一种基于多重荧光素酶的筛选平台用于在培养细胞中研究癌症相关信号转导

摘要

实现对细胞过程的系统水平理解是当代细胞生物学的目标。本文介绍了利用全基因组规模的RNA干扰文库，通过多重荧光素酶报告系统检测多种细胞功能终点以研究基因功能的策略。

摘要

利用RNA干扰（RNAi）在基因组规模上探究基因功能，有望快速识别出具有药物开发潜力的癌细胞脆弱位点。然而，该技术的潜力受限于难以快速阐明表型结果的分子机制，从而阻碍了分子靶向治疗策略的开发。本文概述了一种利用多重报告系统解析RNAi介导的基因靶向所诱导的细胞表型的方法，该系统可监测关键的癌细胞相关过程。这种高内涵筛选方法具有高度灵活性，可轻松适用于其他大型分子文库的筛选。

引言

目前市面上有多种基于荧光素酶的报告系统，可用于监测多种细胞生物学过程。这些DNA载体中的大多数编码荧光素酶蛋白，其表达可被特定的细胞刺激或扰动所诱导。其中最为可靠的转录水平报告系统，是将荧光素酶的表达置于合成增强子元件或已确立的基因启动子区域的控制之下，这些元件因其在报告生理相关转录事件方面的可靠性而被广泛认可^1,2。此外还存在反式报告系统（trans-reporter）的荧光素酶系统，利用GAL4-UAS系统驱动荧光素酶蛋白的表达。Gal4是一种酵母转录激活因子，UAS是Gal4特异性结合的增强子序列，可激活其下游基因序列的转录³。这类荧光素酶系统通常需要两种DNA质粒共同支持：一种编码与目标蛋白调控区域融合的GAL4蛋白，另一种编码受一个或多个UAS序列调控的荧光素酶蛋白。因此，细胞内的荧光素酶信号水平反映了目标蛋白的活性程度。荧光素酶报告系统的另一种常见用途是监测蛋白质稳定性，即将目标蛋白与荧光素酶融合表达⁴。无论采用何种类型的报告系统，此处需特别提醒：不能假定任何报告系统的特异性都已得到充分验证。因此，在研究策略中引入新的报告载体时，必须进行严谨的验证与评估。

选择荧光素酶检测系统的重要性可能与调控其表达的DNA元件的可靠性同样重要。尽管萤火虫荧光素酶（FL）是目前商业载体中最常用的酶，但新型荧光素酶报告系统的出现——例如不依赖ATP（与基于FL的反应不同）或采用更稳定且信号更强的酶——有望提高该研究....

方案

整个实验方案大约需要4天。

1. siRNA 和报告基因转染用细胞的准备

本文将以全基因组范围的siRNA文库中的一小部分siRNA（384种不同的siRNA混合物，以96孔板形式排列，每种混合物包含4条靶向同一基因的siRNA）为例，介绍利用siRNA文库进行功能筛选的实验方案。在本项研究中，我们将采用具有异常Wnt和Kras信号通路以及p53活性的HCT116细胞。在针对其他特定细胞生物学过程的研究中，需以类似方式鉴定并评估适合的细胞系。

1. 用 PBS 洗涤 5 块 80–90% 汇合度的 HCT116 细胞（每块 10 cm²），然后每块加入 1 ml 消化液进行胰蛋白酶消化，再加入 10 ml 含 2% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）终止消化，收集细胞。
2. 将悬浮细胞转移至 50 ml 圆底离心管中，在约 130 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清液，用 10 ml 含 2% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 重悬细胞沉淀。
3. 使用细胞计数仪计数细胞，配制浓度为 10⁵ 个细胞/ml 的细胞悬液，保留 150 ml 细胞悬液用于下一步实验。使用 Multidrop 自动液体分配仪（以下简称 Multidrop）将 10⁴ 个细胞....

结果

尽管通过大规模基因组测序已取得在绘制多种癌症突变图谱方面的进展^12-14，但我们仍未建立将这些发现系统性转化为干预策略的方法。在结直肠癌（CRC）中，99%的肿瘤存在影响三种细胞过程组分的突变——Wnt/β-catenin、p53和Kras信号通路，提示这些过程是肠道细胞转化的关键驱动因素¹³。因此，癌症基因组数据集可能富集了支持共性癌症促进过程的基因，这些基因可被用于快速识别癌细胞的脆弱性。为验证这一假设，我们设计了适用于高通量检测基因在Wnt/β-catenin、p53和Kras信号通路中功能的策略。我们首先在单个报告系统测试中证明了每种报告系统的特异性（图1），随后提供了证据表明这些报告系统可联合使用，以同时检测这三种重要细胞过程的基因活性（图2）。

讨论

目前有多个供应商提供基于荧光素酶的报告系统（如 Promega、Targeting Systems、New England BIolabs 和 Thermo Fisher），为首次开展高通量筛选的研究人员提供了有用的在线资源。此外，已有大量优秀的综述文章探讨了如何优化高通量筛选以用于基因发现，以及如何将基于 RNA 干扰（RNAi）的筛选结果与其他组学（-omics）数据集进行整合，这些资料将大有裨益^15,16。关于如何从高通量筛选中选择“阳性结果”（hits）的方法，属于另一个超出本报告范围的讨论主题，目前已有若干相关综述可供参考^17,18。然而，验证基于转录激活报告系统的筛选结果时，一个关键标准是：相同的扰动因子（基于 RNAi 或化学物质）能否在使用 RT-PCR、qPCR 或微阵列分析检测时，对已验证的目标基因产生相同效应。此外，需注意的是，报告系统所测得的响应幅度通常高于内源性基因的诱导水平，因为成功构建的合成报告系统的一个特点就是能够提供强而稳健的信号。最后，这种共转染策略的一个优势在于，可以方便快捷地组合不同的报告系统混合物，以同时监测一组特定的细胞活动。尽管构建稳定表达报告系统.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
PathDetect Elk1 转录报告系统	Agilent Technologies Inc.	219005
信号通路分析荧光素酶系统 4 pp53-TA-Luc 载体	Clontech Lab Inc.	631914
Effectene 转染试剂	Qiagen Inc.	301427
双荧光素酶报告基因检测系统	Promega Corp.	E1960
海肾荧光素酶检测试剂	Targeting Systems	VLAR-1
HCT116 细胞	ATCC	CCL-247
CytoTox-Fluo 细胞毒性检测	Promega Corp.	G9260
仪器设备
MultiFlo 微孔板分配器	Labsystems Inc.	Model 832
Biomek FXP 实验室自动化工作站	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS 多模式高通量微孔板读板仪	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Bright-Line Reichert 血细胞计数板	Hausser Scientific Company	1490