相关显微镜的动力相互作用的三维结构分析

Summary

我们描述了相关显微镜方法，结合高速的3D活细胞荧光显微镜和高分辨率低温电子断层扫描。我们的相关方法，小HIV-1颗粒与宿主相互作用的HeLa细胞成像动态演示的能力。

Abstract

低温电子断层扫描（cryoET）允许蜂窝结构的三维可视化分子分辨率在接近生理状态^1。然而，直接可视化的个别病毒复合物在宿主细胞环境与cryoET是具有挑战性的^，由于病毒进入的偶发性和动态特性，特别是在HIV-1的情况下。虽然时间推移活细胞成像已经取得了很大的许多方面的信息生命周期的HIV-1 ^3-7，所提供活细胞显微镜的分辨率是有限的（约200纳米）。我们工作的目的是允许直接可视化的HIV-1感染的早期事件的相关方法相结合，活细胞荧光光学显微镜，低温荧光显微镜，cryoET的发展。在这种方式下，活细胞和低温荧光信号可以被用来准确地引导在cryoET采样。此外，结构从cryoET可以得到的信息ê辅以动态功能数据获得通过活细胞成像的荧光标记的目标。

在这个视频文章中，我们提供了详细的方法和协议结构的研究HIV-1和宿主细胞的相互作用，使用3D相关高速活细胞成像和高分辨率cryoET的结构性分析。 HeLa细胞感染HIV-1的颗粒，其特征在于第一活细胞共聚焦显微镜，并含有相同的病毒颗粒的区域，然后通过低温电子断层扫描三维结构的细节。使用两套成像数据，光学成像和电子成像之间的相关性达到了一个家庭建造的低温荧光光学显微镜阶段。这里详细的做法将是有价值的，不仅为研究病毒宿主细胞的相互作用，同时也为在细胞生物学的更广泛的应用，如细胞信号传导，膜受体贩运，和许多其他动态细胞过程。/ P>

Introduction

低温电子断层扫描（cryoET）是一个功能强大的成像技术，可以使细胞和组织的三维（3D）的可视化，并提供洞察组织在接近生理状态¹的原生细胞器和细胞结构分子分辨率。然而，固有的低对比度冷冻水合未染色的标本，结合其辐射敏感性，使得它很难感兴趣的区域的单元格内，并随后执行倾斜系列的不破坏目标区域的情况下成功。为了克服这些问题，相关的方法，结合光学和电子显微镜是必要的。强调的荧光标记的特定的功能是确定和荧光光镜位于，然后它们的坐标被传输到采集的高分辨率三维结构数据的电子显微镜。此相关方法有助于定位目标相对的利益加以解决。由于与冷冻蚀刻电镜（小于300 nm）对样品厚度的限制，目前仅在小区的周边区域是合适的三维结构分析CryoET的。由冷冻水合标本的厚度进一步减少玻璃体切片或冷冻聚焦离子束（FIB）铣⁹将扩大相关成像能力。

此前，相关的方法进行主要用于促进cryoET数据采集，大和静态结构^10-13。在这些研究中，低温阶段已经实施，接受冷冻蚀刻电镜电网和适合到一个堂堂正正的显微镜倒置显微镜^10,11,14。虽然开关网格似乎相当简单，在他们的设计中，还有额外的步骤为EM网格传输，提高电网可能会变形，损坏和污染的机会。我们最近展示了技术的进步相关显微镜，使我们能够直接可视化动态本质上是很难捕捉到的事件，如HIV-1和宿主细胞的相互作用，在感染的早期阶段^15。我们做到了这一点，设计和实施低温光镜样品阶段，适应的盒系统，以尽量减少由于网格处理的试件破坏，从而促进相关。我们的设计包括一个集成的试​​样盒保持器，使冷冻光低温电子显微镜进行，顺序，在相同的试样夹持器，没有样品的传输，从而简化相关工艺。此外，我们还实施了准确，可靠的相关程序，使用荧光乳胶珠作为基准标记。

Protocol

1。文化对HeLa细胞碳包覆，黄金EM搜索网格

1. 辉光放电的碳 - 侧的200目R2 / 2的Quantifoil合金EM取景网格下25毫安，持续25秒。
2. EM网格纤维连接蛋白，漂浮，碳端下来，到50微克/毫升纤维连接蛋白溶液40微升滴外套，然后消毒，在紫外光下2小时，在组织培养罩。
3. 铠到网格密度为2×10 ^4个细胞/毫升（总共有2毫升培养）在玻璃底培养皿的HeLa细胞和生长的细胞在DMEM，在37℃，5％CO _2，添加有4.5 g / L的L-谷氨酰胺，葡萄糖，10％热灭活小牛血清，100单位/ ml青霉素，100μg/ ml的链霉素，约18小时。 HeLa细胞被感染后，O / N文化。

2。 HIV-1感染与活细胞成像

1. 添加荧光细胞（红CMTPX 1微升/ 2毫升）跟踪到玻璃底文化菜（步骤1.3），盘在37℃下孵育10分钟，从而使要的荧光染料。
2. 用PBS清洗细胞，并添加50μl的预热的新鲜培养基中。
3. 将菜到活细胞室，在37℃，掠现场共聚焦扫描显微镜。选择多个字段（10-15位）包含1-3细胞/平方米，与两个有丝分裂阶段的细胞之间传播出来，平面（参见图2c和2d），因为冷冻蚀刻电镜时，需要比较薄的区域的样品。未来成像（步骤2.5）存储这些位置。
4. 感染细胞与VSV-G伪类型的HIV-1颗粒含有GFP-Vpr的（我们用40微升的样品含有40 ng / ml的p24的）。当添加病毒颗粒进入底部的菜，要小心，不要打扰EM电网，因为成像的位置已经被选择和存储。
5. 除了病毒颗粒后，立即收集TI我告失效高速3D共聚焦图像，在先前选定的位置（从第2.3步）20-40分钟。
6. 共聚焦图像被收购使用Metamorph Imaris里软件（ 见图1）单粒子动力学使用的自动3D粒子跟踪分析。由于我们是关联的动态行为衍射极限的HIV-1颗粒与细胞的超微结构，时间推移活细胞成像和3D粒子跟踪的结果至关重要。然而，对于一个大的和静态的结构中，一个简单的荧光图像（无活细胞）。将足够的相关性分析。

3。冷冻水合EM样品制备

为了尽量减少之间的延迟时间的最后共聚焦图像的采集和冷冻的样品固定，FEI Vitrobot的（或其他玻璃化冷冻设备）应发起并准备切入冻结期间收集的荧光共聚焦活细胞图像。

1. 打开的玻璃化的移动设备上，并设置其气候温度至22°C，湿度为100％的目标，的印迹7秒的时间，并在等待和漏到1秒的时间。
2. 将格收纳盒，并准备在柱塞杜瓦冷液态乙烷。安装杜瓦到玻璃化设备。
3. 共聚焦活细胞成像（第2节）后，立即将培养皿中，并将其转移到冰水冷铜块冷冻蚀刻电镜样品制备室。 EM电网加载到专门的镊子，并迅速对电网涂抹任何媒体。印迹手动完成，用滤纸，之后，4微升为15nm的金胎圈溶液混合，用0.2μm的荧光微球被立即放置在网格上。黄金珠被用作基准标记，以帮助断层数据收集和对应。荧光微球用于帮助荧光灯和冷冻蚀刻电镜图像之间的相关性（参见图2c-2f的 ）。
4. 镊子加载到玻璃化设备，并指示设备，涂抹和投身冻结液态乙烷^16。印迹参数优化，以达到最好的结果是:印迹时间7秒;印迹偏移，0排放时间，1秒，温度22°C，湿度100％。
5. 冷冻水合电网传输到冷冻蚀刻电镜的持有立即cryoET成像，或液氮存储杜瓦供以后使用。

4。低温荧光光学显微镜

自己组装的，冷冻的荧光样品室和舞台系统（ 图3）须进行步骤4.1-4.10。的详细规格和描述的阶段，可能会发现在军等^15。

1. 填补自增压液氮的杜瓦瓶用液氮低温荧光显微镜（参见图3a）开始前至少2小时。
2. 安装自制的冷冻-F到一个倒置荧光显微镜，如奥林巴斯IX 71 luorescence试料台^15（ 图3）。
3. 液体氮气入口的低温样品台连接的自我加压的杜瓦瓶，放入适当的容器中放置液氮溢出保护插座。干燥的氮气气体管线连接在物镜保持镜头温暖和无霜下袖子。
4. 进入低温载置台室，用于装载冷冻水合样品网格放置一个铜块平台（在图3b中的黑色箭头）。冷却下来，并通过入口管线从自我加压填充杜瓦瓶填充铜室用液氮的低温阶段。
5. 当在低温阶段达到液氮温度下（​​约4-6分钟），转移的格收纳盒（步骤3.5）的低温阶段。
6. 将冷冻水合样品电网EM标本盒上的铜块和夹克摆脱地方使用C型环（如果使用Polara镜盒），或放置预冷铜环之上（ 图3d黑箭头），保持电网的地方，也便于检索的网格后低温荧光成像（如果一个非Polara的低温电子显微镜）。
7. 将墨盒内室中的低温阶段（在图3b中的白箭头）（步骤4.6）。
8. 搜索，发现同样的病毒颗粒从活细胞成像数据。由于EM网格有一个索引，它是直接在活细胞图像和低温花期图像定位相同的粒子对电网。
9. 冷冻DIC和GFP图像采集在低温条件下，具有很长的工作（2.7-4毫米）的物镜中使用光学显微镜所识别的位置。在的低温荧光成像，定期检查液氮低温阶段和填充它，需要在-170以下，保持样品阶段℃。
10. 低温荧光成像完成后，仔细地返回标本盒铜块平台，将墨盒存放在液氮杜瓦未来cryoET分析与一个Polara系统。如果使用一个非Polara的低温电子显微镜，取出铜圈，检索样本网格，将其放置在一个网格中的收纳盒，并存储在液氮杜瓦直至试样由cryoET检查的试样。
11. 对数据进行分析，重叠冷冻DIC和GFP所获取的图像（从步骤4.9，参见图4b）和关联的GFP信号在低温与活细胞成像系列中得到的荧光图像中的位置。

5。低温电子断层扫描

1. 装入样品盒，电子显微镜，场发射枪，如Polara G2显微镜配备到冷冻中转站。
2. 在低剂量搜索模式时，在140X的放大倍数下，IDEntify成舞台文件，并保存相关的方格（从步骤4.11）。
3. 以3500倍的倍率下的低剂量的搜索模式中，将物镜孔径为100μm，搜索和保存所有与GFP的信号转换成第二级文件的位置。
4. 在低剂量曝光模式下，调整束强度，剂量为1或2电子^{- 2}埃/缩小的倾斜轴的空白区域，使用阶段y功能，通过燃烧掉冰在不重要的碳区域几个黄金珠。
5. 低剂量对焦模式下，调整焦距〜3微米，并调节角度对准焦点的方向是平行的倾斜轴。
6. 下低剂量搜索模式，记得保存的位置（5.3），调整标本eucentric高度，并检查该地区的利益倾斜范围。采集的投影图像具有非常低的电子剂量（1〜E ^- / A ^2）在8至10微米的散焦，在博览会的URE模式，以确认相关的病毒颗粒在低温电子断层扫描。
7. 切换到低剂量对焦模式。在TEM自动功能菜单，之前自动eucentric的高度，重点区域和重点功能。
8. 收购倾斜系列的参数设置。对于图4在本文中，倾斜角度为±70°，低于和高于45°，在3°和2°倾斜递增，分别使用6微米散焦和大约70 ^- / A ²总剂量。
9. 重复步骤5.7和5.8所有保存的位置。批处理断层软件可用于自动数据采集的多个位置，以增加吞吐量。

6。三维重建使用IMOD ¹⁷

1. 检查原料系列倾斜调整的最小和最大密度值，并确定是否有任何要排除由于大的图像移位的视图。
2. 启动eTomo和安装断层扫描面板采用轴类型，像素大小，基准直径等 。然后创建COM脚本。
3. 配置的主窗口中的断层图像计算的几个阶段的同时可以调整/其次。修改必要的参数，并执行所要求的每一个加工步骤（查看eTomo教程， http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ）的具体方案。
4. 在最后阶段，创建一个完整的对齐堆栈（平均剩余误差小于0.6），并使用加权反投影算法在IMOD重建断层扫描。
5. 去噪潜在的感兴趣的领域使用3D非线性各向异性扩散边缘增强程序IMOD实施适当的参数，以提高对比度和清晰度。

Results

为特征的病毒颗粒的动态行为，用HIV-1感染的HeLa细胞中，通过高速活细胞共聚焦显微镜成像和粒子运动由自动化的三维粒子跟踪的（ 图1）进行了分析。几分钟之间可能发生的收集，最后的活细胞共聚焦图像和小型冷冻（其可以是足够长的时间失去相关性的HIV-1颗粒），低温荧光显微镜阶段（ 图3中 ，以避免时间的推移）的设计和构造成像冷冻水合样品^15，冷冻蚀刻电镜匣内，光显微镜。铜块平台（ 图3b中 ，黑色箭头）和铜圈（ 图3D，慈姑）添加使用与非Polara的电子显微镜。聚焦活细胞，冷冻荧光光镜，cryoET之间的相关性达到了使用索引黄金的Quantifoil电网和0.2万亩米;荧光胶乳有孔玻璃珠（ 图2）。综上所述， 图4展示了先进的相关活细胞显微镜和低温电子断层扫描可视化荧光标记的HIV-1颗粒与主机HeLa细胞相互作用的整体过程的可行性。

Discussion

我们已经提出了一个简单的协议，提供了先进的方法来分析相关动态的细胞活动，使用时间推移共聚焦活细胞荧光成像由cryoET其次。 3D活细胞成像高分辨率cryoET的关联我们的方法学的发展是至关重要的调查许多具有挑战性的生物学问题，如可视化与宿主细胞的罕见的，动态的（不是一成不变的，如前期报告），衍射极限的病毒粒子及其相互作用。在活细胞中的特定颗粒的空间和时间的行为，通过活细胞的分析，其特征在于，上面的定义的感染阶段的病毒 - 细胞相互作用的结构细节进行了探索。自制的冷冻光镜阶段用于，荧光光图像从活细胞和冷冻蚀刻电镜拍摄的图像，以方便直接的关系。

有几个重要的点要牢记为了有最佳的数据收集和分析。首先，采摘的时间推移共聚焦活细胞成像的多个位置时，在选定的位置应该在0.5 mm以内从EM网格的中心，由于网格的边缘干扰倾斜序列采集的视场在cryoET。此外，选择用于分析的细胞应是两个有丝分裂阶段之间，当他们是最扩频和平面。因此，薄的区域的细胞，可用的用于cryoET分析，在其最扩展阶段。为了有大多数在同一相间阶段的培养细胞，细胞周期可以同步使用双胸苷治疗，阻止细胞周期的S相¹⁸

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
DMEM 4.5 g/L 葡萄糖，含 L-谷氨酰胺	Atlanta Biologicals， Inc. Lawrenceville， GA	12-604F
纤连蛋白	Sigma，密苏里州圣路易斯	F1141-1MG	EM 网格上的 HeLa 细胞培养
细胞追踪	Invitrogen Corporation，加利福尼亚州卡尔斯巴德	C34552	红色 CMTPX
蛋白 A 金偶联物	Ted Pella， Inc.， Redding， CA	15822-1	直径 15 nm
0.2 μm 荧光微球	Invitrogen Corporation，卡尔斯巴德，CA	F8811	黄绿色荧光
热灭活胎牛血清	Invitrogen Corporation，卡尔斯巴德，CA	10082-139
青霉素-链霉素	Invitrogen Corporation，卡尔斯巴德，CA	15140-122
玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
金质定量查找器 EM 网格	Quantifoil Micro Tools， Jena， Germany	R2/2 Au NH2 200 目
PBS	Invitrogen Corporation， Carlsbad， CA	70011-044
设备
辉光放电装置 100X	EMS， Hatfield， PA
Tecnai Polara G2 电子显微镜，带场发射枪	FEI，希尔斯伯勒，俄勒冈		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI，希尔斯伯勒，俄勒
奥林巴斯 IX 71 显微镜	奥林巴斯美国公司，宾夕法尼亚州		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA（2.7-4 毫米工作距离）物镜
尼康 TiE 显微镜	尼康仪器，纽约州梅尔维尔		使用 60X/1.35 NA 油浸物镜
Sweptfield 共聚焦显微镜	Prairie Technologies， Middleton， WI
Tokai Hit 活细胞室	日本
冷冻荧光样品台	自制		由机械车间自制，设计见参考文献 15。