实现对细胞过程的系统水平理解是当代细胞生物学的目标。本文介绍了利用全基因组规模的RNA干扰文库，通过多重荧光素酶报告系统检测多种细胞功能终点以研究基因功能的策略。
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摘要
摘要
利用RNA干扰（RNAi）在基因组规模上探究基因功能，有望快速识别出具有药物开发潜力的癌细胞脆弱位点。然而，该技术的潜力受限于难以快速阐明表型结果的分子机制，从而阻碍了分子靶向治疗策略的开发。本文概述了一种利用多重报告系统解析RNAi介导的基因靶向所诱导的细胞表型的方法，该系统可监测关键的癌细胞相关过程。这种高内涵筛选方法具有高度灵活性，可轻松适用于其他大型分子文库的筛选。
引言
目前市面上有多种基于荧光素酶的报告系统，可用于监测多种细胞生物学过程。这些DNA载体中的大多数编码荧光素酶蛋白，其表达可被特定的细胞刺激或扰动所诱导。其中最为可靠的转录水平报告系统，是将荧光素酶的表达置于合成增强子元件或已确立的基因启动子区域的控制之下，这些元件因其在报告生理相关转录事件方面的可靠性而被广泛认可1,2。此外还存在反式报告系统（trans-reporter）的荧光素酶系统，利用GAL4-UAS系统驱动荧光素酶蛋白的表达。Gal4是一种酵母转录激活因子，UAS是Gal4特异性结合的增强子序列，可激活其下游基因序列的转录3。这类荧光素酶系统通常需要两种DNA质粒共同支持：一种编码与目标蛋白调控区域融合的GAL4蛋白，另一种编码受一个或多个UAS序列调控的荧光素酶蛋白。因此，细胞内的荧光素酶信号水平反映了目标蛋白的活性程度。荧光素酶报告系统的另一种常见用途是监测蛋白质稳定性，即将目标蛋白与荧光素酶融合表达4。无论采用何种类型的报告系统，此处需特别提醒：不能假定任何报告系统的特异性都已得到充分验证。因此，在研究策略中引入新的报告载体时，必须进行严谨的验证与评估。
选择荧光素酶检测系统的重要性可能与调控其表达的DNA元件的可靠性同样重要。尽管萤火虫荧光素酶（FL）是目前商业载体中最常用的酶，但新型荧光素酶报告系统的出现——例如不依赖ATP（与基于FL的反应不同）或采用更稳定且信号更强的酶——有望提高该研究平台的效率与可靠性。在化学研究中选择荧光素酶报告系统时，一个重要的注意事项是FL易受化学物质抑制，可能导致假阳性结果。根据我们的经验，其他使用腔肠素作为底物的酶，如Renilla荧光素酶和Gaussia荧光素酶（分别记为RL和GL），受小分子抑制的影响较小5。
多重荧光素酶检测最常用的格式主要采用萤火虫荧光素酶（FL）和海肾荧光素酶（RL），这主要得益于市面上存在大量易于使用的试剂盒，能够对同一样本依次检测两种酶的活性。在大多数试剂盒中，样本首先与荧光素（luciferin）反应，以检测FL活性；随后加入淬灭试剂，并同时添加腔肠素（coelenterazine），从而产生第二步的RL信号。随着其他可分泌型荧光素酶（如GL）或使用不同底物的荧光素酶（如Cypridina荧光素酶，CL）的引入，利用荧光素酶生成高通量数据的可能性进一步扩大。采用该技术进行全基因组RNA干扰筛选的一个实例可参见此处6。这些技术进步反过来推动了特异性淬灭机制的发展，以针对每种荧光素酶实现有效抑制，从而减少信号串扰7。根据我们的经验，使用GL或CL等可分泌型荧光素酶时，“边缘效应”（即高通量培养板边缘细胞活性出现无法解释的趋势）的发生频率更高。然而，这类可分泌型荧光素酶在动力学检测中具有优势，因其可在不干扰细胞活力的前提下实现信号的连续取样。
在本研究中，我们将同时监测三种与癌症相关的细胞过程的活性：p53、Kras 和 Wnt 信号转导通路。本研究所采用的报告系统包括 Clontech 公司的 pp53-TA-Luc FL 报告子（下文简称 p53-FL 报告子）8、Elk1-GAL4/UAS-CL 报告系统（下文简称 Elk-1 报告子；Agilent 公司），以及包含多个合成增强子元件的 8X TCF RL 报告子，这些增强子元件可被 Wnt 通路的转录调控因子——T 细胞因子（简称 TCFs）——所识别9-11。
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方案
整个实验方案大约需要4天。
1. siRNA 和报告基因转染用细胞的准备
本文将以全基因组范围的siRNA文库中的一小部分siRNA（384种不同的siRNA混合物，以96孔板形式排列，每种混合物包含4条靶向同一基因的siRNA）为例，介绍利用siRNA文库进行功能筛选的实验方案。在本项研究中，我们将采用具有异常Wnt和Kras信号通路以及p53活性的HCT116细胞。在针对其他特定细胞生物学过程的研究中，需以类似方式鉴定并评估适合的细胞系。
- 用 PBS 洗涤 5 块 80–90% 汇合度的 HCT116 细胞（每块 10 cm2），然后每块加入 1 ml 消化液进行胰蛋白酶消化，再加入 10 ml 含 2% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）终止消化，收集细胞。
- 将悬浮细胞转移至 50 ml 圆底离心管中，在约 130 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清液，用 10 ml 含 2% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 重悬细胞沉淀。
- 使用细胞计数仪计数细胞，配制浓度为 105 个细胞/ml 的细胞悬液，保留 150 ml 细胞悬液用于下一步实验。使用 Multidrop 自动液体分配仪（以下简称 Multidrop）将 104 个细胞（100 μl）接种至 96 孔细胞培养板的每个孔中。此细胞悬液量足以接种 12 块 96 孔板。
- 将接种细胞的培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育，同时准备转染混合物。
2. 准备报告基因构建体储备溶液
- 使用标准中量提取试剂盒（Clontech 公司生产的 NucleoBond Xtra Midi）分离高质量的报告基因质粒 DNA，并将每种报告基因质粒 DNA 稀释至终浓度为 1 mg/ml。
- 通过混合 30 μl p53-FL、30 μl 8X TCF-RL、30 μl Elk1-Gal4、6 μl UAS-CL 和 4 μl H2O，配制 100 μl 报告基因质粒混合储备液，使各报告基因质粒的终比例为 1:1:1:0.2。该 DNA 混合储备液的终浓度为 0.3 mg/ml。
3. 准备siRNA/DNA转染混合物
在本实验方案中，我们将配制siRNA/DNA转染混合物，其用量足以用于12块96孔板的转染。针对本实验所用的4块96孔板siRNA文库，我们将对每种siRNA混合物进行三复孔转染。所使用的转染试剂为Effectene（Qiagen）。据我们经验，这是唯一一种能够实现将siRNA与DNA同时导入培养细胞的有效试剂。
- 将80 μl报告基因构建体质粒储备液加入8 ml EC缓冲液（Effectene试剂盒）中稀释，得到终浓度为3 μg/ml的DNA溶液。通常情况下，应现配现用，制备足量的DNA溶液混合物。
- 将20 μl上述DNA溶液加入96孔板的每一孔中。所需96孔板的数量取决于待检测的siRNA文库数量。例如，本实验中需使用4块96孔板以评估384种不同的siRNA文库。
- 待测siRNA的储备浓度应为5 μM。若浓度不符，可使用各文库推荐的稀释缓冲液进行重排和稀释至该浓度。
- 使用Biomek自动化液体处理系统，将每种5 μM的siRNA储备液2 μl转移至含有稀释后DNA储备液的PCR板对应孔中。根据实验规模，也可使用多通道移液器完成此步骤。
- 向DNA/siRNA混合板的每一孔中加入1 μl增强剂溶液（Effectene试剂盒）。此步骤同样可使用自动化液体处理系统或多通道移液器完成。
- 室温孵育5分钟以进行增强剂反应，随后向每孔加入3 μl Effectene转染试剂，继续在室温下孵育10分钟。
- 为终止转染复合物的形成，向PCR板每孔中加入10 μl DMEM/2% FBS/1%青霉素-链霉素溶液。
- 将10 μl转染混合物转移至含有细胞的96孔板（从细胞培养箱中取出）的每一孔中。由于每项转染实验均设三个重复，相同混合物还需加入另外两块含细胞的96孔板中。
- 将加入转染混合物的细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育36小时。
4. 测定细胞样品的荧光素酶活性
转染细胞中荧光素酶活性在36小时后即可进行检测。实验终点应根据具体实验条件确定。在本研究中，36小时的孵育时间已能产生足够强的信号以进行有意义的结果判断。由于本研究采用了多个报告基因（一个分泌到培养基中，另外两个在细胞质中表达），我们将从培养基以及细胞裂解液中分别获取检测结果。
- 检测培养基中的CL活性：
- 使用Biomek液体处理系统或多通道移液器，将20 μl培养基复制点样至白色不透明的96孔板中。
- 向每孔加入20 μl CL检测缓冲液（Targeting Systems）。
- 向每孔加入10 μl Cypridina 荧光素底物（Targeting Systems），并使用发光仪（例如BMG公司生产的Pherastar酶标仪）检测CL活性。
- 检测FL和RL活性：
- 首先移除培养基以裂解细胞。可通过将培养板倒置并迅速将培养基倒入水槽中实现快速去除。残留的培养基可通过将倒置的培养板轻轻在纸巾上轻拍去除。使用Multidrop向每孔细胞中加入30 μl 1×被动裂解缓冲液（Promega），并将培养板置于平台摇床上（Bellco为生产此类设备的公司之一），在室温下以中等速度摇动5分钟。
- 使用Multidrop向每孔加入20 μl荧光素酶检测试剂II（Promega双荧光素酶检测试剂盒的一部分），立即使用发光仪检测FL活性。随后加入终止与Glo试剂（Stop & Glo Reagent，Promega），以淬灭FL活性并检测RL活性。注意：除非使用可延长信号持续时间的底物混合物（如Promega的Dual-Glo荧光素酶检测试剂盒），否则使用闪光型试剂盒时需在加入底物后迅速进行检测（5分钟内）。
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结果
尽管通过大规模基因组测序已取得在绘制多种癌症突变图谱方面的进展12-14，但我们仍未建立将这些发现系统性转化为干预策略的方法。在结直肠癌（CRC）中，99%的肿瘤存在影响三种细胞过程组分的突变——Wnt/β-catenin、p53和Kras信号通路，提示这些过程是肠道细胞转化的关键驱动因素13。因此，癌症基因组数据集可能富集了支持共性癌症促进过程的基因，这些基因可被用于快速识别癌细胞的脆弱性。为验证这一假设，我们设计了适用于高通量检测基因在Wnt/β-catenin、p53和Kras信号通路中功能的策略。我们首先在单个报告系统测试中证明了每种报告系统的特异性（图1），随后提供了证据表明这些报告系统可联合使用，以同时检测这三种重要细胞过程的基因活性（图2）。
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讨论
目前有多个供应商提供基于荧光素酶的报告系统（如 Promega、Targeting Systems、New England BIolabs 和 Thermo Fisher），为首次开展高通量筛选的研究人员提供了有用的在线资源。此外，已有大量优秀的综述文章探讨了如何优化高通量筛选以用于基因发现，以及如何将基于 RNA 干扰（RNAi）的筛选结果与其他组学（-omics）数据集进行整合，这些资料将大有裨益15,16。关于如何从高通量筛选中选择“阳性结果”（hits）的方法，属于另一个超出本报告范围的讨论主题，目前已有若干相关综述可供参考17,18。然而，验证基于转录激活报告系统的筛选结果时，一个关键标准是：相同的扰动因子（基于 RNAi 或化学物质）能否在使用 RT-PCR、qPCR 或微阵列分析检测时，对已验证的目标基因产生相同效应。此外，需注意的是，报告系统所测得的响应幅度通常高于内源性基因的诱导水平，因为成功构建的合成报告系统的一个特点就是能够提供强而稳健的信号。最后，这种共转染策略的一个优势在于，可以方便快捷地组合不同的报告系统混合物，以同时监测一组特定的细胞活动。尽管构建稳定表达报告系统...
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披露
O.K. 和 L.L. 是一项关于多重荧光素酶技术的待批准专利的发明人。
致谢
我们感谢CPRIT（RP100119）和Welch基金会（I-1665）提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| PathDetect Elk1 转录报告系统 | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| 信号通路分析荧光素酶系统 4 pp53-TA-Luc 载体 | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene 转染试剂 | Qiagen Inc. | 301427 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega Corp. | E1960 | |
| 海肾荧光素酶检测试剂 | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 细胞 | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo 细胞毒性检测 | Promega Corp. | G9260 | |
| 仪器设备 | |||
| MultiFlo 微孔板分配器 | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP 实验室自动化工作站 | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS 多模式高通量微孔板读板仪 | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert 血细胞计数板 | Hausser Scientific Company | 1490 |
参考文献
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重印与许可
