评估神经退行性表型 黑腹果蝇 通过攀爬实验和全脑免疫染色检测多巴胺能神经元

摘要

本文介绍了两种已建立的实验方法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）中多巴胺能（DA）神经元随年龄增长而发生的神经退行性变化：攀爬/惊吓诱导的负向趋地性实验，可用于研究DA神经元功能退化的效应；以及酪氨酸羟化酶免疫染色，用于在全脑制片中识别并计数DA神经元。

摘要

Drosophila melanogaster 是研究神经系统衰老及病理性退行性过程的重要模式生物。果蝇作为实验系统具有诸多优势，包括遗传操作简便、生命周期短，以及能够观察并进行复杂行为的定量分析。通过在 Drosophila 大脑特定神经元群体中表达与疾病相关的基因，可用来模拟帕金森病和阿尔茨海默病等人类神经退行性疾病⁵。

多巴胺能（DA）神经元是人类大脑衰老过程中最易受损的神经元群体之一。在帕金森病（PD）——最常见的神经退行性运动障碍疾病中，DA神经元的加速丢失导致运动功能进行性且不可逆地下降。除了年龄和环境毒素暴露外，多个基因编码区或启动子区域的特定突变会进一步加剧DA神经元的丢失。这些与PD相关的等位基因的鉴定为以下研究提供了实验基础 果蝇 作为研究多巴胺能神经元神经退行性的模型 体内例如，在帕金森病相关的模型中表达人源α-突触核蛋白基因 果蝇 多巴胺能神经元重现了人类疾病的某些特征， 例如 多巴胺能神经元进行性丢失及运动功能下降 ²因此，该模型已成功用于识别帕金森病（PD）中潜在的治疗靶点。 ⁸.

本文介绍了两种常用于研究果蝇（Drosophila）中多巴胺（DA）神经元年龄依赖性神经退行性变的实验方法：一种是基于惊吓诱导的负向趋地性反应的攀爬实验，另一种是对成年果蝇完整脑组织进行酪氨酸羟化酶免疫染色，以监测不同年龄时DA神经元的数量。在这两种方法中，均可利用酪氨酸羟化酶（TH）启动子驱动的Gal4品系（TH-Gal4）特异性地在DA神经元中实现UAS转基因的体内（in vivo）表达^{3, 10}。

引言

本实验方案的特异性依赖于使用一种Gal4果蝇品系，该品系利用酪氨酸羟化酶基因的调控序列，实现多巴胺能神经元中的特异性表达。 ³酪氨酸羟化酶催化多巴胺合成的首个且限速步骤。在成年果蝇脑中，酪氨酸羟化酶（TH）的免疫反应性与多巴胺的分布重叠，因此TH是鉴定多巴胺能神经元的良好标志物。 体内 （例如参见 ⁶此外，THGal4 的表达模式比其他 Gal4 品系（如 DdcGal4）更具特异性。DdcGal4 包含来自多巴脱羧酶基因的调控序列，可在多巴胺能神经元中驱动转基因表达，同时也可在5-羟色胺能神经元及部分胶质细胞亚群中驱动表达。 ³.

Feany 和 Bender（2000 年）首次发现，在 Drosophila 中广泛表达与帕金森病（PD）相关的的人源 α-突触核蛋白基因会加速惊吓诱导的负向趋地性行为的进行性丧失。我们使用多巴胺能神经元特异性的 THGal4 品系驱动 α-突触核蛋白转基因的表达，也观察到了类似的结果¹⁰，并利用这一功能性表型读数来研究 Nrf2 通路在此帕金森病 Drosophila 模型中的神经保护作用¹⁴。本文所述的具体实验方法改编自文献²和³。

Drosophila 大脑包含超过 100 个多巴胺能（DA）神经元，这些神经元至少分为 5 个不同的簇（PPL1、PPL2、PAL、PPM1/2、PPM3），可通过共聚焦显微镜在完整脑组织切片中观察到（例如参见¹¹和⁷）。目前仍存在争议的是，Drosophila 大脑中 DA 神经元的数量是否会随年龄增长而减少^{9, 11}；然而，在果蝇中模拟人类疾病的帕金森病（PD）相关基因发生突变或过表达时，可观察到与年龄相关的神经退行性变⁵。在 DA 神经元中表达人类 α-突触核蛋白即具有此类效应，因此已被用作帕金森病的模型。本文中，我们描述了一种利用酪氨酸羟化酶（TH）作为细胞标记物，在完整脑组织切片中对 DA 神经元进行计数的检测方法。该方法改编自文献¹³和¹⁰。

方案

1. 惊吓诱导的负向趋地性实验

1. 选择所需基因型的果蝇，按性别分离，随机分为每组20-30只的群体，每2-3天更换至新的培养管中；每组果蝇均进行测试（即 年龄匹配的队列（每个基因型一个队列），每周至少一次。
2. 负向重力趋性测试前30分钟，用CO₂麻醉果蝇₂ 并将它们放入预先标记的透明塑料管中，该塑料管由两个空的食物瓶制成（参见 材料表）在其开口处用透明胶带连接（腔室尺寸：19 cm × 2.85 cm）。在我们的实验中，通常每管使用25只果蝇。
   注意。 麻醉恢复时间可能从几分钟到几小时不等（例如 过夜（O/N）孵育时间应根据所测试的具体基因型进行优化。
3. 在一张吸水纸上标记不同高度（从1到20 cm），并将该纸用胶带固定在垂直于实验台的垂直表面上。
4. 将试管置于纸张前方：所有试管应排列整齐，并尽可能靠近纸张，以便准确测量高度。
5. 将数码相机（参见 “特殊设备”表格) 在支架上，距离纸张20-30厘米处，置于试管前方例如 选择“movie”选项并开始录制；此时还应启动计时器，以记录连续试验之间的时间间隔。
6. 轻轻敲击试管数秒，使果蝇聚集到试管底部（例如 10 秒）。此步骤应始终保持一致（即 整个实验过程中保持相同的持续时间、相同的强度和相同的操作者。
7. 用数码相机记录果蝇的运动，持续10秒。
8. 以1分钟间隔重复步骤1.5至1.7，共十四次。
9. 分析数据：
   1. 通过目视检查录制的视频，在10秒后统计位于2 cm标记线以上的果蝇数量。
      注意： 在我们的实验条件下，果蝇的负向趋地性行为在惊吓后并未持续超过前10秒。即 果蝇在受到惊吓后10秒开始向各个方向移动）。对照组果蝇爬行的最短距离为即 表达 THGal4 驱动子的 1 周龄果蝇，参见图注 图1在此时间窗口内，果蝇的爬行距离为 2 cm。因此，我们以 2 cm 标记作为参考，用于分析不同年龄和基因型果蝇在行为启动后 10 秒内的爬行活动。这些参数可能需要根据所测试果蝇的行为差异（例如由于不同的遗传背景或实验室条件所致）进行调整。需要注意的是，在我们的实验条件下，所有被测试的基因型果蝇的表现均差于或等同于对照基因型果蝇。
   2. 取十五次试验结果的平均值。
   3. 将平均值表示为试管中果蝇总数的百分比（= 爬行活动百分比）；重复次数（N）由重复实验的次数决定 独立队列 对每种基因型进行检测
   4. 评估不同基因型随时间变化的统计学显著性。这可以通过 Student's t 检验实现。 t 使用商业软件（如 GraphPad（GraphPad Software, Inc.，La Jolla, CA, USA））进行双基因型比较时采用 t 检验，或多组比较时采用双向方差分析（two-way ANOVA）并随后进行 Bonferroni 事后检验。

注意

我们所有实验均在每天的同一时间、室温下以及相同的光照条件下进行。建议将果蝇置于12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，以控制昼夜节律对果蝇运动行为的影响。

2. 全脑组织切片的酪氨酸羟化酶免疫荧光检测

溶液与缓冲液

固定液：磷酸盐缓冲液（PBS）中含4%多聚甲醛（PFA）

洗涤缓冲液：含0.1% Triton X-100的PBS

封闭缓冲液：0.1 M Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl，0.1% Triton X-100 和 0.5% BSA

封片剂：Mowiol-Dabco（参见 Harlow E, Lane D 所著《抗体——实验室手册》，冷泉港实验室出版社，美国纽约冷泉港，10:418 (1988) 中描述的方案）

实验步骤

1. 将果蝇放入盛有70%乙醇的解剖皿中约1分钟，以去除表皮蜡质。
2. 将果蝇转移至另一盛有冰冻PBS的解剖皿中。
3. 解剖脑组织：
   1. 将果蝇腹面朝上放置（可选：去除翅膀和足）。
   2. 将头部从身体上拉开：用一组镊子夹住身体，另一组镊子夹住眼下方的表皮，以防止损伤脑组织。
   3. 去除喙部。
   4. 用镊子夹住喙部移除后留下的裂口两侧的头壳，向相反方向拉扯，直至脑组织从头壳中完全取出。
   5. 彻底清除脑组织周围的表皮。
   6. 去除所有含空气的气管组织；这可防止脑组织在后续孵育步骤中漂浮。
4. 剪去P-200移液器吸头尖端几毫米，并用0.1% Triton X-100/PBS溶液平衡吸头。
5. 使用准备好的P-200移液器吸头，将脑组织转移至装有0.5 mL 4%多聚甲醛/PBS的0.5 mL离心管中，置于冰上直至解剖完成。
6. 在室温下固定脑组织20分钟：将离心管置于支架上，并将支架放在摇床上进行轻柔旋转。
7. 使用P-1000微量移液器去除固定液，加入0.5 mL 0.1% Triton X-100/PBS，轻轻颠倒混匀，孵育1分钟；重复此洗涤步骤一次。
8. 去除第二次洗涤的缓冲液，加入0.5 mL 0.1% Triton X-100/PBS，在室温下孵育20分钟；重复此步骤两次。
9. 去除洗涤缓冲液，将脑组织在封闭缓冲液（0.1 M Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl，0.1% Triton X-100 和 0.5% BSA）中于室温孵育1小时。
10. 在封闭液中加入1:100稀释的抗-TH抗体（见“特异性试剂表”），于4 °C孵育两天，并持续轻柔旋转（见步骤2.6）。
11. 重复步骤2.7和2.8的洗涤过程。
12. 在封闭液中加入1:200稀释的二抗，于4 °C孵育两天，并持续轻柔旋转。
13. 重复步骤2.7和2.8的洗涤过程。
14. 按图2A所示准备封片载玻片：
    1. 在盖玻片（24 × 60 mm，1.5号）上加入两滴25 μL封片介质。
    2. 在封片介质上放置两张盖玻片（18 × 18 mm，2号），中间留出间隙，然后使其干燥。
    注意：请检查共聚焦显微镜载物台上的样品 holder。可通过将一块22 × 22 mm的1.5号盖玻片用指甲油和胶带固定在末端，使盖玻片尺寸与25 × 75 mm载玻片相同。
15. 去除洗涤缓冲液，加入50 μL封片介质，通过上下吹打使脑组织与介质充分平衡。
16. 使用剪切过的P-200移液器吸头（见步骤2.4），将脑组织转移至两张盖玻片之间的空隙中，并用1.5号盖玻片覆盖（见图2A；如需定向脑组织，请参见⁷）。
    注意：样品被夹在两张盖玻片之间，以便观察脑组织的前侧和后侧。
17. 用封片介质完全填充两张盖玻片之间的空间；从一个角落开始加样以排除所有气泡；待其干燥后用指甲油密封。
18. 为评估特定簇中多巴胺能神经元的数量，使用共聚焦显微镜沿z轴采集一系列光学切片，步长为1.0 μm（有关成年Drosophila脑内多巴胺能神经元簇的解剖学鉴定，请参见⁷）。

结果

我们已采用此处描述的检测方法，在帕金森病（PD）的Drosophila模型中研究应激保护性Nrf2通路的作用¹⁴。该模型利用TH Gal4驱动子在多巴胺能（DA）神经元中表达人源α-突触核蛋白基因^{2, 10}。

图1展示了在TH Gal4驱动下表达不同转基因的雄性果蝇进行惊跳诱导的负向趋地性（爬行）实验的代表性结果。所有测试的基因型均表现出随时间推移运动活性下降；然而，表达与帕金森病相关的入类α-突触核蛋白转基因的果蝇相较于同龄对照果蝇（仅含TH Gal4驱动）或共表达Nrf2 DNA结合伴侣Maf-S的果蝇，其运动能力下降更为迅速。在雌性果蝇中也观察到类似结果。

图2展示了一项基于TH免疫荧光染色的多巴胺能神经元计数的代表性结果。图注中所述方法用于量化不同遗传背景对4周龄雄性果蝇脑内PPL1神经元数量的影响。请注意，在表达α-突触核蛋白的果蝇脑内，PPL1神经元出现虽小但具有显著性的丢失。

...

讨论

本文所述的检测方法为研究特定基因、信号通路或小分子化合物在衰老过程中以及不同疾病相关遗传背景下维持多巴胺能神经元中的作用提供了有效的手段（详见文献⁵）。

由惊跳诱发的负向趋地性行为 果蝇 已广泛用作评估不同遗传背景下多巴胺能神经元功能的功能性读数，特别是在存在帕金森病相关突变的情况下。不同研究之间已观察到一些差异（参见 ¹² （有关更详细的讨论，请参见正文）。这些差异至少部分归因于不同的实验设置和条件，包括每根试管中测试的果蝇数量（单只果蝇） 与 果蝇群体）在 CO 处理后的恢复时间₂介导的麻醉以及连续试验的次数（参见 ⁴ 和 ¹¹ 作为不同检测设置的示例）。因此，建议对这些参数进行控制，并在必要时根据特定检测需求进行优化。

通过TH免疫染色/共聚焦显微镜对多巴胺能神经元进行定量，可与基于THGal4驱动的GFP表达并通过GFP荧光/共聚焦显微镜识别多巴胺能神经元的方法互换使用。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
兔抗酪氨酸羟化酶抗体	Millipore	AB152
驴抗兔IgG抗体（TRITC标记）	杰克逊免疫研究实验室	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
<强>设备
聚苯乙烯小瓶	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
数码相机	佳能	PowerShot A3100IS（型号）	1210万像素 4倍光学变焦
1.5号玻璃盖玻片	VWR	48366 205 48393 252	尺寸：18 × 18 毫米，24 × 60 毫米
2号玻璃盖玻片	VWR	48368-040	尺寸：18 x 18 mm
解剖皿	电子显微镜科学公司	70543-01	尺寸：30 mm 外径
Dumostar 5号镊子	电子显微镜科学公司	72705-01
体视显微镜	卡尔·蔡司	Stemi 2000（型号）
共聚焦显微镜	Leica	SP2 或 SP5（型号）
<强>材料表