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原代大鼠髓质内集合管细胞培养

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DOI：

10.3791/50366

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2013年6月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

通讯作者： Enno Klussmann <enno.klussmann@mdc-berlin.de>

本文内容

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摘要

精氨酸加压素（AVP）通过促进肾集合管主细胞对水的重吸收，调控机体水平衡的精细调节。本文介绍一种适用于研究AVP介导的水重吸收分子机制的原代大鼠肾髓质内层集合管细胞的培养方案。

摘要

精氨酸加压素（AVP）通过促进肾集合管主细胞对水的重吸收，从而精细调节机体的水稳态。AVP 与主细胞表面的血管加压素 V2 受体（V2R）结合，诱导细胞内 cAMP 的合成。这会激活细胞信号通路，导致水通道蛋白-2（AQP2）的磷酸化状态发生改变。蛋白激酶 A 对 AQP2 进行磷酸化，从而触发 AQP2 从细胞内囊泡转位至细胞膜，促进原尿中水分的重吸收。若垂体释放 AVP 异常或主细胞中 AVP 激活的信号通路出现障碍，可分别导致中枢性或肾源性尿崩症；而血浆 AVP 水平升高则与慢性心力衰竭及抗利尿激素分泌不当综合征等心血管疾病相关。

本文介绍了一种原代大鼠肾髓质集合管（IMCD）细胞的培养方案，该细胞内源性表达V2R和AQP2。这些细胞适用于阐明调控AQP2的分子机制，从而发现治疗与精氨酸加压素（AVP）介导的水重吸收失调相关疾病的新型药物靶点。IMCD细胞来源于大鼠肾脏内髓质，接种后六至八天即可用于实验。IMCD细胞可在常规细胞培养皿、培养瓶以及不同规格的微孔板中培养，操作过程仅需数小时，适合标准细胞培养实验室开展。

引言

在肾集合管主细胞中，精氨酸加压素（AVP）通过促进水通道蛋白-2（AQP2）插入质膜，调控水的重吸收。AVP 与G蛋白偶联的加压素2型受体（V2R）结合，激活腺苷酸环化酶，从而促进cAMP的生成。该信号通路的启动导致蛋白激酶A（PKA）的活化。PKA在丝氨酸256位点（S256）对AQP2进行磷酸化，这是促使AQP2从细胞内囊泡重新分布至质膜的关键触发因素。膜上的插入使水能够顺着渗透梯度被重吸收，从而精细调节机体的水稳态。

由于精氨酸加压素（AVP）分泌异常或AVP激活的信号通路失调，导致AVP介导的水重吸收功能紊乱，可引起或与多种严重疾病相关。由V2R或AQP2基因突变引起的水重吸收减少会导致肾性尿崩症；而血浆AVP水平升高则与心血管疾病（如慢性心力衰竭）以及抗利尿激素分泌不当综合征（SIADH）中过度的水重吸收相关。

精氨酸加压素（AVP）介导的水重吸收的重要性不仅体现在其与疾病的相关性上。AVP诱导携带水通道蛋白2（AQP2）的囊泡向细胞膜转运并与其融合，这一过程是一种严格依赖cAMP的胞吐作用，目前尚未被充分阐明。其他依赖cAMP的胞吐作用实例包括肾脏中肾素的分泌以及胃中H+的分泌。因此，阐明肾集合管主细胞中调控AQP2转运的分子机制，不仅有助于理解其他细胞类型中类似的分子过程，还可能为治疗与AVP介导的水重吸收障碍相关疾病的新型疗法提供方向。

阐明调控 AQP2 的机制需要获取集合管主细胞模型。目前已有多种不同的哺乳动物肾细胞系可供选择，但这些模型存在若干缺陷。在许多细胞系统中，AQP2 蛋白表达水平较低（表1；M1、HEK293、COS-7、MDCK、LLC-PK1）1-10；另一些细胞则异位过表达人源（MCD4、WT10）11,12 或大鼠（CD8）13 的 AQP2。在 MCD4 和 COS-7 细胞中，V2 受体并不表达。据我们所知，目前尚无来源于肾髓质内层集合管（即 AQP2 表达最丰富的肾区）的永生化细胞系模型，现有模型多来源于皮质集合管1,11,13-16。此类细胞模型包括广泛使用的永生化 mpkCCD（例如17）以及近期建立的 mTERT-CCD14 细胞系。这两种细胞系均可内源性表达 AQP2 和 V2R，但由于它们来源于皮质集合管，其蛋白质组很可能与髓质内层集合管（IMCD）细胞不同，例如可能表达不同的 Na+ 转运系统。

本文介绍了一种原代培养内源性表达V2R和AQP2的肾髓质集合管（IMCD）细胞的实验方案。因此，该模型最接近肾脏集合管的生理状态。由于建立该培养体系仅需常规实验室设备，其他实验室可轻松采用此方法。

方案

1. 准备

  1. 准备培养皿
    1. 在 4 °C 下过夜解冻 IV 型胶原蛋白，并用 0.1% 无菌乙酸溶解。使用体积取决于接种细胞所用培养皿的类型和数量。使用量为 2 μg/cm2。
    2. 在室温下孵育培养皿至少 1 小时，并用蒸馏水（A. tridest）洗涤两次。
    3. 让培养皿充分干燥。
  2. 培养基的添加成分
    1. 通过向 500 ml 培养基中加入 1.75 g 葡萄糖，将葡萄糖浓度提高至 4.5 g/L。为将培养基调整至 600 mosmol，加入 100 mM NaCl 和 100 mM 尿素，分别使渗透压增加 200 mosmol 和 100 mosmol。
    2. 在配制当天，向 600 mosmol 的 DMEM 培养基中新鲜加入 1% 非必需氨基酸、1% Ultroser、500 μM DBcAMP、20 U/ml 制霉菌素和 0.25 μg/ml 庆大霉素（用浓度为 50 μg/ml 的储备液按 1:200 稀释）。
  3. 酶溶液
    1. 将 1 mg/ml 透明质酸酶和 2.2 mg/ml 胶原酶加入含 0.25 μg/ml 庆大霉素和制霉菌素的 DPBS 中。每消化 2 个肾脏内髓组织，准备 1 ml 该酶溶液。溶液需经滤膜除菌，并储存于 50 ml Falcon 管中。

2. 大鼠肾内髓集合管（IMCD）原代细胞的培养

所有动物操作程序均须遵守当地及联邦法律法规。

  1. 将大鼠置于充满 CO2 的密闭箱中进行 CO2 麻醉，或使用异氟烷（U-400 麻醉机，Univentor Ltd.，马耳他；气流速度为 350–400 ml/min，异氟烷浓度为 2–2.5%）。断头放血，以便准确识别苍白的内髓质与颜色较深的外髓质之间的边界。此外，放血可减少分离所得红细胞的数量。取出肾脏，并在冰上用含庆大霉素和制霉菌素的无菌 DPBS 冲洗（见上文）。所有后续操作均需在无菌超净工作台条件下进行。
  2. 将肾脏从 DPBS 溶液转移至无菌纱布上，以去除多余液体。使用无菌镊子和剪刀去除肾脏周围的脂肪包膜。
  3. 保持肾脏固定于纱布中，沿外侧（皮质侧）的纵轴稍偏位置进行切割。注意不要完全切断，应保留肾盂处相连，使组织保持完整。
  4. 使用弯头剪刀小心分离被玫瑰色光泽外髓质包围的苍白内髓质组织。将分离的内髓质收集至含有庆大霉素和制霉菌素的 DPBS 中，并置于冰上的 60 mm 培养皿内。
  5. 待所有内髓质组织均被分离并收集于冰上后，减少 DPBS 体积，使液体刚好覆盖组织。使用无菌剃刀片将内髓质切成 5 mm3 的小块。
  6. 将无菌巴斯德吸管的尖端短暂置于火焰中熔化并打磨圆滑。确保吸管冷却后再进行后续操作。
  7. 使用打磨圆滑的巴斯德吸管将组织悬液转移至含有新配制的无菌酶解液（含透明质酸酶和胶原酶，见步骤 1.3.1）的 50 ml Falcon 管中。盖紧管盖，在 37 °C 水浴摇床中以 220 rpm 持续振荡孵育 1.5–2 小时。
  8. 为进行吹打分散，使用圆头巴斯德吸管（见上文）将混合液反复吹吸数次，直至悬液呈现均匀浑浊状态。
  9. 将悬液在 300 × g 条件下离心 5 分钟，温度为 16 °C。弃去上清液，将沉淀物用含庆大霉素和制霉菌素的 DPBS 充分重悬后再次离心。重复该洗涤步骤一次。
  10. 将细胞重悬于完全补充的培养基中，并接种至培养皿和/或微孔板中。每 2 个内髓质组织（来自 1 只动物）所获得的细胞数量足以接种一个 60 mm 培养皿。
  11. 接种 24 小时后，用 600 mosmol DMEM 洗涤细胞两次，并更换新鲜培养基。在接下来的一周内应洗涤细胞 2–3 次（图 1）。接种后 6–8 天，可将 IMCD 细胞用于实验。请注意，在开始实验前 24 小时，需更换为不含 DBcAMP 和制霉菌素的培养基，否则 AQP2 将仅定位于细胞质膜。

结果

原代大鼠IMCD细胞成功培养后，接种6-8天即可形成融合的单层细胞（图2）。每个60 mm培养皿中约含有6 × 106个细胞。由于培养皿预先包被了作为基底膜成分的IV型胶原蛋白18，细胞可牢固贴附于培养皿表面，因此即使经过多次彻底的洗涤操作，IMCD细胞也不会脱落。培养的细胞中最多有80%内源性表达V2R和AQP2，这些为集合管主细胞；而不表达AQP2的细胞则被认为是闰细胞，或来源于亨利袢细段、直小血管或髓质内间质细胞的非IMCD细胞。如我们先前所述，600 mosmol的培养基渗透压可防止AQP2的下调19。此外，通过在培养基中添加膜通透性cAMP类似物DBcAMP，可维持AQP2的表达。为了降低AQP2在细胞膜上的表达水平，从而促进其在细胞内的定位，IMCD细胞在实验前应于不含DBcAMP的条件下培养约24小时。若在对照条件下大部分AQP2仍定位于细胞膜，则应延长无DBcAMP培养的时间。使用标准缓冲液裂解60 mm培养皿中生长的细胞，可获得约1.5 mg蛋白质10。

在给予精氨酸加压素（AVP）或腺苷酸环化酶直接激活剂佛司可林进行短期刺激（30 分钟）后，水通道蛋白 2（AQP2）会从细胞内囊泡转位至质膜（图 2）。此外，IMCD 细胞中的 AQP2 表达水平在 AVP 或佛司可林刺激 30 分钟后也会上调（图 3）10。AQP2 表达量的增加与转录和翻译增强无关。佛司可林或 AVP 的刺激可抑制 p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK）的活性，从而导致 AQP2 蛋白第 261 位丝氨酸磷酸化水平降低，并减少其多聚泛素化修饰。因此，刺激条件下 AQP2 表达量的增加归因于蛋白酶体降解作用的减弱10。综上所述，IMCD 细胞可用于研究调控 AQP2 的分子机制。

细胞系生物体ATCC 编号或参考文献
CAKIHomo sapiensHTB-46
CD8Homo sapiensValenti et al., 199613
COS-7Cercopithecus aethiopsCRL-1651
HEK293Homo sapiensCRL-1573
LLC-PKISus scrofaCL-101
M1Mus musculusCRL-2038
MCD4Mus musculusIolascon et al., 200711
MDCKCanis familiarisCRL-2935
mpkCCDMus musculusBens et al., 199915, Hasler et al. 200216
mTERT-CCDMus musculusSteele et al., 201014
WT10Canis familiarisDeen et al., 199712

表1. 用于研究AQP2调控机制的哺乳动物肾细胞系。CAKI、mpkCCD和mTERT-CCD细胞内源性表达AQP2。在COS-7、HEK293、LLC-PK1、M1和MDCK细胞系中，AQP2几乎无法检测到。CD8、MCD4和WT10细胞则外源性过表达AQP2。

细胞培养时间线示意图：准备、培养、洗涤、开始实验、更换培养基。
图1. 建立IMCD细胞培养的流程示意图。图中显示了实验步骤的顺序以及建议进行实验的星期几。原代大鼠IMCD细胞在第0天接种，1周后可用于实验。括号中的数字对应“实验方案”部分所述的相应实验步骤。

细胞荧光显微镜图像；对照组、AVP、FSK条件；比较性蛋白表达分析。
图2. 在AVP或佛司可林刺激下，AQP2插入质膜。 IMCD细胞在对照条件下培养，或在37 °C下用100 nM AVP或10 μM佛司可林刺激30分钟。按照先前描述的方法（LSM 710；Carl Zeiss MicroImaging，德国耶拿）对细胞进行免疫荧光显微镜分析10。细胞核用DAPI染色，AQP2使用定制抗体（红色；抗体H27）检测20,21。上图：x-y扫描图像；下图：x-z扫描图像。比例尺：20 μm。

Western blot 分析；示意图；蛋白质表达；α-tubulin；AQP2 变体；utr、A、F 样品。
图 3. AQP2 蛋白丰度在血管加压素（AVP）和佛司可林刺激后增加。 将 IMCD 细胞保持未处理状态（utr），或分别用 100 nM AVP（A）或 10 μM 佛司可林（F）在 37 °C 下刺激 30 分钟。裂解细胞后，通过特异性抗 AQP2 抗体（sc-9882，SantaCruz）免疫印迹检测复合糖基化形式（AQP2 cg）、高甘露糖形式（AQP2 hm）以及非糖基化 AQP2（AQP2 ng），方法如前所述10。以 α-tubulin（CP06，Calbiochem）作为上样对照进行检测。图中展示的是来自 > 3 次独立实验的代表性结果。分子量已标出（kDa）。

讨论

我们提供了一种详细的原代大鼠IMCD细胞制备与培养方案。该方法可从一只大鼠获得最多21 cm2的细胞20。实验仅需标准的细胞培养设备，由单人操作约6小时内即可完成。因此，该方法适用于作为常规的实验室技术。

原代大鼠IMCD细胞可接种于不同规格的培养皿中，范围从96孔板到60 mm培养皿均可。然而，若需在384孔板中培养，则该操作流程需要优化。我们避免使用大于60 mm的培养皿，因为细胞生长速度会减缓。这些细胞适用于多种实验，如蛋白质印迹（Western blotting）、免疫共沉淀、DNA/RNA提取、免疫荧光显微镜检测、Ca2+成像以及电生理学实验10,22,23。

接种后约6至8天，原代IMCD细胞生长形成融合的单层细胞（图2）。细胞平均高度为3 - 5 μm24，细胞间紧密连接，并维持较高水平的内源性AQP2表达。AQP2的免疫荧光显微检测表明，多达80%的细胞为AQP2阳性的主细胞（图3；10,20）。这些细胞在形态上表现为长而笔直的细胞边界，细胞核嵌入细胞质中，含1至3个核仁，并有数个明显的细胞质颗粒20。培养物中剩余的20% AQP2阴性细胞的身份尚未明确界定。Maric 等通过相差显微镜和紧密连接的免疫荧光显微分析来观察细胞边界20。在AQP2阴性细胞中，他们观察到细胞边界呈弯曲状，并向邻近细胞形成凹陷和内陷结构，细胞核突出，含有一个核仁。基于与AQP2阳性细胞明显不同的形态特征，Maric 等推测大多数AQP2阴性细胞为闰细胞。此外，培养物中显然含有少量成纤维细胞20。只有当培养时间超过10天，这些细胞开始过度生长并取代主细胞时，其存在才变得明显。在我们的培养条件下，成纤维细胞并不呈现典型的成纤维细胞形态。与此一致，Gonzalzez 等在接种后5-8天的类似原代IMCD细胞培养物中也发现了间质细胞25。

其他实验室也使用制备方法略有不同但具有上述相似特性的原代IMCD细胞培养物。例如，Chou 等将原代IMCD细胞直接接种于未经胶原包被的塑料表面26。按照任一方案制备的原代IMCD细胞似乎均具有类似的高质量，例如两者均适用于细胞内Ca2+浓度测定22,23,26。通过Affymetrix技术进行转录谱分析27以及质谱法蛋白质组学分析28，已获得原代IMCD细胞中表达的mRNA和蛋白质的全面列表（另见http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd）。

原代IMCD细胞的局限性与其他许多原代细胞类似，包括转染效率低（≈ 1%）29因此，只有通过显微注射编码质粒或蛋白质本身，才几乎可以实现蛋白质的过表达。例如30）。另一个局限性是原代IMCD细胞缺乏正常的细胞极性。在AVP作用下，AQP2主要转位至基底侧质膜（图2）。我们尝试诱导出正确的极性， 即 迄今为止，通过在不同滤膜上培养细胞以诱导水通道蛋白2（AQP2）向顶膜质膜转位的方法尚未成功。

综上所述，如上所述建立的原代IMCD细胞具有调控AQP2的机制，因此是研究AQP2调控的合适模型。然而，其使用需要动物，因此应仅限于无法在其他已建立的模型系统中进行的实验，以及对在其他模型系统中获得的结果进行验证。

披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG；KL 1415/3-2 和 KL 1415/4-2）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠 IV 型胶原蛋白BD Biosciences356233
透明质酸酶SIGMAH6254
CLS-II 型胶原酶Biochrom AGC2-22
DMEM + GlutMAXInvitrogen GIBCO21885108
制霉菌素SIGMAN4014
Ultroser GCytogen15950-017
非必需氨基酸（NEA）Biochrom AGK0293
庆大霉素Invitrogen GIBCO15710
DBcAMPBIOLOGD009

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

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Enno Klussman

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