成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

摘要

本文介绍了使用兰格多夫灌流系统分离成年小鼠心肌细胞的方法。所获得的细胞具有钙耐受性，电生理静息，并可进行培养，以及利用腺病毒或慢病毒感染来调控基因表达。此外，还可利用MMSYS系统和膜片钳技术分析其功能特性。

摘要

原代心肌细胞（CMs）在培养中的应用为小鼠心脏疾病模型提供了有力补充，极大地推动了我们对心脏疾病的理解。特别是，研究离子稳态、离子通道功能、细胞兴奋性以及兴奋-收缩耦联，及其在疾病状态和致病突变下的改变，已为心脏疾病的机制提供了重要见解。此外，目前尚缺乏能够有效模拟成年CMs的永生化细胞系，而新生CMs在培养中存在诸多局限（缺乏成年CMs许多典型的结构与功能性生物力学特征），这阻碍了我们对成年心脏中信号通路、离子通道与收缩特性之间复杂相互作用的深入理解，从而进一步凸显了研究成年分离心肌细胞的重要性。本文介绍了从成年小鼠分离心肌细胞、细胞培养、利用腺病毒表达蛋白调控基因表达，以及后续功能分析的方法。这些技术的应用将有助于深入揭示调控细胞兴奋性、Ca²⁺ 动态变化和收缩功能的信号通路机制，并为心血管疾病提供更具生理相关性的表征。

引言

小鼠心血管疾病模型已被用作阐明基本疾病机制^1,2 以及识别潜在治疗靶点^1,3的有效工具。特别是，获得性心脏病（如压力超负荷）的小鼠模型^4,5 和转基因小鼠模型的应用，已显著推动了我们对心脏病的理解^6-8。细胞培养技术被用于在单细胞水平上研究信号级联^3,9,10 以及心脏细胞兴奋性和兴奋-收缩耦联过程中关键蛋白的变化^11-13 ，这些研究补充了in vivo小鼠模型的不足。然而，目前缺乏能够反映成年心肌细胞（CM）结构与功能的合适细胞系，这构成了一个重大局限。研究人员曾试图通过在异源表达系统中研究单个蛋白（如离子通道）来克服这一问题¹⁴，尽管这些研究在离子通道生物物理特性或蛋白转运方面提供了有用信息，但无法充分模拟CM的天然微环境，仍是一个显著缺陷。其次，由于大多数此类异源表达细胞缺乏成熟的收缩装置，因而无法研究收缩功能以及细胞兴奋性与收缩之间的复杂相互作用。正因如此，研究人员已转向使用原代心肌细胞培养来进行许多in vitro功能研究。最后，分离的心肌细胞研究能够在排除多细胞体系中混杂因素（包括瘢痕或纤维化以及纤维取向的影响）的情况下，评估收缩功能。

原代新生大鼠心室心肌细胞（NRVMs）相对易于培养，可通过腺病毒和慢病毒感染来调控基因表达¹⁵，因此已被成功应用

方案

1. 心肌细胞分离

材料（图1）

显微解剖镊子
组织镊子
精细止血镊
止血镊
显微解剖用锯齿状弯头镊子
直头手术剪
弯头手术剪
15 ml Falcon 离心管（5 个）
60 mm 培养皿
磷酸盐缓冲液（PBS）
尼龙筛网 - 孔径 400 μm
小型漏斗
蜡涂层编织丝线 4-0，19 mm，长 7-10 cm
非皮下注射针头，钝头，24 G 或商用动物喂养针头（24 x 1 英寸，W/1-1/4）
肝素钠
氯胺酮/赛拉嗪混合液
巴斯德吸管
OptiVision 解剖护目镜
IonOptix MMSYS 系统

注意：如果培养细胞，请在开始本方案前参阅第2节关于细胞培养的内容。

注意：所有小鼠均在屏障设施中饲养，并根据批准的IACUC法规、操作规范和程序进行安乐死。

注意：在开始操作之前，应预先加热整个系统，以确保兰格多夫系统（图2A，<....

结果

成年心肌细胞的分离可获得杆状、有横纹且静息状态（不自发搏动）的细胞（图5A）。死亡细胞呈圆形，且无横纹结构。静息状态的细胞可用于培养，并可通过腺病毒转染以调控基因表达（图5B和图5C）。培养24小时后，活细胞的形态未发生改变，仍具有Ca²⁺耐受性，并可通过电场刺激进行起搏。采用本方案可获得80–90%的活细胞得率。

为了测量细胞的收缩力，MMSYS 系统软件利用显微镜提供的相位信息，报告肌节长度或细胞长度的变化。图 7A 展示了通过肌节长度测量获得的野生型 C57BL6 小鼠细胞收缩力的代表性曲线。对于来自这些小鼠的健康成年心肌细胞，其基础肌节长度约为 1.7–1.9 μm。MMSYS 系统软件能够同时测量收缩力和钙处理能力，方法是测定钙激活荧光染料 Fura2-AM 的结合态与非结合态的荧光比值。尽管不同实验条件下比值可能存在轻微差异，但健康细胞的比值通常在 1.5–2.5 之间（图 7B）.......

讨论

在本报告中，我们描述了从小鼠心脏成功分离和培养成年心肌细胞（CM）所需的技术。我们的技术可进一步利用上述方法对CM的功能和兴奋性进行研究。研究成年CM功能性的关键参数在于所分离CM的健康状况和质量。如上所述，我们的技术能够获得大量具有功能的细胞，这些细胞可在培养条件下通过腺病毒/慢病毒感染进行基因表达操作，并可用于细胞兴奋性和收缩功能的分析。

分离功能性成年小鼠心肌细胞（CMs）最重要的参数之一，是将心脏精确且迅速地套接到非皮下注射针头上。必须确保将连接左心室的主动脉解剖至足够长度，以便更轻松、快速地完成心脏插管。插管时，针头尖端必须停留在升主动脉内，不得穿过主动脉瓣进入左心室，以确保灌注液能通过冠状动脉有效灌注组织。下一步关键操作是使用丝线将主动脉固定在针头杆上。结扎应位于升主动脉处，使灌注缓冲液逆向流入冠状动脉和左心室腔，而不会顺向从解剖后的主动脉远端或大血管流出。

一些研究者发现，安装压力计有助于评估插管质量以及后续的酶灌注效果。使用压力计时，左心室的初始压力应为约 80 - 100 cmH₂O，当.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma	S7653
氯化钾	Sigma	P9333
氯化镁	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
磷酸二氢钠	Sigma	S8282
D-葡萄糖最低量	Sigma	G8270
牛磺酸	Sigma	T0625
2,3-丁二酮单肟	Sigma	B0752
胶原酶B	罗氏应用科学	11088807001
胶原酶D	罗氏应用科学	11088858001
灰色链霉菌蛋白酶XIV	Sigma	P5147
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
氯化钙	Sigma	C8106
最低必需培养基	Sigma	51411C
牛血清白蛋白溶液	Sigma	A8412
L-谷氨酰胺	Sigma	G3126
青霉素-链霉素	Sigma	P4333
胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂	Sigma	I1884
氯化铯	Sigma	289329
谷氨酸	Sigma	G3291
三磷酸腺苷镁盐	Sigma	A9187
乙二醇双(2-氨基–thylether)-N,N,N',N'-四乙酸	Sigma	E3889
氢氧化铯溶液	Sigma	232041
四乙基氢氧化铵溶液	Sigma	86643
OptiVisor 光学玻璃双目头戴放大镜	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
组织镊，5.5"，1×2 齿	Roboz Scientific	RS-8164
莫洛尼钳 - 4.5" （11.5 cm）长，轻度弯曲，带锯齿	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 镊子，Dumostar，尖端尺寸 0.17 × 0.10 mm	罗博兹科学公司	RS-4966
Packer 蚊式止血钳 5" 直型扁平	Roboz Scientific	RS-7114
微型解剖剪 4.5" 弯曲双刃/双刃	Roboz Scientific	RS-5917
微型解剖剪 3.5" 直型锐缘/锐缘20毫米	Roboz Scientific	RS-5907