一种小鼠肺部插管的简易方法

摘要

本文介绍了一种简单高效的气管插管方法，可用于小鼠肺功能测定或肺部灌注，且允许小鼠在术后恢复并进行后续研究。该操作使用一种廉价的光纤光源，可直接照亮气管。

摘要

一种用于肺功能测量的小鼠插管简易方法，在动物数量有限或动物成本较高的纵向研究中具有多项优势。目前该方法未能更常规应用的原因之一在于其操作相对困难，尽管已有若干已发表的研究描述了实现该操作的方法。本文中，我们展示了一种可消除插管主要障碍的技术，该障碍即在插管全程中难以观察气管。该方法采用直径0.5 mm的光纤光源，作为引导工具将插管导管引入小鼠气管。我们证明，利用此方法可在数周以上的时间进程中对单个小鼠进行肺力学测量。该技术的建立所需成本和专业技能较低，且经过相对较少的培训即可常规实施。这使得任何实验室均可常规开展此类插管操作，从而能够在单个小鼠上进行纵向研究，以每只小鼠自身作为对照，减少所需实验动物数量，并提高统计效能。

引言

1999年，Brown 等发表了一篇论文，描述了一种小鼠肺部插管的方法¹。该技术在纵向研究中对单个小鼠重复进行肺功能检测或支气管肺泡灌洗具有重要应用价值²。自该原始论文发表以来，已有若干其他研究报道了不同的小鼠插管方法^3-9。尽管这些方法均可成功使用，但通常需要大量培训或较高成本。此类插管操作的主要问题之一在于：当插管导管接近气管准备插入时，导管本身会遮挡光线，从而阻碍对目标位置的观察。因此，在最关键的时刻，插管操作实际上处于盲视状态。本文介绍了一种简单且低成本的方法，可有效解决这一视野受阻问题，从而在无需大量培训或经验的情况下确保插管成功。

方案

1. 准备操作

必须首先获取并准备好以下物品：

1. 导管。 对于20–35 g小鼠的插管，我们使用长度为1或1.5英寸、20号的静脉留置针（BD Insylte，Sparks，MD 或 Jelco Optiva，Carlsbad，CA）。每只小鼠可使用新的无菌留置针，但留置针亦可在70%乙醇中浸泡过夜消毒后重复使用。尽管小鼠的咽部和气管并非无菌环境，但仍应遵循适当的清洁操作规程，包括使用无菌手套和无菌器械。
2. 光纤电缆。 我们使用 ≈来自 Edmund Optics 的 70 cm 长、0.5 mm 直径的光纤，但长度并非关键。重要的是确保光纤端面经过抛光处理，因为使用剃刀将光纤切割至所需长度后，其端面会较为锋利，容易刺穿气管壁。然而，可通过手持光纤末端约 2 cm 处，使光纤尖端边缘在 1,000 目砂纸上轻轻画小圆圈数秒钟，即可轻松完成端面抛光（参见视频演示及 Macdonald 的图 1）。 等 ¹⁰）。另一端穿过橡胶塞。最简便的方法是先将一根18号针头穿入橡胶塞，再将光纤通过针头的孔道插入，随后抽出针头。橡胶塞连接至一个150瓦的卤素光源（例如 NCL-150、Volpi USA 或任何其他光源（即使功率低于 150 瓦）。必须确保使用硅橡胶（或其他耐热材料）制成的塞子，因为普通橡胶或软木塞在靠近高温光源时可能燃烧。

2. 进行插管操作

1. 参见 图1和图2将光纤插入一段较短的硅胶管中（≈0.8 mm 内径 × 4 mm 外径，Cole-Palmer，EW-96410-13）。将橡胶管绑得较紧，同时仍允许光纤电缆进行调节。将硅胶管紧密插入套管的鲁尔端，以固定光纤电缆在套管内的位置。调节光纤电缆的位置，使其穿过套管延伸出去 ≈套管尖端前 4 mm 处
2. 将麻醉后的小鼠用上门齿悬挂在垂直支架上图3）。大多数研究者发现，将小鼠腹侧朝向自己时视野最佳。非常轻柔地拉出舌头并用拇指和食指夹住，中指置于颈部与塑料支撑物之间。用拇指和食指牵引舌头以打开口腔，同时用中指抵住颈部后方调整头部角度，以拉直插管路径，如图所示。 图3.
3. 使用光纤电缆作为光源和导入器，将其穿过可视的声门。如果声门不可见，以中指作为支撑，轻轻用力向后牵拉舌头。插入后，推进导管 ≈5 毫米。然后， 小心操作，避免移动套管。 撤出光纤电缆。将小鼠放倒，用胶带固定套管，并将套管接头支撑在一块油泥（雕塑黏土）上，如图所示。 图4.
4. 第3步中的操作不易教授甚至难以演示，因为这是一个单人操作。然而，通过轻微调整对舌头的牵引力以及头部后方的支撑，几乎所有尝试者很快都能找到正确的位置，以观察小鼠的声带。

结果

作为对本方法的评估，我们使用了四只20周龄的雄性BALB/c小鼠，其平均体重（± 标准误）为27.7 ± 0.40 g。实验连续进行五周，期间采用先前描述的系统测量肺阻力¹¹。每只小鼠通过腹腔注射生理盐水配制的氯胺酮（100 μg/g 体重）和赛拉嗪（15 μg/g 体重）进行麻醉。随后按照上述方法进行气管插管。如果对导管是否进入气管而非食管存在疑问，可使用一个小的牙科镜进行验证。将牙科镜保存在冷冻环境中，使用时将其置于导管鲁尔接头前方。若导管位于气管内，呼出的气体将在镜面上形成可见的冷凝水雾。

插管后，我们将小鼠连接至呼吸机并测量气道阻力。小鼠的通气频率为 2 Hz，潮气量为 0.2 ml，呼吸阻力采用先前描述的吸气阻断法进行测定¹¹。图5展示了每只小鼠在连续5周内的测量结果。数据重复性良好，表明至少以每周一次的间隔进行测量时，先前的测量对后续结果无影响。这一结果与既往在BALB/c小鼠中进行的每周机械力学和支气管肺泡灌洗（BAL）细胞谱型评估结果一致，而既往研究采用的方法更为复杂且可能具有创伤性

讨论

此处所述方法具有多项优势。首先，该装置结构简单且相对经济。装置的制备无需任何特殊工具或昂贵设备。使用导管作为光源，可确保在引导器接近气管开口时始终能观察到气管开口的位置。采用0.5 mm的引导器也有助于在初次插入时尽量减少因插入较大套管可能造成的创伤。需要指出的是，类似光学探针可从商业供应商处获得（Braintree Scientific, Braintree, MA）。其设备采用电池供电的光源和光纤。

在本研究中，我们通过重复测量肺力学参数来验证该操作流程，但这种气管插管方法同样可用于向肺内灌注化学物质或细胞，正如已有文献报道的脂多糖（LPS）重复给药方法¹²。此外，先前一项采用较原始插管技术的研究曾描述可在单只小鼠中重复进行支气管肺泡灌洗（BAL）²，而采用本研究提出的新插管方法将能更简便地实现这一操作。

在实际应用中，该方法已成功教授给从未尝试过插管的进修人员、学生和技术人员。事实上，在集体培训过程中，部分学生在熟练掌握后，甚至能够转而指导其他尚未尝试该操作的同学。因此，该方法...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
插管套管	BD Insylte, Sparks, MD 或 Jelco Optiva, Carlsbad, CA		1 英寸长，20 号静脉（IV）导管
光纤电缆	Edmund Optics, Barrington, NJ	#NT02-542	约 2 英尺长的 0.5 毫米光学纤维（通信级塑料光纤）。插入气管的一端应进行轻微圆化处理：将光纤末端约 ≈2 cm 处固定，然后在 1000 目砂纸上轻轻拖动尖端并做小圆周运动数秒。
光源	Volpi	NCL-150	尽管我们使用 150 W 卤素光源，但任何等效光源（即使功率低得多）均可使用。
铝管			外径 1 英寸，壁厚 1/16 英寸。可能需要根据所用光源调整尺寸。
橡胶塞			4 号橡胶塞适用于 1 英寸管。
小型硅胶橡胶管	Cole-Palmer	EW-96410-13	一段长约 ≈1.5 cm 的硅胶橡胶管（内径 0.8 mm，外径 4 mm）
倾斜支撑架			我们的支撑架由有机玻璃制成，但任何可固定线或金属丝以将近乎垂直角度固定小鼠的材料均可使用。