方法文章

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术对内质网钙的直接成像

DOI：

10.3791/50317

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2013年5月7日

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1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术通过荧光成像支持对细胞内钙库动态的分析。该方法基于将重组的羧酸酯酶靶向至内质网（ER），在内质网腔内增强合成的低亲和力Ca2+指示染料的局部去屏蔽效果。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

钙动态的可视化对于理解钙在细胞生理学中的作用至关重要。为了研究钙动态，可使用合成的荧光Ca²⁺指示剂，这类指示剂具有易于加载的优点，但其信号持久性、靶向特定细胞区室的能力以及与遗传编码指示剂相比的时间控制方面存在局限性。此外，合成指示剂无法通过病毒转导等方式实现特定细胞类型的靶向表达。遗传编码的钙指示剂（GECIs）克服了这些限制，能够实现细胞类型特异性表达，并可长期稳定表达以用于慢性或纵向研究。其中，GCaMP系列指示剂因其高灵敏度和广泛适用性而被广泛应用。通过将GCaMP靶向表达于特定细胞群，研究人员能够在体内外实验中实时监测神经元或其他细胞类型的钙活动。该方法结合活细胞成像技术，可用于分析单细胞或细胞群体水平的钙信号动力学，从而揭示细胞激活模式、网络连接性及功能响应特性。2+ 指示剂已变得流行。本文中，我们演示了TED（靶向酯酶诱导染料加载）方法，该方法可改善Ca²⁺的释放2+ 不同细胞类型内质网腔中的指示染料。迄今为止，TED 已应用于细胞系、胶质细胞和神经元 体外. TED 基于高效的重组靶向技术，利用表达羧酸酯酶（Carboxylesterases, CES）的载体构建体，将高羧酸酯酶活性靶向内质网（ER）腔。最新的 TED 载体包含与红色荧光蛋白融合的 CES2 核心元件，从而实现双色同时成像。游离钙在内质网中的动态变化以一种颜色成像，而相应的内质网结构则呈现为红色。实验开始时，细胞通过慢病毒转导，随后将感染后的细胞接种于盖玻片上，以便最终进行活细胞成像。接着，活细胞与低亲和力 Ca²⁺ 探针的乙酰氧基甲酯（AM-ester）形式共同孵育2+ 指示剂，例如 Fluo5N-AM、Mag-Fluo4-AM 或 Mag-Fura2-AM。内质网中的酯酶活性可将 AM 形式的 Ca2+ 指示剂和亲水性荧光染料/Ca2+ 复合物在内质网腔内形成并被滞留。染料负载后，细胞在倒置共聚焦激光扫描显微镜下进行分析。细胞持续灌注类林格液，通过延时成像直接观察内质网钙离子动态变化。内质网钙释放表现为兴趣区域荧光强度下降，而内质网钙库的再充盈则导致荧光强度上升。最后，通过计算 ΔF/F 确定随时间变化的荧光强度改变。0.

引言

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为了研究内质网的生理性钙反应，我们开发了一种新策略，以提高合成型钙敏感染料在内质网中的滞留效率。该方法能够在细胞外钙存在的情况下，直接、非侵入性地实时监测内质网内的游离钙浓度。

内质网钙离子的功能与信号传导

钙信号存在于多种细胞类型中，例如肌细胞、神经元和胶质细胞，其功能范围从介导肌肉收缩到参与学习与记忆中的突触传递1,2。游离钙离子浓度的变化具有重要的科研意义，因为钙离子参与调控基因转录、细胞增殖、神经元兴奋性、细胞死亡以及其他细胞信号传导事件1-7。所有这些细胞内的钙信号在功能上相互关联，并共同影响细胞内钙库的动力学过程8-10。

所有钙信号的共同特征是钙离子在细胞外空间、细胞质以及细胞器（主要是内质网和线粒体）之间的流动。这会导致这些细胞器内钙浓度的动态变化，而不同的信号组分能够感知这些变化。通常情况下，内质网中的钙浓度范围为100至800 μM，细胞质中的钙浓度接近100 nM，细胞外空间的钙浓度约为1-2 mM。因此，钙离子向细胞质流动具有较高的化学驱动力2,9,10。

最常研究的内质网（ER）来源的钙信号依赖于G蛋白偶联受体（GpcR）的激活，后者进一步激活磷脂酶C（PLC）。PLC继而生成肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）1。当IP3与其在内质网膜上的受体（IP3-Rec，图1）结合后，钙离子便从内质网腔中释放出来。历史上，Streb 等于1983年首次——尽管是间接地——在胰腺腺泡细胞中测量到了内质网通过IP3介导的钙释放11。该研究首次提出了一个信号级联通路，涉及乙酰胆碱、磷脂酶C和IP3。这种钙释放方式通常被称为IP3诱导的钙释放（IiCR）（图1）。受体酪氨酸激酶通过激酶依赖性激活磷脂酶Cγ，将生长因子和神经营养因子的作用与IP3升高后的内质网钙信号联系起来12。除了IiCR外，钙升高还可通过离子型钙内流介导，例如通过电压门控钙通道（CaV），进而由兰尼碱受体（RyR）引发钙诱导的钙释放（CiCR）。IiCR和CiCR在生理上与内质网钙库操纵的钙内流（SOCE）相关联。SOCE涉及STIM（基质相互作用分子）的作用，STIM是内质网钙释放的感受器。研究表明，STIM可通过瞬时受体电位通道（Trp）13、Orai钙通道14，甚至电压门控钙通道15（图1）促进细胞外钙的内流。内质网钙的流失可由肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）动态地补充，该酶主动将钙泵回内质网。使用如毒胡萝卜素（thapsigargin）等药物抑制SERCA，会揭示内质网钙持续向胞质溶胶区室流失的现象。这种内质网钙的“泄漏”是由内质网膜内的孔复合物（如Sec61蛋白复合物）引起的16,17（图1）。

1998年，Berridge提出了一个名为“神经元内的神经元模型”的理论，该模型提出内质网（ER）在整合神经元钙信号方面具有重要的生理功能5。该模型认为，存在一个连续的内质网膜系统，形成了神经元质膜的细胞内“映像”5。这种二元真核生物膜系统被认为是神经元对快速和慢速钙信号进行时间和空间整合的基本前提。在同一神经元的不同树突棘或树突中同时或相继发生的钙信号可通过内质网传递至细胞体或细胞核，并在其中进行叠加5,18。随后，这些叠加的信号可能影响神经元的兴奋性、基因转录的调控或信号级联的整合。因此，内质网有助于钙信号的整合。该理论的一个前提是单个细胞内内质网的连续性，这一观点已被多项研究提出，并至少在胞体-树突区域及短距离轴突投射中得到证实19-21。至于长距离轴突投射中是否存在内质网的连续性，目前仍存在争议。

测量游离钙离子在内质网膜上流动的方法

细胞质中的钙信号最常被监测 22,23因此，很难明确区分是 Ca2+ 从细胞外或细胞内储存库流入细胞质 6,24为克服这一局限，已开发出用于直接进行内质网钙成像的方法学策略。简而言之，采用以下策略：（1) 靶向内质网的基因工程蛋白指示剂 25-27. 基于蛋白质的低亲和力 Ca2+ 指示剂使用生物发光蛋白 aequorin 或 GFP，结合钙感应蛋白。这些基因工程改造的 Ca2+ 指示剂（GECIs）可通过信号肽靶向内质网，并利用保留与回收基序将指示剂主动保留在内质网中。常用的内质网Ca2+ 基于Cameleon原理的指示剂为Cameleon YC4.3 26,28；Cameleon 分子探针 YC7.3ER 29，以及 Cameleon D1 30. (2) 基于酯酶的AM酯低亲和力染料直接负载 Ca2+ 指示剂 31,32. 指示剂染料的AM衍生物（Mag-Fura2-AM、Mag-Fluo4-AM或Fluo5N-AM）以脂溶性且对钙不敏感的状态穿过生物膜。随后，在细胞质以及内质网（ER）中，内源性酯酶会切除AM酯基团，释放出Ca2+ 指示剂，从而在细胞质和内质网中留下一定量的活性染料。因此，只要细胞质钙浓度远低于低亲和力指示剂的检测限，特别是在特征性钙信号期间，当内质网中钙浓度较高时，该方法即为有效。例如 nM 至低 μM。3) AM-酯负载与质膜通透化相结合 32. 任何残留的胞质 Ca2+ 指示剂通过使用少量“温和”去垢剂对质膜进行通透化处理而被去除例如 皂苷)置于人工细胞内缓冲液中。因此，细胞内膜可能被刺激， 例如 与 IP3 在细胞内缓冲液中，直接通过质膜上的“孔”进入。4) 全细胞构型下细胞质的透析及钙离子的同时测量2+ 内质网腔和细胞质 32,33. 首先将细胞加载低亲和力 Ca2+ 指示剂例如 Mag-Fura2-AM，比率型，紫外光）。随后，在膜片钳移液管的辅助下，清除残留的胞质低亲和力 Ca2+ 指示剂通过含有高亲和力 Ca 的缓冲液从细胞质中透析出去2+ 指示剂例如 Fluo-3，可见光）。该策略可实现细胞质和内质网来源信号的同步记录。5) 靶向酯酶诱导染料加载 8,34一种羧酸酯酶（CES）被靶向至内质网腔，可提供高酯酶活性，从而有效捕获低亲和力Ca的AM酯形式2+ 指示剂。

靶向酯酶诱导染料加载（TED）

为了提高低亲和力 Ca2+ 探针在内质网腔内的靶向性，开发了 TED 技术。TED 需要过表达一种靶向内质网的小鼠羧酸酯酶（CES2）（图 2），该酶通过表达载体实现表达。表达重组 CES 载体的细胞与钙离子荧光探针的乙酰甲氧基酯形式（Fluo5N-AM，图 2）共同孵育。随后，在内质网中，由于 CES2 具有高酯酶活性，可将探针转化为对 Ca2+ 敏感且不能透过膜的 Ca2+ 探针复合物（Fluo5N/Ca2+），从而将探针高浓度地滞留在内质网腔内8,34。该方法特别适用于研究通过 IiCR 通路（例如代谢型、嘌呤能或谷氨酸受体介导的通路）引发的内质网钙释放8,34，以及直接观察由“泄漏通道”引起的内质网钙耗竭，例如在 SERCA 被阻断后的情况17,34。根据我们的经验，目前 Fluo5N-AM 是与 TED 染料负载策略联用的最佳可用低亲和力 Ca2+ 探针。Fluo5N-AM 对 Ca2+ 的亲和力较低（解离常数 KD 约为 90 μM，图 2），其 AM 形式几乎无荧光，但在结合钙离子后可产生强烈的荧光信号8,34。Fluo5N/Ca2+ 复合物可使用约 490 nm 的标准光源激发，该波长与 FITC、Alexa 488 或 eGFP 等常规荧光染料相匹配。细胞质中的钙信号浓度通常仅达到低 μM 范围，因此 Fluo5N 在细胞质中几乎无法检测到这些信号35。

为了提高TED的性能，开发了多种重组载体构建体（图3）。最初，TED载体基于CES2的编码序列（Refseq登录号NM_145603，CES2c），其中以CES构建体的稳定表达获得最佳的TED性能。新的TED载体表达CES2的核心元件，并将其与红色荧光蛋白TagRFP-T2融合36。这些载体的优势在于可用于识别转导细胞，并利用红色荧光作为Fluo5N/Ca2+荧光变化归一化的内参对照。此外，红色荧光还能够用于可视化内质网的结构分布及其在刺激条件下内质网动态的变化。

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方案

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本方案介绍了TED在细胞系、海马神经元和皮层胶质细胞中的应用。当TED载体通过慢病毒载体等方式稳定表达时，TED的效果最佳。图4展示了TED方法的示意图。

1. 溶液的配制

以下溶液应在开始实验前配制，并按指示储存。我们通常使用灭菌的玻璃和塑料器皿以及经高压灭菌的水。

  1. 配制 HEPES-Ringer 溶液（单位：mM）：125 NaCl、3 KCl、25 HEPES、2 MgSO4.7H2O、2 CaCl2、1.25 NaH2PO4.H2O、10 glucose.H2O。无钙 HEPES-Ringer 溶液的成分为（单位：mM）：127 NaCl、3 KCl、25 HEPES、2 MgSO4.7H2O、1.25 NaH2PO4.H2O、10 glucose.H2O 和 0.1 EGTA。不含葡萄糖的成像溶液可在 4 °C 下保存。使用前需新鲜加入所需量的 D-葡萄糖。
  2. 进行海马神经元 TED 分析时，推荐使用人工脑脊液（ACSF）。ACSF 的成分为（单位：mM）：127 NaCl、23 NaHCO3、3 KCl、2.5 NaHPO4.H2O、25 D-葡萄糖.H2O、2 CaCl2、2 MgCl2.7H2O，溶于 ddH2O 中。
  3. 将 Fluo5N-AM 配制成 5 mM 的浓度。为促进溶解，向 50 μg 冻干的 Fluo5N-AM 中加入 8.9 μl 的 20% Pluronic F-127（溶于 DMSO，室温保存，避湿避光）。然后使用水浴超声仪超声至少 2 分钟以溶解 Fluo5N-AM。分装为每管 0.5 μl，于 -20 °C 保存，避光防潮。
  4. 根据需要配制拮抗剂和激动剂的母液。例如：a) 10 mM ATP 或 ADP（溶于 H2O，用于嘌呤能受体的代谢型激活）；b) 10 mM 卡巴胆碱（溶于 H2O，毒蕈碱型乙酰胆碱受体激动剂）；c) 30 mM 环匹阿尼酸（CPA，溶于 DMSO，SERCA 抑制剂）；d) 50 mM DHPG（溶于 PBS，mGluRI 和 mGluR5 的代谢型谷氨酸受体激动剂）；e) 10 mM 谷氨酸（溶于 H2O）；f) 1 mM 离子霉素（溶于 DMSO，离子载体）；g) 5 mM 毒胡萝卜素（溶于 DMSO，高亲和力 SERCA 抑制剂）。分装后于 -20 °C 保存。
  5. 慢病毒载体：本方案涉及使用慢病毒 TED 表达载体颗粒。其制备与储存不在本方案范围内。我们使用第二代慢病毒载体将重组羧酸酯酶递送至细胞系、胶质细胞和神经元。我们的慢病毒系统基于表达载体 FUGW 37，以及包装质粒 pCMVΔR8.91 或 psPAX2 和假型质粒 pMD2.G 38,39。注意：使用重组自失活慢病毒载体时，必须严格遵守生物安全指南。在许多国家，此类载体被归类为生物危害二级风险。更多信息请参见 http://www.addgene.org/lentiviral/。

2. 小鼠海马神经元的制备与病毒感染

  1. 将100个玻璃盖玻片放入直径为20 cm的玻璃培养皿中，用70%乙醇清洗1次，约30分钟。最后用100%乙醇（p.a.）处理2分钟。去除残留乙醇，并在无菌操作台中干燥盖玻片。
  2. 为海马神经元培养准备两种不同的培养基：（a）含B27（1:50）的Neurobasal培养基；（b）完全培养基：含B27（1:50）、Glutamax（1:100）和N2添加剂（1:100）的Neurobasal培养基。将培养基经无菌过滤后，置于细胞培养箱中保存备用。
  3. 在解剖前一天，将一片无菌的10 mm盖玻片放入4孔细胞培养板的每个孔中，然后每孔小心加入80–100 μl 0.1%多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）进行包被，将培养板置于培养箱中过夜。
  4. 在解剖及细胞培养当天，先用100 μl HBSS将盖玻片洗涤三次，然后每孔加入100 μl Neurobasal培养基。将培养板放入培养箱中平衡（例如在小鼠解剖期间）。

解剖

我们根据欧盟指南开展小鼠实验，并已获得本机构动物护理与使用委员会的批准。

  1. 取出全脑并双侧解剖分离海马体。
  2. 仔细去除海马体以外的脑膜及其他组织，将每个海马体分别放入含有 450 μl HBSS 的 1.5 ml 离心管中。将组织置于冰上保存，直至分离到足够数量的海马体。

细胞培养

  1. 向每管中加入 50 μl 1% 胰蛋白酶（Worthington），在 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。期间偶尔轻轻摇动试管。为终止消化反应，向每管中加入 50 μl 1% 胰蛋白酶抑制剂，并反复倒置试管数次。
  2. 将最多 5 个海马组织全部转移至一个 15 ml 离心管中，注意避免转移液体。加入 B27 培养基（a），使终体积达到 5 ml。
  3. 使用火焰抛光的巴斯德玻璃移液管，通过轻柔吹打进行组织吹打重悬。注意：避免产生气泡！
  4. 以 400 × g 离心 3 分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 ml B27 培养基（a）中。
  5. 再次使用玻璃移液管吹打一次，随后使用 1,000 μl 塑料滤芯吸头吹打两次。操作方法同步骤 2.9 和 2.10 所述。
  6. 最后一次离心后，将细胞沉淀重悬于 2 ml 完全培养基（b）中，并使用 200 μl 塑料滤芯吸头吹打细胞。为将残留的细胞团块与单细胞悬液分离，静置 1–2 分钟使细胞团块沉降。
  7. 计数细胞并计算病毒感染所需的细胞总数。用于 TED 成像时，每张 10 mm 盖玻片使用 25,000 个细胞。
  8. 建议在此时额外接种 25,000 个未转导的细胞作为对照。

病毒感染

  1. 将用于病毒感染的细胞悬液转移至新的15 ml离心管中，在400 × g条件下离心3分钟。
  2. 吸除上清液，并将细胞重悬于300 μl培养基（b）中。
  3. 加入适量的具有感染性的慢病毒TED表达载体颗粒，将离心管在室温下静置10分钟。
  4. 用完全培养基（b）补足至铺板所需的终体积（每张10 mm盖玻片100 μl），吸除盖玻片上的原有培养基，立即向每张盖玻片加入100 μl细胞悬液。
  5. 将培养皿放入培养箱中，直至所有细胞沉降完毕（约2小时），然后小心添加培养基至每皿终体积为2 ml（b）。
  6. 让神经元至少生长一周，每周更换50%的培养基。

3. 小鼠大脑皮层胶质细胞的培养与病毒感染

准备

  1. 首先配制基础胶质细胞培养基（DMEM/F12 培养基按 1:1 混合，含 10% 胎牛血清、5% 马血清、1% 青霉素/链霉素和 0.45% 葡萄糖），并用 4 ml 浓度为 0.5 ng/ml 的多聚-DL-鸟氨酸氢溴化物（PORN）（溶于 pH 8.35 的 150 mM 硼酸溶液中）包被 T75 细胞培养瓶。在 37 °C 条件下孵育 2 小时或过夜后，用 HBSS 洗涤细胞培养瓶三次，然后加入 18 ml 含有 1:50 B27 添加剂和 10 ng/ml EGF 的基础胶质细胞培养基。将细胞培养瓶置于培养箱中平衡（最长 3 小时）。

解剖

  1. 我们按照欧洲联盟指南进行小鼠实验，实验方案已获本机构动物护理与使用委员会批准。
  2. 解剖一只P5-P7小鼠的大脑，按2.5节所述方法分离双侧半球的海马和脑膜。
  3. 解剖前额叶皮层，将其切成若干小块，收集至含有HBSS的1.5 ml离心管中。将离心管置于冰上保存，并立即进行细胞培养操作。

细胞培养

  1. 使用火焰抛光的玻璃移液管将管中所有组织转移至15 ml离心管中。
  2. 加入基础培养基至终体积5 ml，用火焰抛光的玻璃移液管反复吹打数次以解离组织。在300 × g条件下离心3分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于5 ml基础培养基中。
  3. 重复步骤3.5两次。
  4. 第三次离心后，将细胞沉淀重悬于2 ml含B27（1:50）和10 ng/ml EGF的基础胶质细胞培养基中。
  5. 再次吹打混匀，将细胞悬液转移至预先准备好的T75细胞培养瓶中，培养3–4天。

胶质细胞的洗涤（培养3-4天后）：

  1. 用 10 ml PBS 洗涤细胞一次，并用手用力轻敲或轻轻拍打培养瓶数次，同时用另一只手牢牢握住培养瓶。此步骤可去除培养物中的细胞碎片和细胞团块。
  2. 吸除 PBS，加入含有 B27（1:50）和 10 ng/ml EGF 的新鲜基础胶质细胞培养基。继续培养 5–7 天，直至细胞达到 80% 汇合度。

胶质细胞的传代、转导及最终接种：

  1. 用 100 μl 多聚赖氨酸（储存液：0.1%，用 PBS 或 HBSS 稀释 1/50 至 20 μg/ml）包被 10 mm 盖玻片，于培养箱中孵育过夜。用 HBSS 洗涤盖玻片三次，加入 100 μl 基础胶质细胞培养基。将盖玻片在培养箱中平衡 3 小时。
  2. 用 10 ml PBS 洗涤胶质细胞两次，吸除 PBS，加入 3 ml 胰蛋白酶（TrypLE，未稀释）。消化细胞最多 1 分钟。注意：避免过度消化。通常 1 分钟后超过 80% 的细胞已脱落，这足以获得数百万个健康细胞。
  3. 加入 10 ml 基础胶质细胞培养基终止反应，将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，以 300 × g 离心 3 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 ml 基础胶质细胞培养基中。
  4. 再次按照步骤 3.15 所述进行离心和吸除，然后将细胞重悬于 5 ml 基础胶质细胞培养基中。
  5. 将所需数量的细胞转移至 1.5 ml 离心管中。每张 10 mm 盖玻片使用 104–2×104 个胶质细胞即可。通常，用于转导一个 4 孔板的细胞悬液体积少于 200 μl。向细胞中加入适量的慢病毒 TED 表达载体颗粒，在室温下孵育 10 分钟。然后用基础胶质细胞培养基补足至接种体积（每张盖玻片 100 μl）。
  6. 每张盖玻片接种 100 μl 感染后的细胞，孵育约 2 小时，然后加入含 B27（1:50）和 10 ng/ml EGF 的基础胶质细胞培养基，终体积为 2 ml。
  7. 为获得理想的培养条件，建议在铺板后第 3–7 天使用细胞进行实验。

4. 报告细胞系的构建与培养

基于HeLa、BHK21、Hek293和SH-SY5Y细胞建立了TED报告细胞系。本文提供了HeLa细胞的实验方案，但该方案也可适用于其他任何细胞系。

稳定 HeLa 细胞系的建立

  1. 将野生型 HeLa 细胞系分装，取 100,000 个细胞以 200 μl 体积转移至 1.5 ml 离心管中。
  2. 向离心管中加入适量的慢病毒 TED 表达载体颗粒，在室温下孵育细胞-病毒悬液 10 分钟。然后将细胞接种至 30 mm 培养皿中，总体积为 2 ml 培养基（DMEM，10% FCS，1% 青霉素/链霉素），孵育 3 天。
  3. 用 PBS 洗涤一次后，吸除培养基，加入 500 μl 胰蛋白酶（TrypLE，PBS 中按 2:3 比例稀释）。孵育约 3 分钟，随后加入 3 ml 培养基终止反应。将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，以 400 × g 离心 3 分钟。
  4. 用 200 μl 培养基重悬细胞沉淀，并按照步骤 4.2 所述方法再次用慢病毒颗粒感染细胞。然后将细胞接种至 T25 培养瓶中，加入 10 ml 培养基。
  5. 培养细胞至融合度达到 60–80%，随后进行传代。

TED 报告基因细胞系

  1. TED 报告细胞系可在任何标准培养基中维持培养， 例如 使用含5%或10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。
  2. 在含有无菌10 mm盖玻片的4孔板中接种适量细胞（见上文）， 例如 每盖玻片 10,000 至 20,000 个细胞
  3. 在用于TED成像前，至少培养细胞两天。

5. 倒置显微镜下活体成像实验的准备工作

    1. 将 HEPES-Ringer 预热至室温，并加入 D-葡萄糖。
    2. 将 ACSF（不含 Ca2+ 和 Mg2+）预热至室温，并加入 D-葡萄糖。用含碳混合气（carbogen）充气 5 分钟。然后加入 1 M 的 CaCl2 和 MgCl2 储存液，使终浓度均为 2 mM。
  2. 启动活细胞成像显微镜及所有计算机程序。
  3. 在“模拟”成像腔室上启动灌流，并平衡管路系统。
  4. 预热显微镜载物台上的管路加热器和成像腔室。将成像腔室固定在加热装置中。
  5. 在开始染料加载程序前，将系统平衡至 32–37 °C。注意：为防止灌流液意外流入显微镜系统，我们使用发圈缠绕物镜，并使用弹性硅胶片（1 mm 厚）保护显微镜载物台。

6. 任一细胞类型的染料加载

  1. 将1份Fluo5N-AM（见1.3）重悬于100 μl预热的成像溶液（HEPES-Ringer或ACSF）中。
  2. 在水浴超声仪中，将 Fluo5N-AM 溶于成像溶液（HEPES-Ringer 或 ACSF）中，超声 90 秒。
  3. 使用新的4孔或24孔板，将400 μl预热的成像溶液转移至一个孔中。向同一孔中加入染料溶液，使总体积达到500 μl，染料终浓度为5 μM。
  4. 小心地将带有细胞的盖玻片放入例如。 直径为10-18 mm，细胞朝上置于孔中。
  5. 在37 °C的细胞培养孵育器中孵育适当时间（同时在显微镜阶段准备成像设置）。典型的染料负载时间：神经元和胶质细胞为7-15分钟，细胞系为10-20分钟。

至关重要：染色剂负载时间与染色剂浓度取决于细胞类型、细胞密度以及特定实验的需求！在染色剂存在下孵育时间过长可能会损伤细胞，特别是原代神经元和原代胶质细胞，这对细胞响应生理刺激的能力尤为关键。长时间孵育（例如 30 分钟）仅适用于内质网钙定位实验，以研究钙在微小亚细胞结构（例如 细小的神经突或树突棘）中的分布。在某些实验中，将 1/3 培养基与成像溶液混合可能有助于在 Fluo5N-AM 负载过程中保护细胞。

  1. 立即转移盖玻片至另一含有成像溶液（HEPES-Ringer 或 ACSF）的细胞培养孔中，并开始将细胞装入成像室。

7. 使用倒置激光扫描共聚焦显微镜进行内质网钙离子活细胞成像

  1. 使用画笔将高真空润滑脂涂抹于成像室。该润滑脂用于将盖玻片固定在灌流室底部。我们使用自制的适用于10-12 mm盖玻片的小体积成像室，从而实现高达每分钟15倍缓冲液更换的高灌流速度。适用于18 mm盖玻片的商用灌流室可从Warner Instruments公司（型号RC-49FS）购买。该室还可实现对神经元的场刺激。
  2. 用镊子夹取载有Fluo5N标记细胞的盖玻片，并在细胞上滴加少量成像溶液（50–100 μl），以保持细胞始终被成像溶液覆盖。将盖玻片翻转，使细胞朝下装入成像室中。使用棉签（例如 Q-tips）轻压盖玻片，使其嵌入硅胶密封圈内。
  3. 用棉签擦拭玻璃盖玻片底部残留的缓冲液。注意：若使用高数值孔径的油镜进行高分辨率成像，需小心擦除残留水分。残留盐分最好用水清除。若不慎沾上润滑脂，可用丙酮或纯乙醇去除。
  4. 将“空白”成像室更换为实验用成像室。通过持续灌流对细胞清洗5–10分钟。
  5. 通过持续灌流对细胞清洗5–10分钟。
  6. 在细胞筛选过程中，应使用最低限度的激光照射、高扫描速率（2–4 Hz）、小图像尺寸以及高增益设置。
  7. 注意：在筛选Fluo5N标记的细胞时，避免使用过强光照或直接使用落射荧光照明。强光照射Fluo5N/Ca2+复合物可在2–4秒内导致内质网特异性荧光完全丧失（图5）。
  8. 根据实验设计设置显微镜参数。为便于参考，不同TED载体成像的代表性设置见表1。对于倒置激光扫描共聚焦显微镜，我们采用Olympus IX81显微镜，配备Fluoview 1000共聚焦系统，该系统包含二极管激光器（473 nm，15 mW；559 nm，20 mW）和光谱检测器系统。
  9. 实验开始时，通过高分辨率的x,y-z图像序列记录目标细胞。
  10. 进行x,y-t成像，以在特定实验条件下监测内质网钙动态变化。本系统的典型设置列于表2中。
  11. 在持续灌流成像溶液的条件下监测内质网钙的变化。典型的缓冲液更换速率示例如下：（a）通过SERCA抑制实现细胞清洗和钙库耗竭：1.5 ml/min；（b）ATP/DHPG刺激：3 ml/min。
  12. 优先以12位（4096灰度级）采集数字图像。若需同时成像Fluo5N/Ca2+和RFP，可采用8位图像（256灰度级），以避免系统数据溢出。
  13. 将活细胞时间序列图像（x,y-t）或三维图像序列（x,y-z）（用于显示Fluo5N/Ca2+复合物的细胞内分布）以ImageJ兼容格式（例如 tiff）存储。

8. 图像处理与数据分析

  1. 在 ImageJ 程序中打开图像堆栈。如果进行多色成像，当 ImageJ 提示时，拆分 RGB 通道。
  2. 通过仔细检查图像序列来确定你的感兴趣区域（ROI）例如 借助强度随时间变化图）
  3. 使用时间序列分析插件读取感兴趣区域（ROI）中的平均像素强度（F原始）。根据实验目的，可围绕整个内质网（ER）或内质网的小区域绘制感兴趣区域（ROI） 例如 外周细胞区域树突的内质网。同时在无细胞区域选取1-3个感兴趣区域（ROI）用于背景扣除。
  4. 计算平均背景荧光（Fb) 通过计算背景感兴趣区域（ROI）的平均荧光值，并从荧光值 F 中减去背景值b 来自 F原始 值得以获得 F 值感兴趣区域 值
  5. 计算 F0通过计算每个 ROI 在静息状态下十到三十个荧光值的平均值，确定细胞的基础荧光。
  6. 通过 ΔF/F 计算荧光强度的背景校正后相对变化0 由以下公式计算：

用于光学分析、ROI 强度计算的荧光变化公式 ΔF/F₀。

  1. 以 ΔF/F0 为纵轴，时间为横轴，绘制荧光相对变化的曲线图。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案提供了一种非侵入性方法，用于直接成像游离的内质网钙离子。在靶向内质网的重组酯酶酶活性的帮助下，低亲和力合成型Ca2+指示剂被释放并滞留在内质网腔内。通过改进Ca2+指示剂染料在内质网腔内的负载效率，可实现对内质网钙库动态的直接且快速的成像。

用于TED的细胞类型

该方法的可行性已在BHK21、HEK29334、HeLa17、SH-SY5Y细胞系、培养的星形胶质细胞8,40以及原代海马和皮层神经元8,34,41中得到验证。在我们的实验中，当TED构建体通过自失活慢病毒载体37,39稳定表达时，TED效果良好，优选使用相对较弱的启动子（例如泛素启动子）35。其他更强的启动子正在研究中。

TED 标记的内质网特异性

使用Fluo5N成功进...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来的多篇出版物已广泛讨论了TED方法的优缺点34,35。与其他上述方法相比，TED避免了细胞破坏和灌注的问题。此外，需要强调两个方面。用于ER钙成像的TED原理要求：（1）借助TED载体构建体，实现羧酸酯酶在内质网腔内的靶向表达；（2）在内质网腔内高效且优先释放对钙离子亲和力较低的合成AM酯类荧光染料。

1. TED 载体构建

图3 总结了TED载体构建体的开发过程。TED基于CES家族蛋白（EC 3.1.1.1）开发而成。这些蛋白是内质网腔内的常驻成员。对于 体外 研究表明，重组CES蛋白的施用在蛋白稳定表达后或病毒介导的中等水平表达后效果最佳。目前尚不清楚其他具有酯酶活性的蛋白是否可替代CES蛋白用于TED成像。不建议使用TED载体的瞬时转染进行动态内质网钙分析，因为细胞在转染操作后反应性降低。CES蛋白需要正确定位于内质网腔，这一过程依赖内质网信号肽的有效切割。此外，CES蛋白在内质网腔内的滞留与回收由其氨基末端的KDEL样基序介导。当瞬时转染T...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）BL567/3-1 项目和弗里德里希-鲍尔基金会（Friedrich-Baur-Stiftung）的资助。我们衷心感谢加利福尼亚大学圣地亚哥分校霍华德·休斯医学研究所实验室的 Roger Y. Tsien 提供 Tag-RFP-T2。我们诚挚感谢加利福尼亚理工学院（California Institute of Technology, Pasadena）的 David Baltimore 和日内瓦大学（University of Geneva, Geneva）的 Didier Trono 提供慢病毒质粒 FUGW 以及 psPAX2/pMD2.G。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(S)-3,5-二羟基苯基甘氨酸（Dihydroxyphenylglycine）Tocris0805
5'-ATP-Na2，三磷酸腺苷二钠盐水合物SigmaA26209-1G
B-27添加剂，50倍浓缩液Invitrogen17504-044
氯化氨甲酰胆碱（Carbachol）SigmaC4382-1g
环匹阿酸（CPA）Ascent scientificAsc-300
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD2650
含谷氨酰胺/谷氨酰胺替代物的DMEMInvitrogen-Gibco31966-047
不含 Ca/Mg 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液 1x聚丙烯酸H15-002
胎牛血清Invitrogen-Gibco10270-106
Fluo-5N-AM，10 x 50 μgInvitrogenF14204
谷氨酸Ascent 科学Asc-049
GlutamaxInvitrogen35050-038
Ham's F12营养混合物Invitrogen-Gibco21765-029
不含钙、不含镁、含酚红的汉克平衡盐溶液（1×），HBSSPAA LaboratoriesH15-010
马血清SHD3250YK线性
Ionomycin Ca2+ 盐Ascent scientificAsc-116
小鼠EGF PreproTech315-09
N2补充剂 100倍浓缩液Invitrogen17502-048
Neurobasal 培养基Invitrogen-Gibco21103-049
Pluronic F127，低紫外吸收，2 gInvitrogenP6867
聚-DL-鸟氨酸氢溴化物 PORNSigmaP8638
聚-D-赖氨酸氢溴化物SigmaP7280
聚-L-赖氨酸SigmaP2636
ThapsigarginCalbio combust586005-1mg
TryLE ExpressInvitrogen12605-028
胰蛋白酶沃辛顿LS-003707
大豆胰蛋白酶抑制剂SigmaT6522
<强>材料
共聚焦系统：倒置激光扫描显微镜：FV1000 配 IX81Olympus用户特定配置
共聚焦系统：激光合束器FV10及二极管激光器（405、473、559、635）Olympus用户特定配置
共聚焦系统：配备光谱检测器的扫描头 FV10-SPDOlympus用户特定配置
加热器控制器 TC-344BWarner Instruments64-0101控制在线溶液加热器
NIH ImageJ 软件WS Rasband，ImageJ，美国国立卫生研究院 http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
目标：UAPON20XW340 NA 0.7 WD 0.35OlympusN2709100
目标：UPLFLN40XOOlympusN1478700
目标：UPLSAPO60XO/1.35，WD=0.15OlympusN1480700
灌流室，倒置定制
灌流室，RC-49FSWarner InstrumentsW4 64-1709
灌注管：PT-49Warner Instruments64-1730用于灌注
蠕动泵 MiniPlus 3（4 通道）Gilson未提供灌流泵
单通道在线溶液加热器 SH-27BWarner Instruments64-0102由加热控制器控制
吸液管：ST3RWarner Instruments64-1407用于灌注
加热模块：Tempocontrol 37-2 数字双通道Pecon未提供

参考文献

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