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活细胞周期分析 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪和Vybrant DyeCycle Violet DNA染料进行组织分析

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DOI：

10.3791/50239

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2013年5月19日

 ,  ,  ,  , 
1Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

活细胞周期分析方案 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪对组织进行分析的方法被描述。该方案可同时提供有关相对细胞大小、细胞数量、DNA含量以及通过谱系示踪或组织特异性荧光蛋白表达鉴定细胞类型的信息。 体内.

摘要

流式细胞术已广泛用于获取细胞群体中DNA含量的信息，以推断不同细胞周期时相的相对百分比。该技术已成功应用于模式生物的有丝分裂组织 黑腹果蝇 用于细胞周期调控的遗传学研究 体内结合细胞类型特异性的荧光蛋白表达与遗传操作，可获得关于细胞数量、细胞大小及细胞周期时相影响的详细信息 体内然而，这种活细胞方法依赖于使用可穿透细胞膜的Hoechst 33342 DNA嵌入染料，限制了其应用范围，仅适用于配备紫外激光器的流式细胞仪。我们对该方案进行了改进，采用了一种新型的活细胞DNA染料Vybrant DyeCycle Violet，可与更常见的405 nm violet激光器兼容。本文所呈现的方案能够在多种样本中高效地进行细胞周期分析，同时获取细胞类型、相对细胞大小及细胞数量信息。 果蝇 组织。该方案扩展了活细胞周期分析技术的适用性 黑腹果蝇 将组织样本送至小型台式分析仪——Attune 声波聚焦流式细胞仪，该仪器可在单个实验室规模下运行和维护。

引言

流式细胞术可用于检测活细胞群体的细胞活力、相对细胞大小、DNA含量以及荧光蛋白的表达。由于在S期发生核DNA的复制，因此通过分析细胞群体中的DNA含量信息，可推断出处于不同细胞周期阶段的相对百分比1-3。该方法已成为从酵母到哺乳动物等多种模式生物体系中细胞周期分析的核心技术。

果蝇 黑腹果蝇 已成为遗传学研究的优良模型系统 体内 细胞周期调控的分析。果蝇中丰富的遗传工具可用于对细胞周期调控因子进行优雅的组织特异性和时间特异性操控，同时结合 体内 基于荧光蛋白的谱系示踪 4-6流式细胞术已被用于研究多种样本的DNA含量 果蝇 细胞类型，包括内复制细胞和培养的有丝分裂细胞 7,8一项重要进展 体内 通过开发一种用于活体二倍体细胞周期研究的流式细胞术分析方案，de la Cruz 和 Edgar 为此领域做出了贡献 果蝇 成虫盘 9,10，一种已被众多实验室采用并改进的实验方案。该技术若与遗传学方法相结合 体内 通过可诱导的荧光蛋白表达和组织特异性标记进行谱系示踪，可获取基因操作对细胞总体倍增时间、细胞大小的影响信息，并确定细胞周期各时相的精确时间点 体内 9,11然而，该方法迄今为止依赖于使用细胞膜通透性的Hoechst 33342 DNA嵌入染料对活细胞中的DNA进行染色和定量，这限制了用户必须使用配备能够激发Hoechst染料的紫外激光器的流式细胞仪。这类仪器通常仅见于分选型流式细胞仪中即 BD FACS Vantage、BD FACSAria）或昂贵的多色台式系统（即 BD LSR），通常需要机构流式细胞术核心设施提供支持。

我们改进了基于 Hoechst 的实验方案，采用 Invitrogen 公司新推出的活细胞 DNA 染料 Vybrant DyeCycle Violet。该染料可与常见的紫色 405 nm 激光兼容，这种激光在小型台式分析仪中较为普遍，也可用于小型一体化台式分析仪——Attune 声学聚焦流式细胞仪。本文提供了一种详细的细胞周期分析方案，结合 DyeCycle Violet 与 Attune 系统，可在多种发育阶段的 Drosophila 组织中同时进行细胞类型、细胞大小、细胞数量及谱系分析。本方案拓展了适用于 Drosophila 组织分析的流式细胞仪种类，并展示了如何针对其他组织类型和发育阶段对这类活细胞周期分析进行优化调整。

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方案

1. 果蝇饲养

  1. 将所需基因型的果蝇在含10 ml酵母-葡萄糖培养基的窄口塑料小瓶中进行杂交3 或您选择的其他富含蛋白质的培养基。广泛的 果蝇 可用于组织特异性表达和谱系示踪的转基因工具 体内 荧光蛋白表达的详细描述见其他文献4,5每天将亲本转移至新的离心管中，以获得一系列24小时的子代收集样本；若需更精确的发育阶段控制，可在琼脂平板上收集胚胎，并按所述方法将新孵化的幼虫转移至离心管中10为确保实验条件一致并避免过度拥挤，每个试管中F1代子代的总数不应超过100只。根据实验的遗传设计，将试管置于适当的培养箱中，直至达到所需发育阶段。
  2. 收集实验动物：需要处于3龄末期的成熟幼虫rd 约在发育110-120小时的三龄幼虫（L3）期进行幼虫解剖，或在白蛹前期（WPP）进行精确的蛹期分期。在变态过程中，细胞周期会发生显著变化，包括在特定时间点转变为非增殖状态。12,13因此，正确分期蛹期（发育后1小时内）对于变态过程中可重复的细胞周期数据至关重要。WPP对应蛹形成后0小时（0 hr APF），如下所示 图1，I部分. 在35 mm培养皿中，将WPP收集于用2.5 ml水润湿的折叠Kimwipe纸上，以维持一定湿度。在适宜温度下将蛹龄培养至所需发育阶段（小时APF）。注意，相较于标准的25 °C，发育在29 °C时快1.2倍，而在18 °C时慢2.2倍14.
  3. 如有需要，对动物进行热激以激活热激启动的翻转酶（hs-flp）介导的重组，用于谱系示踪克隆9,11对于幼虫的热激处理，将小瓶浸入设置为37 °C的水浴中，并确保幼虫完全浸没。对于蛹的热激处理，用封口膜密封培养皿，并将其完全浸入水浴中。热激完成后务必去除封口膜，以保证足够的氧气交换，维持动物存活。热激持续时间取决于所使用的flipase转基因的活性以及所需克隆的数量。我们通常采用7–8分钟以诱导“flipout”谱系示踪克隆。15 对于第一染色体上带有 hs-flp 转基因的幼虫，在35 mm培养皿中热激2-4分钟；而对于第二染色体上带有 hs-flp 转基因的蛹，则需要20分钟热激才能获得相当数量的克隆。

细胞分裂速率和解剖时间决定了每种组织中克隆的大小。在正常条件下，我们发现，在幼虫翅中通过20分钟热激（使用位于第二染色体上的hs-flp转基因）诱导、并在48小时后解剖的样本，通常包含约20–30个彼此分离良好的克隆，每个克隆的细胞数从10个到2个不等，平均每个克隆约含4个细胞。相比之下，在0小时羽化后（APF）的蛹中，使用相同的hs-flp转基因，在培养皿中进行7分钟热激，并在36小时后解剖，可获得分离良好的克隆（约15–25个），每个克隆的细胞数为1至4个，平均每个克隆2.2个细胞。此类数据可用于确定所研究组织的平均细胞倍增时间。

2. 解剖

  1. 将幼虫或蛹轻轻转移至含有1× PBS的透明玻璃解剖皿中。
  2. 在解剖显微镜下并配合充足的光源，用尖头Inox #5镊子轻轻夹住幼虫的腹部，用显微剪刀剪去其前端三分之一部分，并在固定幼虫体壁的同时，将口器区域向后端方向推入，使前端部分内翻（图1A）。小心去除不透明的脂肪体及任何残留的肠道组织，以提高目标组织（如翅、眼或脑）的可见度。用镊子将目标组织分离：干净地将翅从气管和体壁上剥离，将眼从口钩上取下，或将脑从眼中分离（图1G）。
  3. 解剖蛹时，用镊子轻轻夹住蛹壳前端含有气泡的区域，以避免损伤内部的蛹体（图1C）。另一只手持镊子或显微剪刀可辅助调整漂浮的蛹体位置，以便正确夹持。用显微剪刀从蛹体后端末端干净地剪开，该横切口应略微朝向动物的背侧倾斜，以释放内部压力，同时避免将已降解的脂肪组织挤入胸部和头部的目标组织中。沿背侧中线小心剪开，避开翅及前部的眼-脑复合体。通过夹住蛹表皮后缘并将其从蛹壳中拉出，将蛹体完整取出（图1D）。用镊子在眼-脑复合体前方的体壁上戳一个小孔。使用带橡胶吸球的玻璃巴斯德吸管，将PBS解剖液轻轻冲洗通过部分解剖的蛹体，以清除降解的脂肪及任何残留的肠道组织。此步骤还可使玻璃吸管内壁被脂质和蛋白质润滑，从而减少后续操作中分离组织黏附于吸管内壁的情况。
  4. 获取蛹期翅组织时，需将包裹翅的体壁及翅本身从蛹体中分离（图1E）。操作时可用一只镊子固定蛹头部，另一只镊子夹住翅体壁最末端并向外拉出；或先将镊子伸入翅下方靠近铰链处，再从尸体侧面撬出翅组织（图1E）。随后可在铰链处将翅剪断或撕下，将其移至远离尸体及其他材料的位置堆放。
  5. 获取蛹期眼或脑组织时，需冲洗蛹体直至眼-脑复合体完全松动并脱离蛹体（图1F, 1H）。用镊子轻轻将蛹眼从脑组织上分离，并保留所需的目标组织。
  6. 每个样本的解剖时间不得超过45分钟，因为动物打开后细胞在PBS中停留时间越长，实验结果的准确性越低。

3. 组织解离与DNA染色

  1. 使用润滑的巴斯德吸管，将解剖好的组织小心转移至5 ml聚苯乙烯管中的0.5 ml活细胞DNA染色液中（图1G）。转移时尽可能少带入PBS（少于300 μl），因为PBS稀释胰蛋白酶会抑制组织解离。
  2. 将管子置于23 °C、500 rpm条件下振荡孵育（我们使用Eppendorf Thermomixer）。
  3. 孵育70分钟，然后以中等速度（设定为5）轻轻涡旋振荡5秒。过度涡旋会导致细胞破裂并产生碎片，而振荡不足则会导致细胞成团。随后将样品重新置于23 °C、500 rpm条件下继续振荡15至20分钟，再以速度5再次涡旋振荡5秒。
  4. 对于36小时之后的蛹眼和脑组织，需采用改良方案。在1.7 ml微量离心管中，于23 °C、500 rpm条件下，在DNA染色液中解离组织45–60分钟。然后逐个将较大的组织块转移至解剖皿中，加入约50 μl DNA染色液，并使用手工拉制的巴斯德吸管（开口直径约为100–150 μm）快速反复吹打进行手动解离16。将每个已解离的样本连同剩余的0.5 ml DNA染色液一起转移至5 ml管中。继续在23 °C、500 rpm振荡条件下孵育额外45–30分钟（总孵育时间最长可达90分钟），直至无可见细胞团块。
  5. 完全解离的样本应几乎无明显的大型组织块残留，但需注意，无细胞的透明蛹翅表皮不会发生解离。

4. 流式细胞术

  1. 打开 Attune 细胞仪并启动 Attune 软件。应通过启动菜单开启细胞仪的激光器，并在每天数据采集前使用性能追踪微球（Performance Tracking Beads）进行日常性能测试，确保获得合格的评分。在执行性能测试前，应确保流体液位至少半满，并清空废液。有关 Attune 的启动、正确校准和操作的详细信息，请参见《Attune 用户指南》（ http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf）
  2. 在空白工作区中创建包含 4 个散点图和 2 个直方图的新模板，参数设置见 4.3 节；或选择先前设计的适用于本实验的模板，并设定待采集的样本数量。我们在附录 I 中提供了用于活体 Drosophila 细胞周期分析的 Attune 模板（.get 格式文件），适用于 Vybrant DyeCycle Violet 染色结合 GFP 或 RFP 表达的检测。
  3. 所提供的模板包含四个散点图和两个直方图，参数如 图 2 所示。检测通道包括：FSC 和 SSC —— 分别代表前向散射和侧向散射，反映细胞大小和膜复杂性；VL1 高度（H）、宽度（W）和面积（A）—— 表示紫光激光激发 DyeCycle Violet 对 DNA 的染色信号；BL1-A —— 蓝光激光通道 1 的面积信号，用于检测 GFP 荧光。用于 RFP 分析的模板与 GFP 分析模板相同，唯一区别是使用蓝光激光通道 3（BL3-A），该通道针对 RFP 检测进行了优化。
  4. 模板中的散点图设置了门控，以限制分析范围至目标细胞群体，并排除碎片和细胞团块（图 2）。门控 1 根据 SSC 与 FSC 的关系排除碎片和团块（图 2A）。门控 2 基于单细胞识别（VL1Area 与 VL1Width）排除未染色细胞、亚 G1 期凋亡细胞和细胞团块（图 2B）。门控 3 为衍生门控，包含门控 1 和门控 2 内的细胞，用于区分 GFP（或 RFP）阴性细胞与基于 VL1Height 的 DNA 含量（图 2C）。门控 4 也为衍生门控，包含门控 1 和门控 2 内的细胞，用于区分 GFP（或 RFP）阳性细胞与 DNA 含量（图 2C）。利用 GFP（或 RFP）与前向散射（FSC）反映的细胞大小绘制的散点图生成门控 5 和门控 6（图 2D）。两个直方图分别以 X 轴表示 DNA 含量，Y 轴表示细胞数量，展示由门控 3 和门控 4 定义的细胞群体（图 2E 和 2F）。如需要，也可添加细胞大小的直方图（未显示）。对于细胞大小直方图，应将群体设为门控 5 和门控 6，X 轴为 FSC，Y 轴为计数。
  5. 设定记录在 10,000 个 GFP 或 RFP 阳性事件时停止（即门控 4，由门控 1、门控 2 及 GFP 或 RFP 阳性门控共同定义的衍生门控）。传统上，发表级质量的图谱通常以获取 6,000 至 10,000 个 GFP 阳性事件为目标9,11。我们建议使用至少 15 只翅膀或眼睛组织，且其中约 50% 为 GFP 阳性，以获得足够数量的门控 4 事件10，从而生成高质量图谱。然而，我们已成功从低至 6 只翅膀中获得可用于初步细胞周期分析的清晰数据（图 3A）。设定采集体积为 300 μl，这将消耗总量 0.5 ml 样本中的约 460 μl。表 2 列出了 图 2 示例中模板提供的合适阈值和电压设置。
  6. 以标准灵敏度或高灵敏度（100 μl/min）运行样本并记录数据。我们发现不同灵敏度水平对分析结果影响极小。由于该细胞仪采用声学聚焦技术，可准确测量极高流速下的样本。与传统细胞仪不同，我们发现即使以每秒高达 1,500 个事件的速度采集数据，也不会导致数据质量下降。Attune 软件生成的记录数据文件为 .fcs 格式，可兼容大多数细胞周期建模软件。

5. 数据分析

  1. 可比较GFP（或RFP）阳性与阴性细胞群体的细胞大小和DNA含量直方图。可通过Adobe Photoshop软件复制粘贴手动叠加图像。若将Y轴设置为自动模式，Y轴将根据每个样本的最大计数值进行缩放。当两个图形的Y轴均设为自动缩放时叠加，所生成的直方图叠加图将依据各群体的全局最大值设定坐标轴，从而便于直观比较细胞周期时相的相对变化，即使GFP阳性与GFP阴性群体的总细胞数不相等亦可进行有效比较（示例见 图3B）。或者，可将自定义的 y 轴（y 轴手动选项）设置为直方图的固定值，以便比较两个群体的相对细胞数量。由于 Attune 每次运行使用固定的样本体积，因此可在每次运行中通过工作区自动生成的统计表，获得各门区细胞的绝对定量结果及其占总群体的百分比（示例见 图 3F）。在Attune软件中，也可通过简单地从右侧的样本文件菜单中拖放不同样本至已打开样本的所需图形上，轻松实现点图和直方图的叠加，以便进行比较。但若要叠加来自不同样本的亚群，则需 在……之内 单个样本（即 使用 Photoshop 对同一样本中的 GFP 阳性与 GFP 阴性区域进行分析。
  2. 可通过两种方法来确定细胞群体在细胞周期不同阶段的相对百分比。近似法依赖于用户定义的区域来划分 G1 期、S 期、G2 期和 >G2 峰。该方法可对用户自定义区域内的百分比进行快速简便的估算（图3E）。我们根据直接测试来设定区域 果蝇 Kc细胞，通过乙炔基脱氧尿苷（EdU）掺入法标记S期。第二种方法采用第三方建模软件估算细胞周期分布。例如，我们使用了ModFitLT（Verity Software House）软件 图3F.

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结果

图2展示了使用所提供的GFP模板对幼虫翅组织样本进行分析的代表性结果，其中GFP在组织后半部分表达。使用所提供的RFP模板对相同组织类型和表达模式的样本进行分析时，也可获得类似结果（图3A）。所提供的模板和电压（表2）适用于幼虫眼（图3B）、脑和翅，以及蛹期眼、脑（图3D）和翅的分析。还可通过绘制门控5和门控6中细胞群体的前向散射光（FSC）生成相对细胞大小的直方图（图3C）。由于不同组织的细胞大小差异，或不同GFP或RFP转基因荧光强度的差异，门控可能需要进行轻微调整。该调整可在正式记录前，先运行少量样本（50–100 μl）时完成。

在Attune软件中，若允许细胞周期或细胞大小直方图的y轴（计数）自动缩放（即将y轴刻度设置为自动），则直方图将显示每个群体的全局最大值。图3B-3D展示了GFP阳性与GFP阴性直方图的代表性结果，其中y轴设置为各群体的全局最大值。若设定特定的y...

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讨论

本方案可用于分析不同发育阶段活体Drosophila组织中的细胞周期、相对细胞大小和相对细胞数量。当该分析与特定细胞类型的荧光蛋白表达或谱系示踪相结合时，可获得关于细胞对特定细胞周期或生长扰动反应的详细信息。作为原理验证，我们在果蝇蛹期脑组织中通过在GFP标记的细胞克隆中表达G1-S期细胞周期调控因子，打破了细胞的静息状态，导致在正常情况下超过90%脑细胞处于G1期阻滞的发育阶段发生异常的DNA复制（图3D）。

然而，这种活细胞周期分析方法存在一些重要的局限性。首先，使用此处描述的方案无法区分处于有丝分裂各个阶段的细胞。因此，此处描述的分析应结合针对有丝分裂标志物（如组蛋白H3第10位丝氨酸磷酸化18）的免疫荧光染色，以量化感兴趣组织中的有丝分裂指数。此外，此处描述的方法无法区分处于G1期与G0期阻滞的细胞，因为这两种状态具有相同的DNA含量。由于DyeCycle Violet可被活细胞摄取，因此对晚期凋亡阶段细胞的识别也受到限制。最后，需要注意的是，基于前向散射（forward scatter）所测量的细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Aida de la Cruz 开发并讲授本版本所依据的原始实验方案10。Buttitta 实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM086517 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12x75 毫米聚苯乙烯圆底5毫升试管 BD Falcon3520585 ml 离心管
Attune 声波聚焦细胞仪Life Technologies/ Applied Biosystems4445315蓝色 / 紫色配置
Attune 流式细胞仪软件（版本 1.2.5）Life Technologies/ Applied Biosystems免费仅限 PC
Attune 性能追踪微球（5 × 10⁶ 微球/毫升） Life Technologies/ Applied Biosystems4449754用于日常性能测试
Dumont #5 Inox 镊子 精细科学工具11251-20
30 mm × 12 mm 胚胎培养皿 电子显微镜科学公司70543-30玻璃解剖皿
Eppendorf ThermomixerEppendorf022670051
胰蛋白酶-EDTA 溶液（10倍浓度）SigmaT4174
Vannas-Tü宾根弹簧剪 Fine Science Tools15003-08直型5毫米切割刃
Vybrant DyeCycle Violet 染色剂Life Technologies/InvitrogenV35003
表1. 所需试剂与仪器。

活细胞DNA染色液（10 ml）：

1 ml 10X Ca2+ Mg2+ 游离 PBS（pH 7.2）
9 ml 10倍浓度胰蛋白酶-EDTA（Sigma）
5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet（注意，此浓度为哺乳动物细胞推荐浓度的0.25倍。我们发现更高浓度对果蝇组织具有毒性） 果蝇 细胞。

10X 钙2+ Mg2+ 游离 PBS（pH 7.2）：1.37 M NaCl，27 mM KCl，100 mM Na2HPO4 （二碱基），20 mM KH2PO4 （一元碱）调节至 pH 7.2

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FSC侧向散射BL1VL1
阈值（×1000）100101010
电压（mV）2950425018001150

表2. 图2分析中的阈值和电压设置

参考文献

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