活细胞周期分析 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪和Vybrant DyeCycle Violet DNA染料进行组织分析

摘要

活细胞周期分析方案 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪对组织进行分析的方法被描述。该方案可同时提供有关相对细胞大小、细胞数量、DNA含量以及通过谱系示踪或组织特异性荧光蛋白表达鉴定细胞类型的信息。 体内.

摘要

流式细胞术已广泛用于获取细胞群体中DNA含量的信息，以推断不同细胞周期时相的相对百分比。该技术已成功应用于模式生物的有丝分裂组织 黑腹果蝇 用于细胞周期调控的遗传学研究 体内结合细胞类型特异性的荧光蛋白表达与遗传操作，可获得关于细胞数量、细胞大小及细胞周期时相影响的详细信息 体内然而，这种活细胞方法依赖于使用可穿透细胞膜的Hoechst 33342 DNA嵌入染料，限制了其应用范围，仅适用于配备紫外激光器的流式细胞仪。我们对该方案进行了改进，采用了一种新型的活细胞DNA染料Vybrant DyeCycle Violet，可与更常见的405 nm violet激光器兼容。本文所呈现的方案能够在多种样本中高效地进行细胞周期分析，同时获取细胞类型、相对细胞大小及细胞数量信息。 果蝇 组织。该方案扩展了活细胞周期分析技术的适用性 黑腹果蝇 将组织样本送至小型台式分析仪——Attune 声波聚焦流式细胞仪，该仪器可在单个实验室规模下运行和维护。

引言

流式细胞术可用于检测活细胞群体的细胞活力、相对细胞大小、DNA含量以及荧光蛋白的表达。由于在S期发生核DNA的复制，因此通过分析细胞群体中的DNA含量信息，可推断出处于不同细胞周期阶段的相对百分比^1-3。该方法已成为从酵母到哺乳动物等多种模式生物体系中细胞周期分析的核心技术。

果蝇 黑腹果蝇 已成为遗传学研究的优良模型系统 体内 细胞周期调控的分析。果蝇中丰富的遗传工具可用于对细胞周期调控因子进行优雅的组织特异性和时间特异性操控，同时结合 体内 基于荧光蛋白的谱系示踪 ^4-6流式细胞术已被用于研究多种样本的DNA含量 果蝇 细胞类型，包括内复制细胞和培养的有丝分裂细胞 ^7,8一项重要进展 体内 通过开发一种用于活体二倍体细胞周期研究的流式细胞术分析方案，de la Cruz 和 Edgar 为此领域做出了贡献 果蝇 成虫盘 ^9,10，一种已被众多实验室采用并改进的实验方案。该技术若与遗传学方法相结合 体内 通过可诱导的荧光蛋白表达和组织特异性标记进行谱系示踪，可获取基因操作对细胞总体倍增时间、细胞大小的影响信息，并确定细胞周期各时相的精确时间点 体内 ^9,11然而，该方法迄今为止依赖于使用细胞膜通透性的Hoechst 3334....

方案

1. 果蝇饲养

1. 将所需基因型的果蝇在含10 ml酵母-葡萄糖培养基的窄口塑料小瓶中进行杂交³ 或您选择的其他富含蛋白质的培养基。广泛的 果蝇 可用于组织特异性表达和谱系示踪的转基因工具 体内 荧光蛋白表达的详细描述见其他文献^4,5每天将亲本转移至新的离心管中，以获得一系列24小时的子代收集样本；若需更精确的发育阶段控制，可在琼脂平板上收集胚胎，并按所述方法将新孵化的幼虫转移至离心管中¹⁰为确保实验条件一致并避免过度拥挤，每个试管中F1代子代的总数不应超过100只。根据实验的遗传设计，将试管置于适当的培养箱中，直至达到所需发育阶段。
2. 收集实验动物：需要处于3龄末期的成熟幼虫^rd 约在发育110-120小时的三龄幼虫（L3）期进行幼虫解剖，或在白蛹前期（WPP）进行精确的蛹期分期。在变态过程中，细胞周期会发生显著变化，包括在特定时间点转变为非增殖状态。^12,13因此，正确分期蛹期（发育后1小时内）对于变态过程中可重复的细胞周期数据至关重要。WPP对应蛹形成后0小时（0 hr APF），如下所示 图1，I部分. 在35 mm培养皿中，将WPP收集于用2.5 ml水润湿的折叠Kimwipe纸上，以维持一定湿度。在适宜温度下将蛹龄培养至所需发育阶段（小时APF）。注意，相较于标准的25 °C，发育在29 °C时快1.2倍....

结果

图2展示了使用所提供的GFP模板对幼虫翅组织样本进行分析的代表性结果，其中GFP在组织后半部分表达。使用所提供的RFP模板对相同组织类型和表达模式的样本进行分析时，也可获得类似结果（图3A）。所提供的模板和电压（表2）适用于幼虫眼（图3B）、脑和翅，以及蛹期眼、脑（图3D）和翅的分析。还可通过绘制门控5和门控6中细胞群体的前向散射光（FSC）生成相对细胞大小的直方图（图3C）。由于不同组织的细胞大小差异，或不同GFP或RFP转基因荧光强度的差异，门控可能需要进行轻微调整。该调整可在正式记录前，先运行少量样本（50–100 μl）时完成。

在Attune软件中，若允许细胞周期或细胞大小直方图的y轴（计数）自动缩放（即将y轴刻度设置为自动），则直方图将显示每个群体的全局最大值。图3B-3D展示了GFP阳性与GFP阴性直方图的代表性结果，其中y轴设置为各群体的全局最大值。若设定特定的y.......

讨论

本方案可用于分析不同发育阶段活体Drosophila组织中的细胞周期、相对细胞大小和相对细胞数量。当该分析与特定细胞类型的荧光蛋白表达或谱系示踪相结合时，可获得关于细胞对特定细胞周期或生长扰动反应的详细信息。作为原理验证，我们在果蝇蛹期脑组织中通过在GFP标记的细胞克隆中表达G1-S期细胞周期调控因子，打破了细胞的静息状态，导致在正常情况下超过90%脑细胞处于G1期阻滞的发育阶段发生异常的DNA复制（图3D）。

然而，这种活细胞周期分析方法存在一些重要的局限性。首先，使用此处描述的方案无法区分处于有丝分裂各个阶段的细胞。因此，此处描述的分析应结合针对有丝分裂标志物（如组蛋白H3第10位丝氨酸磷酸化¹⁸）的免疫荧光染色，以量化感兴趣组织中的有丝分裂指数。此外，此处描述的方法无法区分处于G1期与G0期阻滞的细胞，因为这两种状态具有相同的DNA含量。由于DyeCycle Violet可被活细胞摄取，因此对晚期凋亡阶段细胞的识别也受到限制。最后，需要注意的是，基于前向散射（forward scatter）所测量的细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12x75 毫米聚苯乙烯圆底5毫升试管	BD Falcon	352058	5 ml 离心管
Attune 声波聚焦细胞仪	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	蓝色 / 紫色配置
Attune 流式细胞仪软件（版本 1.2.5）	Life Technologies/ Applied Biosystems	免费	仅限 PC
Attune 性能追踪微球（5 × 10⁶ 微球/毫升）	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	用于日常性能测试
Dumont #5 Inox 镊子	精细科学工具	11251-20
30 mm × 12 mm 胚胎培养皿	电子显微镜科学公司	70543-30	玻璃解剖皿
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670051
胰蛋白酶-EDTA 溶液（10倍浓度）	Sigma	T4174
Vannas-Tü宾根弹簧剪	Fine Science Tools	15003-08	直型5毫米切割刃
Vybrant DyeCycle Violet 染色剂	Life Technologies/Invitrogen	V35003
表1. 所需试剂与仪器。
活细胞DNA染色液（10 ml）： 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ 游离 PBS（pH 7.2） 9 ml 10倍浓度胰蛋白酶-EDTA（Sigma） 5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet（注意，此浓度为哺乳动物细胞推荐浓度的0.25倍。我们发现更高浓度对果蝇组织具有毒性） 果蝇 细胞。 10X 钙2+ Mg2+ 游离 PBS（pH 7.2）：1.37 M NaCl，27 mM KCl，100 mM Na2HPO4 （二碱基），20 mM KH2PO4 （一元碱）调节至 pH 7.2
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	FSC	侧向散射	BL1	VL1
阈值（×1000）	100	10	10	10
电压（mV）	2950	4250	1800	1150

表2. 图2分析中的阈值和电压设置