流，居中）与触发的CaT（底部）的同步记录。（经Voigt等et al. 2012¹⁵许可重绘）

表 I. 溶液。

表 II. 专用设备。

表III. 用于心肌细胞负载 Fluo-3 AM 的物质。

表 IV. 膜片钳实验用灌流液。

表 V. 膜片钳实验用移液管溶液*。

讨论

本文描述了一种从接受开胸心脏手术患者获取的右心耳组织中分离人心房肌细胞的方法。为了将这些心肌细胞用于细胞质 Ca²⁺ 浓度的测量，我们对先前报道的方法^4-11进行了改进，即在细胞保存液中省去 EGTA。

早在1970年就已发现，尽管在消化过程中存在Ca²⁺时心肌细胞会发生解离，但所有细胞均处于收缩状态且不可存活。^16,17 因此，细胞分离需在无Ca²⁺溶液中进行。然而，重新引入生理浓度的Ca²⁺会导致Ca²⁺快速内流并引起细胞死亡。这一现象被称为Ca²⁺悖论，最初由Zimmerman和Hulsman在灌注心脏实验中观察到。¹⁸ 为防止Ca²⁺悖论，已有多种对分离液的改良方法被提出，包括将pH值降低至7.0¹⁹、添加牛磺酸²⁰或少量Ca²⁺（见步骤3.2和4.1）²¹，以及将分离后的心肌细胞储存在含EGTA的保存液中²²。¹⁷ 然而，众所周知，通过EGTA进行Ca²⁺缓冲会降低L型Ca²⁺电流诱导的Ca²⁺瞬变幅度，并导致Ca²⁺瞬变呈现双相衰减特征。²³ 因此，为了获得具有典型特性和单相衰减特征的Ca²⁺瞬变，我们在整个分离过程中均未使用EGTA。为保护细胞免受Ca²⁺悖论的影响，我们逐步提高保存液中的最终Ca²⁺浓度，直至达到0.2 mM。

胶原酶的选择可能是成功分离心肌细胞最关键的一步。传统的胶原酶是从溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）提取的粗制制剂，除胶原酶外，还含有多种蛋白酶、多糖酶和脂肪酶。根据其总体组成，胶原酶被分为不同类型。²⁴ Worthington I型和II型胶原酶已成功用于人右心房心肌细胞的分离。^{4-10,15,25-30} 在本研究描述的方案中，我们推荐使用I型胶原酶，尽管使用II型胶原酶也能获得足够数量的存活细胞。然而，即使是同一种类型的胶原酶，不同批次间的酶活性也存在显著差异。这些差异要求仔细筛选和测试不同批次，以优化分离流程。Worthington Biochemical Corp. 提供的在线批次筛选工具（http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php）可用于查找组成合适、已被证实适用于人右心房心肌细胞分离的可用批次。目前我们使用的I型胶原酶，其活性为250 U/mg胶原酶活性、345 U/mg酪蛋白酶活性、2.16 U/mg梭菌蛋白酶活性和0.48 U/mg胰蛋白酶活性（批号# 49H11338）。

本方法所获得的细胞可用于8小时内进行膜片钳研究、Ca²⁺ 瞬态测量以及两者的结合¹⁵ 此外，这些细胞可用于测量在电场刺激或通过膜片钳电极进行电刺激条件下细胞的收缩反应（未发表观察结果）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
			转运溶液
白蛋白	Sigma-Aldrich	A3059	保存溶液: 1%
BDM	Sigma-Aldrich	31550	转运溶液: 30
DL-b-羟基丁酸	Sigma-Aldrich	H6501	保存溶液: 10
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	转运溶液: 20 无钙溶液: 20 酶溶液 E1 和 E2: 20 保存溶液: 10
L-谷氨酸	Sigma-Aldrich	G1251	保存溶液: 70
KCl	Merck	1049360250	转运溶液: 10 无钙溶液: 10 酶溶液 E1 和 E2: 10 保存溶液: 20
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	转运溶液: 1.2 无钙溶液: 1.2 酶溶液 E1 和 E2: 1.2 保存溶液: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	转运溶液: 5 无钙溶液: 5 酶溶液 E1 和 E2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	转运溶液: 5 无钙溶液: 5 酶溶液 E1 和 E2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	转运溶液: 100 无钙溶液: 100 酶溶液 E1 和 E2: 100
牛磺酸	Sigma-Aldrich	86330	转运溶液: 50 无钙溶液: 50 酶溶液 E1 和 E2: 50 保存溶液: 10
胶原酶 I	Worthington	4196	酶溶液 E1 和 E2: 286 U/ml
蛋白酶 XXIV	Sigma-Aldrich	P8038	酶溶液 E1 和 E2: 5 U/ml*
pH			转运溶液: 7.00 无钙溶液: 7.00 酶溶液 E1 和 E2: 7.00 保存溶液: 7.40
用以下试剂调节 pH			转运溶液: 1 M NaOH 无钙溶液: 1 M NaOH 酶溶液 E1 和 E2: 1 M NaOH 保存溶液: 1 M KOH
浓度单位为 mM，另有说明者除外。BDM：2,3-丁二酮单肟。*蛋白酶 XXIV 仅包含在酶溶液 E1 中。
表 I. 溶液组成。
尼龙筛网（200 μm）	VWR-德国	510-9527
带夹套反应烧杯	VWR	KT317000-0050
表 II. 特殊设备。
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM（特殊包装）	Invitrogen	F-1242
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
表 III. 心肌细胞加载 Fluo-3 AM 所用物质。
4-氨基吡啶*	Sigma-Aldrich	A78403	灌流液: 5
BaCl2*	Sigma-Aldrich	342920	灌流液: 0.1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	灌流液: 2
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	灌流液: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	灌流液: 10
KCl	Merck	1049360250	灌流液: 4
MgCl × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	灌流液: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	灌流液: 140
丙磺舒	Sigma-Aldrich	P8761	灌流液: 2
pH			灌流液: 7.35
用以下试剂调节 pH			灌流液: 1 M HCl
表 IV. 膜片钳实验用灌流液。 *4-氨基吡啶和 BaCl 仅用于电压钳实验。
DL-天冬氨酸钾盐	Sigma-Aldrich	A2025	电极内液: 92
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	电极内液: 0.02
GTP-Tris	Sigma-Aldrich	G9002	电极内液: 0.1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	电极内液: 10
KCl	Merck	1049360250	电极内液: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	电极内液: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	电极内液: 4
Fluo-3**	Invitrogen	F3715	电极内液: 0.1
pH			7.20
用以下试剂调节 pH			1 M KOH
表 V. 膜片钳实验用电极内液*。 *实验当天电极内液需冰上保存直至使用。**Fluo-3 在实验当天由 1 mM 储存液加入。