移植性动脉硬化的小鼠模型

摘要

我们描述了小鼠移植性动脉硬化（GA）模型的实验方案，该模型涉及将一段小鼠血管移植到同一近交品系的受体体内。通过将额外的遗传改变回交至血管供体，该模型可评估特定基因对GA的影响。

摘要

移植物动脉硬化（GA），也称为同种异体移植物血管病变，是一种在移植器官中经过数月乃至数年逐渐发展的病理性病变，其特征是整个移植物血管树出现弥漫性、环周性的狭窄。GA 发生发展过程中最关键的环节是内膜中类似平滑肌细胞的增殖。当将一段人冠状动脉植入免疫缺陷小鼠的肾下腹主动脉时，内膜可在过继转移的、针对动脉供体的异基因人 T 细胞作用下发生扩张；在无人 T 细胞的情况下，外源性人 IFN-γ 也可诱导内膜扩张。将一个品系的小鼠主动脉移植至另一品系小鼠体内作为慢性排斥反应模型存在局限性，因为在该小鼠模型中，急性细胞介导的排斥反应会在两到三周内完全清除移植物中所有供体来源的血管细胞。我们近期开发了两种新的小鼠模型以克服上述问题。第一种模型是将雄性小鼠的血管段移植至同品系（C57BL/6J）雌性受体小鼠体内。此种情况下的移植物排斥反应仅针对由 Y 染色体编码的次要组织相容性抗原（存在于雄性而不存在于雌性），由此引发的排斥反应进展足够缓慢，可使供体来源的平滑肌细胞保留数周之久。第二种模型是将野生型 C57BL/6J 小鼠的动脉段移植至同品系、同性别但缺乏 IFN-γ 受体的宿主小鼠体内，随后通过腺病毒载体感染小鼠肝脏以递送小鼠 IFN-γ。在此模型中，由于供体与受体小鼠品系和性别相同，不会发生排斥反应；然而，供体来源的平滑肌细胞会响应该细胞因子而增殖，而宿主来源的细胞因缺乏该细胞因子的受体而不产生反应。通过将额外的遗传改变回交至血管供体小鼠，这两种模型均可用于评估特定基因对 GA 进展的影响。本文中，我们详细描述了这两种小鼠 GA 模型的实验方案。

引言

移植物动脉硬化（GA），也称为同种异体移植物血管病变，是一种在移植器官中历经数月到数年逐渐发展的病理性病变，其特征为整个移植物血管树出现弥漫性、环周性的狭窄⁷。早期阶段可能表现为偏心性和局灶性狭窄，主要发生在动脉中，因此更类似于传统动脉粥样硬化中所见的狭窄。移植物血管管腔的丧失是由于内膜扩张所致，其原因包括受体来源的T细胞和巨噬细胞浸润，尤其是来源于移植物、受体或两者共同的类似平滑肌细胞的细胞以及细胞外基质的积聚^{5, 13, 19}，而血管向外重塑的代偿作用不足。在心脏同种异体移植物中，最具临床意义的病变发生在心外膜和心肌内冠状动脉。最终，冠状动脉的GA将导致缺血性心力衰竭。GA是晚期心脏移植物丢失的主要原因。GA的狭窄通常终止于缝合线处，这强烈提示其发病机制与受体对移植物同种异体抗原的免疫反应有关，因此我们将GA归类为一种慢性排斥反应³。然而，其他形式的动脉损伤可能通过增加总体损伤负荷或增强和/或调节同种免疫反应，从而增加发生GA的风险。在人类GA中，移植物动脉的内皮细胞（EC）衬层得以保留，而紧邻EC衬层的内膜最表层区域是受体来源的产生干扰素-γ（IFN-γ）的T细胞和巨噬细胞浸润最密集的部位¹¹；在部分患者中，GA与针对移植物EC的供体特异性同种抗体的产生相关¹⁶，但这些血管缺乏急性抗体介导排斥反应所特有的纤维素样坏死的组织学证据¹¹。

G....

方案

小鼠异体移植与同系移植模型

所有动物实验均经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。在同种异体移植模型中，取雄性4-5周龄野生型（C57BL/6J）或IFN-γR-KO小鼠的胸主动脉节段，通过端对端显微外科吻合技术移植至雌性受体8-12周龄野生型小鼠的腹主动脉（详见下文操作细节）。在同基因型移植模型中，取雄性4-5周龄野生型小鼠的胸主动脉节段，通过端对端显微外科吻合技术移植至雄性8-12周龄IFN-γR1-KO小鼠的腹主动脉。术后1周，小鼠经静脉接种Ad5.CMV-小鼠IFN-γ或Ad5.CMV-LacZ（Qbiogene），剂量为1 × 10⁹ PFU。在腺病毒接种后1周和5周，采用ELISA法（eBioscience）检测血清中小鼠IFN-γ水平。部分动物在处死前皮下注射BrdU（Sigma-Aldrich），剂量为100 mg/kg，持续2周。

端对端显微外科吻合技术（此部分将进行录像）：

1. 供体操作步骤

1. 通过腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对供体小鼠进行麻醉。
2. 确认麻醉充分后，将供体小鼠仰卧位置于操作显微镜下（放大倍数为 X8-30），并使用碘伏消毒片和酒精消毒片对胸壁进行消毒准备。
3. 切开肋骨和膈肌处的前胸壁以暴露心脏。
4. 打开右心房，....

结果

小鼠同种异体移植动脉硬化（GA）模型：在该模型中，将雄性供体的主动脉移植到雌性受体体内，使受体针对移植物上表达的Y染色体相关次要抗原（即雄性特异性次要组织相容性抗原H-Y）产生由同种反应性T细胞介导的同种免疫应答¹²，进而由T细胞产生的IFN-γ驱动血管平滑肌细胞（VSMC）增殖²⁰，这一现象在其他同种异体移植模型中亦有报道^{2, 6, 8-10, 14}。手术将雄性供体的一段胸主动脉移植至雌性受体的腹主动脉位置，并在移植后4周取主动脉组织进行分析（图1A）。通过Elastica-van Gieson（EVG）染色、H&E染色以及针对VSMC标志物SMA和泛白细胞标志物CD45的免疫组化染色对动脉移植物进行组织学分析。在C57BL/6J雄性小鼠之间的主动脉移植中未观察到移植物排斥反应。雄性向雌性的移植诱导了GA的发生，其特征为白细胞浸润以及富含VSMC的新生内膜形成（图1B）。为明确IFN-γ信号在GA中的作用，将来自野生型（WT）或IFN-γ受体基因敲除（IFN-γ.......

讨论

所述方案主要针对小鼠移植动脉（GA）模型。这些操作步骤也可应用于其他移植物移植模型，包括人源化异种移植模型（即将人冠状动脉节段移植至免疫缺陷小鼠的肾下主动脉）以及急性排斥反应小鼠GA模型（即将一个遗传品系的小鼠主动脉移植至另一遗传品系受体小鼠）。我们所描述的小鼠模型更接近人类GA病变。第一种模型涉及将雄性小鼠的血管节段移植至同一近交品系（C57BL/6J）的雌性受体。在此情况下，移植物排斥反应仅针对Y染色体编码的次要组织相容性抗原（存在于雄性而不存在于雌性），由此引发的排斥反应进展较为缓慢，可在数周内保留供体来源的平滑肌细胞^{2, 6, 8-10, 12, 14}。第二种模型涉及将野生型C57BL/6J小鼠的动脉节段移植至同品系同性别的受体小鼠，后者缺乏干扰素-γ受体（IFN-γR-KO），随后通过腺病毒载体感染小鼠肝脏以递送小鼠干扰素-γ（IFN-γ）。在此模型中不发生排斥反应，因为供体与受体小鼠品系和性别均相同，但供体来源的平滑肌细胞会响应细胞因子而增殖，而宿主来源的细胞因缺乏该细胞因子受体而不产生反应²¹。此外，通过将额外的遗传修饰回交至血管供体小鼠，这两.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J (H-2b)	杰克逊实验室（缅因州巴港）	000664	供体（5周龄） 受体（8-12周龄）
盐酸氯胺酮注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	储存液（50 mg/ml） 工作液（5 mg/ml）
无菌赛拉嗪溶液	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	储存液（100 mg/ml） 工作液（1 mg/ml）
酮洛芬	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	储存液（100 mg/ml） 工作液-口服 （0.027 mg/ml）
肝素钠	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	储存液（1000 U/ml） 工作液（100 U/ml）
生理盐水溶液（无菌0.9%氯化钠）	CareFusion	AL4109
0.9%氯化钠注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	用于配制麻醉剂
凡士林眼膏	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
碘伏消毒垫	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
酒精消毒垫	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
显微镜	Leica	MZ95
微型剪刀	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
弹簧剪刀	F.S.T	15009-08	用于切断供体或受体的主动脉
超细剪刀	F.S.T	14088-10
持针器/镊子	MICRINS	MI1542	用于持针
精细镊子	F.S.T	11254-20
镊子	F.S.T	11251-35
标准型镊子	F.S.T	11000-12
镊子	F.S.T	13011-12
LANCASTER 眼科开睑器	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
微型血管夹	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
带锁微型夹施加镊	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
黑色单丝聚酰胺缝线	AROSurgical Instruments Corporation	货号 #T4A10Q07	10-0 缝线，针头=70 微米
黑色单丝尼龙缝线	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 缝线
非织造 Songes	McKesson Corp.	订货号 94442000
1 ml 注射器	BD	REF 309659
3 ml 注射器	BD	REF 309657
10 ml 注射器	BD	REF 309604
18G 1 1/2，皮下注射针头	BD	REF 305196
25G 7/8，皮下注射针头	BD	REF 305124
27G 1/2，皮下注射针头	BD	REF 305109
30G 1/2，皮下注射针头	BD	REF 305106
心脏垫	Sunbeam	Z-1228-001
修剪器	Wahl	9854-500
表2. 特定试剂与设备。