靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术通过荧光成像支持对细胞内钙库动态的分析。该方法基于将重组的羧酸酯酶靶向至内质网（ER），在内质网腔内增强合成的低亲和力Ca2+指示染料的局部去屏蔽效果。
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摘要
摘要
钙动态的可视化对于理解钙在细胞生理学中的作用至关重要。为了研究钙动态，可使用合成的荧光Ca²⁺指示剂，这类指示剂具有易于加载的优点，但其信号持久性、靶向特定细胞区室的能力以及与遗传编码指示剂相比的时间控制方面存在局限性。此外，合成指示剂无法通过病毒转导等方式实现特定细胞类型的靶向表达。遗传编码的钙指示剂（GECIs）克服了这些限制，能够实现细胞类型特异性表达，并可长期稳定表达以用于慢性或纵向研究。其中，GCaMP系列指示剂因其高灵敏度和广泛适用性而被广泛应用。通过将GCaMP靶向表达于特定细胞群，研究人员能够在体内外实验中实时监测神经元或其他细胞类型的钙活动。该方法结合活细胞成像技术，可用于分析单细胞或细胞群体水平的钙信号动力学，从而揭示细胞激活模式、网络连接性及功能响应特性。2+ 指示剂已变得流行。本文中，我们演示了TED（靶向酯酶诱导染料加载）方法，该方法可改善Ca²⁺的释放2+ 不同细胞类型内质网腔中的指示染料。迄今为止，TED 已应用于细胞系、胶质细胞和神经元 体外. TED 基于高效的重组靶向技术，利用表达羧酸酯酶（Carboxylesterases, CES）的载体构建体，将高羧酸酯酶活性靶向内质网（ER）腔。最新的 TED 载体包含与红色荧光蛋白融合的 CES2 核心元件，从而实现双色同时成像。游离钙在内质网中的动态变化以一种颜色成像，而相应的内质网结构则呈现为红色。实验开始时，细胞通过慢病毒转导，随后将感染后的细胞接种于盖玻片上，以便最终进行活细胞成像。接着，活细胞与低亲和力 Ca²⁺ 探针的乙酰氧基甲酯（AM-ester）形式共同孵育2+ 指示剂，例如 Fluo5N-AM、Mag-Fluo4-AM 或 Mag-Fura2-AM。内质网中的酯酶活性可将 AM 形式的 Ca2+ 指示剂和亲水性荧光染料/Ca2+ 复合物在内质网腔内形成并被滞留。染料负载后，细胞在倒置共聚焦激光扫描显微镜下进行分析。细胞持续灌注类林格液，通过延时成像直接观察内质网钙离子动态变化。内质网钙释放表现为兴趣区域荧光强度下降，而内质网钙库的再充盈则导致荧光强度上升。最后，通过计算 ΔF/F 确定随时间变化的荧光强度改变。0.
引言
为了研究内质网的生理性钙反应，我们开发了一种新策略，以提高合成型钙敏感染料在内质网中的滞留效率。该方法能够在细胞外钙存在的情况下，直接、非侵入性地实时监测内质网内的游离钙浓度。
内质网钙离子的功能与信号传导
钙信号存在于多种细胞类型中，例如肌细胞、神经元和胶质细胞，其功能范围从介导肌肉收缩到参与学习与记忆中的突触传递1,2。游离钙离子浓度的变化具有重要的科研意义，因为钙离子参与调控基因转录、细胞增殖、神经元兴奋性、细胞死亡以及其他细胞信号传导事件1-7。所有这些细胞内的钙信号在功能上相互关联，并共同影响细胞内钙库的动力学过程8-10。
所有钙信号的共同特征是钙离子在细胞外空间、细胞质以及细胞器（主要是内质网和线粒体）之间的流动。这会导致这些细胞器内钙浓度的动态变化，而不同的信号组分能够感知这些变化。通常情况下，内质网中的钙浓度范围为100至800 μM，细胞质中的钙浓度接近100 nM，细胞外空间的钙浓度约为1-2 mM。因此，钙离子向细胞质流动具有较高的化学驱动力2,9,10。
最常研究的内质网（ER）来源的钙信号依赖于G蛋白偶联受体（GpcR）的激活，后者进一步激活磷脂酶C（PLC）。PLC继而生成....
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方案
本方案介绍了TED在细胞系、海马神经元和皮层胶质细胞中的应用。当TED载体稳定表达时，其效果最佳，例如通过慢病毒载体实现稳定表达。TED方法的示意图见图4。
1. 溶液的配制
以下溶液应在开始实验前配制，并按指示储存。我们通常使用灭菌的玻璃和塑料器皿以及经高压灭菌的水。
- 配制 HEPES-Ringer 溶液（单位：mM）：125 NaCl、3 KCl、25 HEPES、2 MgSO4.7H2O、2 CaCl2、1.25 NaH2PO4.H2O、10 glucose.H2O。无钙 HEPES-Ringer 溶液成分为（单位：mM）：127 NaCl、3 KCl、25 HEPES、2 MgSO4.7H2O、1.25 NaH2PO4.H2O、10 glucose.H2O 和 0.1 EGTA。不含葡萄糖的成像溶液可在 4 °C 下保存。使用前需新鲜加入所需量的 D-葡萄糖。
- 对于海马神经元中的 TED 分析，推荐使用人工脑脊液（ACSF）。ACSF 的成分为（单位：mM....
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结果
本方案提供了一种非侵入性的方法，用于直接成像游离的内质网钙离子。在靶向内质网的重组酯酶酶活性的帮助下，低亲和力合成型Ca2+指示剂被释放并滞留在内质网腔内。通过改进Ca2+指示剂染料在内质网腔内的负载效率，可实现对内质网钙库动态的直接且快速的成像。
用于 TED 的细胞类型
该方法在BHK21、HEK29334、HeLa17、SH-SY5Y细胞系、培养的星形胶质细胞8,40以及原代海马和皮层神经元8,34,41中已显示出可行性。在我们的实验中，当TED构建体通过自失活慢病毒载体37,39稳定表达时，TED效果良好，优先使用相对较弱的启动子（例如泛素启动子）35。其他更强的启动子正在研究中。
TED 标记的内质网特异性
使用Fluo5N成功.......
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讨论
近年来的多篇出版物已广泛讨论了TED方法的优缺点34,35。与其他上述方法相比，TED避免了细胞破坏和灌注的问题。此外，需要强调两个方面。用于ER钙成像的TED原理要求：（1）借助TED载体构建体，实现羧酸酯酶在内质网腔内的靶向表达；（2）在内质网腔内高效且优先释放对钙离子亲和力较低的合成AM酯类荧光染料。
1. TED 载体构建
图3 总结了TED载体构建体的开发过程。TED基于CES家族蛋白（EC 3.1.1.1）开发而成。这些蛋白是内质网腔内的常驻成员。对于 体外 研究表明，重组CES蛋白的施用在蛋白稳定表达后或病毒介导的中等水平表达后效果最佳。目前尚不清楚其他具有酯酶活性的蛋白是否可替代CES蛋白用于TED成像。不建议使用TED载体的瞬时转染进行动态内质网钙分析，因为细胞在转染操作后反应性降低。CES蛋白需要正确定位于内质网腔，这一过程依赖内质网信号肽的有效切割。此外，CES蛋白在内质网腔内的滞留与回收由其氨基末端的KDEL样基序介导。当瞬时转染T.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）BL567/3-1 项目和弗里德里希-鲍尔基金会（Friedrich-Baur-Stiftung）的资助。我们衷心感谢加利福尼亚大学圣地亚哥分校霍华德·休斯医学研究所实验室的 Roger Y. Tsien 提供 Tag-RFP-T2。我们诚挚感谢加利福尼亚理工学院（California Institute of Technology, Pasadena）的 David Baltimore 和日内瓦大学（University of Geneva, Geneva）的 Didier Trono 提供慢病毒质粒 FUGW 以及 psPAX2/pMD2.G。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (S)-3,5-二羟基苯基甘氨酸（Dihydroxyphenylglycine） | Tocris | 0805 | |
| 5'-ATP-Na2，三磷酸腺苷二钠盐水合物 | Sigma | A26209-1G | |
| B-27添加剂，50倍浓缩液 | Invitrogen | 17504-044 | |
| 氯化氨甲酰胆碱（Carbachol） | Sigma | C4382-1g | |
| 环匹阿酸（CPA） | Ascent scientific | Asc-300 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D2650 | |
| 含谷氨酰胺/谷氨酰胺替代物的DMEM | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| 不含 Ca/Mg 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液 1x | 聚丙烯酸 | H15-002 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM，10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| 谷氨酸 | Ascent 科学 | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham's F12营养混合物 | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| 不含钙、不含镁、含酚红的汉克平衡盐溶液（1×），HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| 马血清 | SHD3250YK | 线性 | |
| Ionomycin Ca2+ 盐 | Ascent scientific | Asc-116 | |
| 小鼠EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2补充剂 100倍浓缩液 | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal 培养基 | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127，低紫外吸收，2 g | Invitrogen | P6867 | |
| 聚-DL-鸟氨酸氢溴化物 PORN | Sigma | P8638 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴化物 | Sigma | P7280 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbio combust | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| 胰蛋白酶 | 沃辛顿 | LS-003707 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Sigma | T6522 | |
| <强>材料 | |||
| 共聚焦系统：倒置激光扫描显微镜：FV1000 配 IX81 | Olympus | 用户特定配置 | |
| 共聚焦系统：激光合束器FV10及二极管激光器（405、473、559、635） | Olympus | 用户特定配置 | |
| 共聚焦系统：配备光谱检测器的扫描头 FV10-SPD | Olympus | 用户特定配置 | |
| 加热器控制器 TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | 控制在线溶液加热器 |
| NIH ImageJ 软件 | WS Rasband，ImageJ，美国国立卫生研究院 http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006 | ||
| 目标：UAPON20XW340 NA 0.7 WD 0.35 | Olympus | N2709100 | |
| 目标：UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| 目标：UPLSAPO60XO/1.35，WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| 灌流室，倒置 | 定制 | ||
| 灌流室，RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| 灌注管：PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | 用于灌注 |
| 蠕动泵 MiniPlus 3（4 通道） | Gilson | 未提供 | 灌流泵 |
| 单通道在线溶液加热器 SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | 由加热控制器控制 |
| 吸液管：ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | 用于灌注 |
| 加热模块：Tempocontrol 37-2 数字双通道 | Pecon | 未提供 |
参考文献
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calci....
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