精氨酸加压素（AVP）通过促进肾集合管主细胞对水的重吸收，调控机体水平衡的精细调节。本文介绍一种适用于研究AVP介导的水重吸收分子机制的原代大鼠肾髓质内层集合管细胞的培养方案。
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摘要
摘要
精氨酸加压素（AVP）通过促进肾集合管主细胞对水的重吸收，从而精细调节机体的水稳态。AVP 与主细胞表面的血管加压素 V2 受体（V2R）结合，诱导细胞内 cAMP 的合成。这会激活细胞信号通路，导致水通道蛋白-2（AQP2）的磷酸化状态发生改变。蛋白激酶 A 对 AQP2 进行磷酸化，从而触发 AQP2 从细胞内囊泡转位至细胞膜，促进原尿中水分的重吸收。若垂体释放 AVP 异常或主细胞中 AVP 激活的信号通路出现障碍，可分别导致中枢性或肾源性尿崩症；而血浆 AVP 水平升高则与慢性心力衰竭及抗利尿激素分泌不当综合征等心血管疾病相关。
本文介绍了一种原代大鼠肾髓质集合管（IMCD）细胞的培养方案，该细胞内源性表达V2R和AQP2。这些细胞适用于阐明调控AQP2的分子机制，从而发现治疗与精氨酸加压素（AVP）介导的水重吸收失调相关疾病的新型药物靶点。IMCD细胞来源于大鼠肾脏内髓质，接种后六至八天即可用于实验。IMCD细胞可在常规细胞培养皿、培养瓶以及不同规格的微孔板中培养，操作过程仅需数小时，适合标准细胞培养实验室开展。
引言
在肾集合管主细胞中，精氨酸加压素（AVP）通过促进水通道蛋白-2（AQP2）插入质膜，调控水的重吸收。AVP 与G蛋白偶联的加压素2型受体（V2R）结合，激活腺苷酸环化酶，从而促进cAMP的生成。该信号通路的启动导致蛋白激酶A（PKA）的活化。PKA在丝氨酸256位点（S256）对AQP2进行磷酸化，这是促使AQP2从细胞内囊泡重新分布至质膜的关键触发因素。膜上的插入使水能够顺着渗透梯度被重吸收，从而精细调节机体的水稳态。
由于精氨酸加压素（AVP）分泌异常或AVP激活的信号通路失调，导致AVP介导的水重吸收功能紊乱，可引起或与多种严重疾病相关。由V2R或AQP2基因突变引起的水重吸收减少会导致肾性尿崩症；而血浆AVP水平升高则与心血管疾病（如慢性心力衰竭）以及抗利尿激素分泌不当综合征（SIADH）中过度的水重吸收相关。
精氨酸加压素（AVP）介导的水重吸收的重要性不仅体现在其与疾病的相关性上。AVP诱导携带水通道蛋白2（AQP2）的囊泡向细胞膜转运并与其融合，这一过程是一种严格依赖cAMP的胞吐作用，目前尚未被充分阐明。其他依赖cAMP的胞吐作用实例包括肾脏中肾素的分泌以及胃中H+的分泌。因此，阐明肾集合管主细胞中调控AQP2转运的分子机制，不仅有助于理解其他细胞类型中类似的分子过程，还可能为治疗与AVP介导的水重吸收障碍相关疾病的新型疗法提供方向。
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方案
1. 准备
- 准备培养皿
- 在 4 °C 下过夜解冻 IV 型胶原蛋白，并用 0.1% 无菌乙酸溶解。使用体积取决于接种细胞所用培养皿的类型和数量。使用量为 2 μg/cm2。
- 在室温下孵育培养皿至少 1 小时，并用蒸馏水（A. tridest）洗涤两次。
- 让培养皿充分干燥。
- 培养基的添加成分
- 通过向 500 ml 培养基中加入 1.75 g 葡萄糖，将葡萄糖浓度提高至 4.5 g/L。为将培养基调整至 600 mosmol，加入 100 mM NaCl 和 100 mM 尿素，分别使渗透压增加 200 mosmol 和 100 mosmol。
- 在配制当天，向 600 mosmol 的 DMEM 培养基中新鲜加入 1% 非必需氨基酸、1% Ultroser、500 μM DBcAMP、20 U/ml 制霉菌素和 0.25 μg/ml 庆大霉素（用浓度为 50 μg/ml 的储备液按 1:200 稀释）。
- 酶溶液
- 将 1 mg/ml 透明质酸酶和 2.2 mg/ml 胶原酶加入含 0.25 μg/ml 庆大霉素和制霉菌素的 DPBS 中。每消化 2 个肾脏内髓组织，准备 1 ml 该酶溶液。溶液需经滤膜除菌，并储存于 50 ml Falcon 管中。 ....
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结果
原代大鼠IMCD细胞成功培养后，接种6-8天即可形成融合的单层细胞（图2）。每个60 mm培养皿中约含有6 × 106个细胞。由于培养皿预先包被了作为基底膜成分的IV型胶原蛋白18，细胞可牢固贴附于培养皿表面，因此即使经过多次彻底的洗涤操作，IMCD细胞也不会脱落。培养的细胞中最多有80%内源性表达V2R和AQP2，这些为集合管主细胞；而不表达AQP2的细胞则被认为是闰细胞，或来源于亨利袢细段、直小血管或髓质内间质细胞的非IMCD细胞。如我们先前所述，600 mosmol的培养基渗透压可防止AQP2的下调19。此外，通过在培养基中添加膜通透性cAMP类似物DBcAMP，可维持AQP2的表达。为了降低AQP2在细胞膜上的表达水平，从而促进其在细胞内的定位，IMCD细胞在实验前应于不含DBcAMP的条件下培养约24小时。若在对照条件下大部分AQP2仍定位于细胞膜，则应延长无DBcAMP培养的时间。使用标准缓冲液裂解60 mm培养皿中生长的细胞，可获得约1.5 mg蛋白质10。
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讨论
我们提供了一种详细的原代大鼠IMCD细胞制备与培养方案。该方法可从一只大鼠获得最多21 cm2的细胞20。实验仅需标准的细胞培养设备，由单人操作约6小时内即可完成。因此，该方法适用于作为常规的实验室技术。
原代大鼠IMCD细胞可接种于不同规格的培养皿中，范围从96孔板到60 mm培养皿均可。然而，若需在384孔板中培养，则该操作流程需要优化。我们避免使用大于60 mm的培养皿，因为细胞生长速度会减缓。这些细胞适用于多种实验，如蛋白质印迹（Western blotting）、免疫共沉淀、DNA/RNA提取、免疫荧光显微镜检测、Ca2+成像以及电生理学实验10,22,23。
接种后约6至8天，原代IMCD细胞生长形成融合的单层细胞（图2）。细胞平均高度为3 - 5 μm24，细胞间紧密连接，并维持较高水平的内源性AQP2表达。AQP2的免疫荧光显微检测表明，多达80%的细胞为AQP2阳性的.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG；KL 1415/3-2 和 KL 1415/4-2）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠 IV 型胶原蛋白 | BD Biosciences | 356233 | |
| 透明质酸酶 | SIGMA | H6254 | |
| CLS-II 型胶原酶 | Biochrom AG | C2-22 | |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 | |
| 制霉菌素 | SIGMA | N4014 | |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 | |
| 非必需氨基酸（NEA） | Biochrom AG | K0293 | |
| 庆大霉素 | Invitrogen GIBCO | 15710 | |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
参考文献
- Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Chara....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.
A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Enno Klussmann
instead of:
Enno Klussman
