Ex utero 电穿孔与全半球外植体：一种用于早期皮质发育研究的简单实验方法

摘要

本方案描述了一种改进的器官块培养方法，涉及胚胎小鼠全脑半球的子宫外电穿孔、解剖与体外培养。ex utero 电穿孔技术有助于在早期皮层发育过程中进行药理学研究及基因功能检测。

摘要

皮层发育涉及神经元与非神经元成分之间的复杂相互作用，包括前体细胞、血管、脑膜及其相关细胞外基质。由于能够提供适宜的器官型微环境，皮层切片外植体常被用于研究调控神经元分化与发育的各类相互作用。尽管具有优势，切片外植体模型仍存在一些局限性，例如细胞层状结构异常和迁移紊乱。本文报道一种用于研究早期皮层发育的全大脑半球外植体系统，该系统较皮层切片更易于制备，并能稳定呈现器官型的细胞迁移与层状结构形成。在此模型中，早期的层状结构形成和细胞迁移模式在两天内可正常进行 体外，包括前板分离期，即未来皮层第六层形成的时期。随后，我们开发了一种 子宫外 电穿孔（EUEP）方法，可实现约80%的成功率，将GFP表达靶向定位于背侧内侧皮层发育中的神经元。

全脑半球外植体模型使得早期皮层发育过程可通过电穿孔、药理学干预及活体成像等方法进行研究。该方法避免了传统研究所必需的存活手术操作 在子宫内 电穿孔（IUEP）方法，同时提高转染效率和区域靶向的一致性。该方法将有助于神经元增殖、迁移和分化相关实验研究的开展。

引言

哺乳动物的大脑皮层通过相继产生神经元的协同增殖、迁移和分化而形成。每个神经元均起源于脑室区（VZ），从脑室区迁移至中间区（IZ），进而形成皮层板（CP）¹。在穿越不同皮层区域的过程中，迁移中的神经元表现出多种迁移模式^2,3，这些模式依赖于发育组织中的细胞外环境及其他细胞成分（例如放射状胶质细胞）。随后，皮层神经元在皮层板顶端停止迁移，同时发生神经元迁移终止与树突发育过程⁴。

皮层发育始于胚胎第11至13天（E11-13）⁵，最初通过原始网状层⁶（即前板，PP）的形成启动，该层由覆盖于室下区（VZ）上方的先锋神经元构成。随后，未来将成为皮层第6层的神经元（即在VZ中最早生成的皮层神经元）将其胞体以典型的空间排列方式定向，并在前板内聚集成一个明确的层次⁷。这些事件将前板分裂为浅层的边缘带（未来的皮层第1层）和深层区域，后者由下板细胞（短暂存在的皮层第7层）组成。这一过程被称为前板分裂，是大脑皮层后续发育的基础性事件⁸。

已发现许多基因突变会干扰大脑皮层发育的各个方面⁹。皮层发育还可能因摄入毒素（如可卡因¹⁰和酒精¹¹）而受到负面影响。由于发育过程中出现的皮层畸形很可能与神经....

方案

1. 子宫外 绿色荧光蛋白表达质粒的电穿孔实验

1. 质粒DNA注射液的制备：将CAG-eGFP DNA²⁷用ddH₂O稀释至终工作浓度0.33 mg/ml。使用Qiagen无内毒素大提试剂盒（Endo-Free Maxi-Preps）从转化细菌中纯化质粒。在DNA溶液中加入约0.02%（w/v终浓度）的快绿染料，作为注射示踪剂。
2. 准备手术区域时，用70%乙醇溶液喷洒实验台面和解剖显微镜载物台，并擦拭干燥。在解剖前，用70%乙醇喷洒手术剪刀和镊子，并擦拭干燥。
3. 于E13天将配孕的Swiss/Webster品系母鼠通过转移至充满加压CO₂的密闭容器中实施安乐死，持续观察直至动物完全停止活动至少1分钟。通过CO₂吸入法处死后，将胚胎从子宫中取出，并置于含有冰上预冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）的10 cm培养皿中。
4. 小心地将每个胚胎从周围的胚外膜组织中分离出来，并保持在冰上预冷的HBSS中。
5. 将每个胚胎单独转移至第二个含有冷HBSS的10 cm培养皿中。使用Hamilton注射器将2–3 μl DNA与快绿的混合物注射至左侧大脑半球的脑室中，注意注射部位应选择在与后续分析区域在空间上分离的皮层区域。
6. 进行电穿孔时，用镊子轻轻夹住胚胎，将镊状电极的正极板轻置于头部背侧中线处，负极板轻置于胚胎下颌下方。使用BTX8....

结果

胚胎期啮齿类动物大脑皮层在整个发育过程中表现出横向的神经发生梯度，使得外侧新皮层的成熟度比背内侧新皮层约超前1天 ²⁸因此，第6层的大部分神经元得以生成（即 在E12期外侧皮层（也称为40区）表现出其最终的S期⁵）以及E13时期背内侧皮层（也称为Field 1）⁵）。前板分离始于第6层神经元生成后约1天，因此在E13时从外侧皮层开始，E14时在背侧皮层开始。为了研究前板分离及皮层板发育的起始过程，我们改进了一种脑片外植体实验方法 ^21,24 使得整个大脑半球通常从E13培养至E15（图1).

我们通过检测来自 Tg(Eomes::eGFP)Gsat 小鼠的全半球皮质外植体的生长情况，验证了皮质外植体技术的可行性（图 2）。该小鼠品系携带一种转基因，可标记兴奋性皮质谱系中的未成熟神经元^7,29,30。在 E13 时期制备全半球皮质外植体，此时背侧新皮质尚未发生预板分裂（图 2.......

讨论

我们改进并评估了一种用于研究早期皮层发育（E13-E15）的实验模型——全半球脑片培养。该模型已被证明可用于分析构成大脑皮层第6层的兴奋性神经元谱系的迁移与分化过程^25,37。该系统的主要优势包括：1）可维持2天体外培养（DIV）的组织型生长；2）制备过程简便；3）在脑发育这一早期关键阶段，可方便地对神经元进行电穿孔、药理学干预及成像观察。我们已利用该系统记录了在前板分裂期间，皮层第6层神经元在形态、取向及树突发育方面的细微差异^7,38。

位于第6层的兴奋性神经元主要由皮质丘脑投射神经元组成，这些神经元向背侧丘脑提供双向输入^39,40，并被认为在功能上参与大脑皮层神经活动的同步化过程⁴¹。尽管这些神经元在生理上具有特化特征，但第6层神经元的发生、迁移和成熟过程与皮层第2–6层的所有兴奋性神经元具有共同的基本特征。具体而言，所有皮层兴奋性神经元均起源于端脑背侧的室管膜区（VZ），以多极神经元形态穿过中间带（IZ），并在皮层板（CP）内完成分化⁷。兴奋性皮层神经元的成熟由一组依.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Supplement 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X	Invitrogen	1504-044
Pen / Strep Liquid 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
胶原蛋白包被的培养插件	Costar	3492
牛皮明胶	Sigma	G9382
H–chst 33342	Invitrogen	H1399
牛血清白蛋白	Sigma	7906
EndoFree 质粒大提试剂盒	Qiagen	12362
设备
BTX 830 电穿孔仪	Harvard Apparatus	450052
10 mm 钳式电极	Harvard Apparatus	450166
培养箱	Billups Rothenberg	MIC-101
哈密尔顿微量注射器（5 µL）	Hamilton	87930
哈密尔顿注射器针头	Hamilton	7803-04	注明长度 1"，型号 4
Dumont #5 镊子	FST	11251-10
精细剪刀，耐切割型，9 cm	FST	14058-09