Ex utero 电穿孔与全半球外植体：一种用于早期皮质发育研究的简单实验方法

摘要

本方案描述了一种改进的器官块培养方法，涉及胚胎小鼠全脑半球的子宫外电穿孔、解剖与体外培养。ex utero 电穿孔技术有助于在早期皮层发育过程中进行药理学研究及基因功能检测。

摘要

皮层发育涉及神经元与非神经元成分之间的复杂相互作用，包括前体细胞、血管、脑膜及其相关细胞外基质。由于能够提供适宜的器官型微环境，皮层切片外植体常被用于研究调控神经元分化与发育的各类相互作用。尽管具有优势，切片外植体模型仍存在一些局限性，例如细胞层状结构异常和迁移紊乱。本文报道一种用于研究早期皮层发育的全大脑半球外植体系统，该系统较皮层切片更易于制备，并能稳定呈现器官型的细胞迁移与层状结构形成。在此模型中，早期的层状结构形成和细胞迁移模式在两天内可正常进行 体外，包括前板分离期，即未来皮层第六层形成的时期。随后，我们开发了一种 子宫外 电穿孔（EUEP）方法，可实现约80%的成功率，将GFP表达靶向定位于背侧内侧皮层发育中的神经元。

全脑半球外植体模型使得早期皮层发育过程可通过电穿孔、药理学干预及活体成像等方法进行研究。该方法避免了传统研究所必需的存活手术操作 在子宫内 电穿孔（IUEP）方法，同时提高转染效率和区域靶向的一致性。该方法将有助于神经元增殖、迁移和分化相关实验研究的开展。

引言

哺乳动物的大脑皮层通过相继产生神经元的协同增殖、迁移和分化而形成。每个神经元均起源于脑室区（VZ），从脑室区迁移至中间区（IZ），进而形成皮层板（CP）¹。在穿越不同皮层区域的过程中，迁移中的神经元表现出多种迁移模式^2,3，这些模式依赖于发育组织中的细胞外环境及其他细胞成分（例如放射状胶质细胞）。随后，皮层神经元在皮层板顶端停止迁移，同时发生神经元迁移终止与树突发育过程⁴。

皮层发育始于胚胎第11至13天（E11-13）⁵，最初通过原始网状层⁶（即前板，PP）的形成启动，该层由覆盖于室下区（VZ）上方的先锋神经元构成。随后，未来将成为皮层第6层的神经元（即在VZ中最早生成的皮层神经元）将其胞体以典型的空间排列方式定向，并在前板内聚集成一个明确的层次⁷。这些事件将前板分裂为浅层的边缘带（未来的皮层第1层）和深层区域，后者由下板细胞（短暂存在的皮层第7层）组成。这一过程被称为前板分裂，是大脑皮层后续发育的基础性事件⁸。

已发现许多基因突变会干扰大脑皮层发育的各个方面⁹。皮层发育还可能因摄入毒素（如可卡因¹⁰和酒精¹¹）而受到负面影响。由于发育过程中出现的皮层畸形很可能与神经精神疾病（例如自闭症、精神分裂症）相关，因此对皮层发育异常进行实证研究具有内在的重要性。因此，建立能够快速检测基因或毒素效应、同时又能保留分化中的神经元、其他细胞类型以及细胞外基质（ECM）在脑发育早期阶段可能相互作用的研究方法，具有重要意义¹²。

脑片外植体¹³为此类研究提供了有效的体系，并已被广泛用于检测皮层神经元的发育过程^14-16。然而，脑片检测方法存在一个缺陷，即神经元迁移和层状结构的形成可能出现异常¹⁷，这可能是由于切割损伤了包围发育中脑组织并锚定放射状胶质纤维支架的软脑膜细胞所致。由于放射状胶质纤维是皮层神经元迁移的重要基质¹⁸，切片操作对基底层的破坏可能在局部扰乱放射状胶质的结构，从而导致皮层神经元迁移异常。此外，外植体的切面会形成一片死细胞区域，可能改变这些区域细胞外基质（ECM）的正常组成。

近期的研究方法则将分析重点放在切片深层、被适当健康细胞类型和细胞外基质（ECM）包围的细胞上。然而，在某些情况下，这些较新的方法可能要求在固定后将原始的厚培养切片进行冷冻切片或石蜡切片，以便使切片相对正常的内部区域可用于分析^19-21。无论是最初用于制备活体切片以进行培养的振动切片，还是后续为分析而对固定切片进行的冷冻切片，都需要谨慎操作和大量努力，才能确保这些检测的成功。

为提供一种简单且互补的方法用于早期皮层发育的研究，我们改进了一种现有的脑片技术 ¹³ 以促进早期皮层发育的研究。我们开发了一种全半球外植体模型，类似于已有的E14全半球模型，该模型通过以每分钟65转的速度振荡培养，支持器官型生长持续16–18小时。 ^22,23 在我们的方法中，将整个半球组织外植体置于半透膜上 ¹³ 在高氧培养环境下 ^21,24 以延长类器官型皮层生长达48小时。该方法还可实现对发育中皮层神经元的稳定电穿孔。将胚胎从子宫中取出后进行电穿孔，以导入质粒DNA，随后解剖分离端脑。分离每个半球，并将其内侧面向下置于胶原包被的滤膜上。外植体随后培养48小时，此时间段涵盖前板分裂过程 ⁸在培养期间，L6神经元由前体细胞发育为分化神经元 ²⁵，准确定位于皮质板内。在此期间，发育中的神经元周围始终存在相应的细胞外基质和细胞类型，这些成分将与对应的神经元细胞相互接触。 体内该系统已证明在解析乙醇毒性的细胞事件方面具有重要价值 ²⁶第6层形成与先期板分裂 ^7,25 .

方案

1. 子宫外 绿色荧光蛋白表达质粒的电穿孔实验

1. 质粒DNA注射液的制备：将CAG-eGFP DNA²⁷用ddH₂O稀释至终工作浓度0.33 mg/ml。使用Qiagen无内毒素大提试剂盒（Endo-Free Maxi-Preps）从转化细菌中纯化质粒。在DNA溶液中加入约0.02%（w/v终浓度）的快绿染料，作为注射示踪剂。
2. 准备手术区域时，用70%乙醇溶液喷洒实验台面和解剖显微镜载物台，并擦拭干燥。在解剖前，用70%乙醇喷洒手术剪刀和镊子，并擦拭干燥。
3. 于E13天将配孕的Swiss/Webster品系母鼠通过转移至充满加压CO₂的密闭容器中实施安乐死，持续观察直至动物完全停止活动至少1分钟。通过CO₂吸入法处死后，将胚胎从子宫中取出，并置于含有冰上预冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）的10 cm培养皿中。
4. 小心地将每个胚胎从周围的胚外膜组织中分离出来，并保持在冰上预冷的HBSS中。
5. 将每个胚胎单独转移至第二个含有冷HBSS的10 cm培养皿中。使用Hamilton注射器将2–3 μl DNA与快绿的混合物注射至左侧大脑半球的脑室中，注意注射部位应选择在与后续分析区域在空间上分离的皮层区域。
6. 进行电穿孔时，用镊子轻轻夹住胚胎，将镊状电极的正极板轻置于头部背侧中线处，负极板轻置于胚胎下颌下方。使用BTX830电穿孔仪，设定为5次30 V、50毫秒持续时间的脉冲，脉冲间隔为950毫秒。上述参数适用于BTX830型号仪器；其他系统可根据制造商说明进行调整。

2. 全脑半球外植体制备

1. 电穿孔后，将胚胎放回冰冻的HBSS中。使用两把#5钟表镊去除胚胎头部的皮肤和软骨性颅骨以暴露脑组织。然后将一把镊子滑入脑组织下方，完整取出脑。将电穿孔侧（左侧）半脑从整个脑组织上分离，并去除附着的中脑组织。在整个解剖过程中，需注意保护覆盖左侧大脑皮层的脑膜不被损伤。
2. 解剖后，使用剪去尖端的1 ml移液枪头将每个胚胎转移至HBSS中。将半球轻轻挤出并置于胶原包被的培养插件上。每个24 mm插件上可放置最多六个半球外植体，均以内侧朝下排列。排列完成后，移除插件中多余的HBSS，并将插件放入6孔板中的一个35 mm孔内。每孔中准确加入2.7 ml培养基：含Glutamax的DMEM-F12培养基，并添加2% B-27、1% G5和1%青霉素-链霉素。可从孔中吸取少量培养基滴加于每个外植体表面，但切勿使每孔总液体量超过原有的2.7 ml。
3. 将外植体放置到胶原膜上后，把含有外植体的6孔板放入Billups Rothenberg（BR）培养箱中（同时箱内放置盛有水的加湿皿）。通入95%氧气/5%二氧化碳混合气体₂ 将气体混合物通入腔室至少1分钟，然后密封腔室并断开95%/5%氧气/二氧化碳₂ 气体供应管。随后将BR室置于37 °C的组织培养孵育箱中，继续培养1-2 DIV。

3. 组织外植体的固定以用于组织学分析

1. 在通风橱中配制Pagano固定液：首先将8 g多聚甲醛溶于100 ml预热（约80 °C）的ddH₂O中，加入1–3滴浓NaOH以促进溶解，并轻轻搅拌。待溶解完全后，将8%多聚甲醛溶液与含有500 mM蔗糖、100 mM Hepes（pH 7.4）、50 mM MgCl₂和5 mM KCl的溶液按1:1体积比混合，得到终浓度为4%多聚甲醛、250 mM蔗糖、50 mM Hepes、25 mM MgCl₂、2.5 mM KCl、pH 7.4的固定液。
2. 固定组织块时，先将Pagano固定液预热至37 °C。迅速吸去每个培养孔中的大部分DMEM/F12培养基，向每个含有组织块的孔中加入5 ml Pagano固定液，确保完全覆盖所有组织块。室温下固定1小时。在完成1小时固定前，不得将组织块从滤膜上取出。
3. 固定完成后，吸除Pagano固定液，替换为不含固定剂的Pagano溶液（250 mM蔗糖、50 mM Hepes、25 mM MgCl₂、2.5 mM KCl，pH 7.4）。加入数滴10%叠氮化钠，4 °C保存直至包埋。

4. 组织学包埋与切片

1. 通过将10 g小牛皮明胶溶于100 ml温水（55–60 °C）中，制备10%的小牛皮明胶溶液。将明胶溶液置于设定为60 °C的加热板上，并定期轻轻摇动，直至完全溶解。
2. 取约10 ml的10%明胶溶液倒入10 cm培养皿底部，静置30分钟使其凝固，形成用于包埋组织块的“垫层”。这些垫层可提前数天制备，并在4 °C下保存。使用直尺在培养皿底部绘制网格，并将各个组织块转移至网格的每个方格中。去除残留的Pagano溶液后，用移液器将温热的10%明胶溶液覆盖每个组织块，并使其凝固。继续缓慢添加明胶溶液，直至每个组织块完全被明胶包围，注意避免一次性加入过多温热明胶而使垫层融化。静置约1小时使明胶完全硬化。硬化后，可将各个组织块连同周围明胶切割成小块。随后将这些明胶块在Pagano固定液中后固定24–48小时，再使用振动切片机进行切片。
3. 将含组织块的明胶块以嗅球朝上的方向定位，在冠状面上切成100 μm厚的切片。切片收集后，保存于含0.1%叠氮化钠的PBS中，4 °C保存，直至进行免疫组织化学处理。
4. 免疫组织化学检测时，将切片转移至24孔板中（每孔2–3片）。首先加入0.5 ml PBST+B（PBS + 0.5% Triton X-100 和 2% BSA）以封闭非特异性抗体结合位点，室温轻摇孵育1小时。然后将适当稀释的一抗加入PBST+B中，每孔加入0.4 ml，于室温下过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次至少10分钟，去除未结合的一抗。随后将二抗与2 μg/ml Hoechst 33342核染料共同稀释于PBST+B中，加入样本孔中，室温轻摇孵育2小时。再进行三次PBS洗涤（每次10分钟），最后将切片用含90%甘油和50 mM Tris（pH 7.4）的封片剂封片。

结果

胚胎期啮齿类动物大脑皮层在整个发育过程中表现出横向的神经发生梯度，使得外侧新皮层的成熟度比背内侧新皮层约超前1天 ²⁸因此，第6层的大部分神经元得以生成（即 在E12期外侧皮层（也称为40区）表现出其最终的S期⁵）以及E13时期背内侧皮层（也称为Field 1）⁵）。前板分离始于第6层神经元生成后约1天，因此在E13时从外侧皮层开始，E14时在背侧皮层开始。为了研究前板分离及皮层板发育的起始过程，我们改进了一种脑片外植体实验方法 ^21,24 使得整个大脑半球通常从E13培养至E15（图1).

我们通过检测来自 Tg(Eomes::eGFP)Gsat 小鼠的全半球皮质外植体的生长情况，验证了皮质外植体技术的可行性（图 2）。该小鼠品系携带一种转基因，可标记兴奋性皮质谱系中的未成熟神经元^7,29,30。在 E13 时期制备全半球皮质外植体，此时背侧新皮质尚未发生预板分裂（图 2...

讨论

我们改进并评估了一种用于研究早期皮层发育（E13-E15）的实验模型——全半球脑片培养。该模型已被证明可用于分析构成大脑皮层第6层的兴奋性神经元谱系的迁移与分化过程^25,37。该系统的主要优势包括：1）可维持2天体外培养（DIV）的组织型生长；2）制备过程简便；3）在脑发育这一早期关键阶段，可方便地对神经元进行电穿孔、药理学干预及成像观察。我们已利用该系统记录了在前板分裂期间，皮层第6层神经元在形态、取向及树突发育方面的细微差异^7,38。

位于第6层的兴奋性神经元主要由皮质丘脑投射神经元组成，这些神经元向背侧丘脑提供双向输入^39,40，并被认为在功能上参与大脑皮层神经活动的同步化过程⁴¹。尽管这些神经元在生理上具有特化特征，但第6层神经元的发生、迁移和成熟过程与皮层第2–6层的所有兴奋性神经元具有共同的基本特征。具体而言，所有皮层兴奋性神经元均起源于端脑背侧的室管膜区（VZ），以多极神经元形态穿过中间带（IZ），并在皮层板（CP）内完成分化⁷。兴奋性皮层神经元的成熟由一组依...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Supplement 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X	Invitrogen	1504-044
Pen / Strep Liquid 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
胶原蛋白包被的培养插件	Costar	3492
牛皮明胶	Sigma	G9382
H–chst 33342	Invitrogen	H1399
牛血清白蛋白	Sigma	7906
EndoFree 质粒大提试剂盒	Qiagen	12362
设备
BTX 830 电穿孔仪	Harvard Apparatus	450052
10 mm 钳式电极	Harvard Apparatus	450166
培养箱	Billups Rothenberg	MIC-101
哈密尔顿微量注射器（5 µL）	Hamilton	87930
哈密尔顿注射器针头	Hamilton	7803-04	注明长度 1"，型号 4
Dumont #5 镊子	FST	11251-10
精细剪刀，耐切割型，9 cm	FST	14058-09