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方法文章

动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

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DOI：

10.3791/50386

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2013年6月24日

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1Department of Structural Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Physiology, University of Pittsburgh School of Medicine

本文内容

摘要

我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。

摘要

冷冻电子断层扫描技术（cryoET）能够在接近生理状态的条件下，以分子分辨率对细胞结构进行三维可视化1。然而，由于病毒感染过程具有稀有性和动态性，尤其是在HIV-1感染的情况下，利用cryoET直接观察宿主细胞环境中单个病毒复合物仍具挑战性2。尽管延时活细胞成像已为HIV-1生命周期的多个方面提供了大量信息3-7，但活细胞显微镜的分辨率有限（约200 nm）。我们的研究旨在开发一种联合分析方法，通过结合活细胞荧光光学显微镜、冷冻荧光显微镜和cryoET，实现对HIV-1感染早期事件的直接可视化。通过该方法，可利用活细胞和冷冻荧光信号精确引导cryoET中的采样区域。此外，cryoET获得的结构信息还可与荧光标记靶标的活细胞成像所获取的动态功能数据相互补充。

在本视频文章中，我们提供了利用三维关联高速活细胞成像与高分辨率冷冻电子断层扫描（cryoET）结构分析技术，对 HIV-1 与宿主细胞相互作用进行结构研究的详细方法与实验方案。首先通过共聚焦活细胞显微镜对感染了 HIV-1 病毒颗粒的 HeLa 细胞进行表征，随后对包含同一病毒颗粒的区域进行冷冻电子断层扫描，以获取其三维结构细节。光学成像与电子成像两组数据之间的关联，是通过自行搭建的低温荧光显微镜载物台实现的。本文详述的方法不仅对病毒与宿主细胞相互作用的研究具有重要价值，也适用于细胞生物学中更广泛的领域，例如细胞信号传导、膜受体运输以及其他多种动态细胞过程。

引言

冷冻电子断层扫描技术（cryoET）是一种强大的成像技术，能够在接近生理状态下以分子分辨率实现对细胞和组织的三维（3D）可视化，从而揭示天然细胞器和细胞结构的组织特征1。然而，未染色的玻璃态水合样品本身对比度低，且对电子束敏感，这使得在细胞内定位感兴趣区域变得困难，并且在不损伤目标区域的前提下成功完成倾转系列成像也具有挑战性。为克服这些问题，必须采用一种结合光学显微镜与电子显微镜的关联成像方法。通过荧光标记突出显示的特定结构，首先由荧光光学显微镜识别并定位，随后将其坐标转移至电子显微镜，以获取高分辨率的三维结构数据。这种关联成像方法有助于准确定位待研究的目标区域。由于冷冻电镜（cryoEM）对样品厚度有限制（<300 nm），目前仅适用于细胞周边区域的三维结构分析。若进一步通过玻璃态切片技术8或冷冻聚焦离子束（FIB）铣削技术9降低玻璃态水合样品的厚度，将有望拓展关联成像的应用范围。

此前，相关性方法主要用于促进针对大而静态结构的冷冻电子断层扫描（cryoET）数据采集10-13。在这些研究中，已开发出可容纳冷冻电镜载网并适配正置显微镜或倒置显微镜的冷冻载台10,11,14。尽管在其设计中更换载网看似相对简便，但电镜载网仍需额外的转移步骤，增加了载网发生形变、损伤或污染的风险。我们近期展示了一项相关显微技术的进展，使我们能够直接观察那些本质上难以捕捉的动态事件，例如HIV-1与宿主细胞在感染早期的相互作用15。为此，我们设计并实现了一种采用卡匣系统的冷冻光学显微镜样品载台，以最大限度减少因载网操作导致的样品损伤，从而促进相关性分析。我们的设计包含集成的样品卡匣 holder，可在同一样品 holder 上依次进行冷冻光学显微镜和冷冻电子显微镜观察，无需样品转移，从而简化了相关性流程。此外，我们还利用荧光乳胶珠作为定位标记，建立了一套准确且可靠的相关性分析流程。

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方案

1. 在碳膜覆盖的金质电镜定位网格上培养 HeLa 细胞

  1. 将200目R2/2 Quantifoil金质EM定位网格的碳膜面在25 mA下进行25秒的辉光放电处理。
  2. 通过将EM网格碳膜面朝下漂浮于40 μl浓度为50 μg/ml的纤连蛋白溶液液滴上，使网格包被纤连蛋白，随后在组织培养罩内用紫外光消毒2小时。
  3. 将HeLa细胞以2 × 104 个细胞/ml的密度（共2 ml培养液）接种到网格上，置于玻璃底培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下，使用添加了4.5 g/L L-谷氨酰胺和葡萄糖、10%热灭活胎牛血清、100 单位/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的DMEM培养基培养约18小时。HeLa细胞在过夜培养后进行感染。

2. HIV-1 感染与活细胞成像

  1. 向玻璃底培养皿（来自步骤 1.3）中加入荧光细胞示踪剂（Red CMTPX，1 μl/2 ml），在 37 °C 下孵育 10 分钟，使细胞摄取荧光染料。
  2. 用 PBS 洗涤细胞，并加入 50 μl 预热的新鲜培养基。
  3. 将培养皿置于 Swept Field Confocal 扫描显微镜的活细胞成像室中，保持 37 °C。选择多个视野（10–15 个位置），每个视野包含 1–3 个细胞/平方，且细胞处于两次有丝分裂之间、形态最铺展且扁平的阶段（参见 图 2c 和 图 2d），因为冷冻电镜需要样品相对薄的区域。保存这些位置以供后续成像（步骤 2.5）。
  4. 用含有 GFP-Vpr 的 VSV-G 假型 HIV-1 颗粒感染细胞（我们使用含有 40 ng/ml p24 的样品 40 μl）。将病毒颗粒加入培养皿底部时，需小心避免扰动 EM 载网，因为成像位置已预先选定并保存。
  5. 加入病毒颗粒后，立即在先前选定的位置（步骤 2.3）采集 20–40 分钟的高通量时间序列 3D 共聚焦图像。
  6. 共聚焦图像使用 MetaMorph 采集，并通过 Imaris 软件进行自动 3D 粒子追踪分析单个粒子的动力学行为（参见 图 1）。由于我们旨在关联衍射极限下的 HIV-1 颗粒动态行为与细胞超微结构，时间序列活细胞成像和 3D 粒子追踪对结果至关重要。然而，对于大而静止的结构，简单的荧光图像（无需活细胞成像）即可满足关联分析的需求。

3. 冷冻水合电镜样品制备

为了尽量缩短采集最后一张共聚焦图像与样品冷冻固定之间的时间间隔，应在采集荧光共聚焦活细胞图像期间启动并准备好FEI Vitrobot（或其他玻璃化冷冻设备）以进行浸入式冷冻。

  1. 打开玻璃化装置，将其环境温度设置为 22 °C，目标湿度设置为 100%， blotting 时间设置为 7 秒，等待和排液时间设置为 1 秒。
  2. 将载网储存盒放入冷冻载样杯中，并准备冷的液态乙烷。将冷冻载样杯安装到玻璃化装置上。
  3. 在共聚焦活细胞成像（第 2 节）完成后，立即将培养皿放置在冰冷却的铜块上，并转移至冷冻电镜样品制备室。将电镜载网装入专用镊子中，迅速用滤纸吸去载网上残留的培养基。随后立即在载网上滴加 4 μl 含 15 nm 金颗粒的溶液，并混入 0.2 μm 荧光微球。金颗粒作为标志物，用于辅助断层扫描数据的采集与图像对齐；荧光微球则用于辅助荧光图像与冷冻电镜图像之间的关联（见 图 2c-2f）。
  4. 将镊子装入玻璃化装置，指示装置进行滤纸吸液并迅速浸入液态乙烷中冷冻16。优化后的 blotting 参数为：blot 时间 7 秒，blot 偏移量 0，排液时间 1 秒，温度 22 °C，湿度 100%。
  5. 将冷冻水合状态的载网转移至冷冻电镜样品杆中，用于立即进行冷冻电子断层成像，或转移至液氮储存杯中以备后续使用。

4. 冷冻荧光光学显微镜

需要使用自制的低温荧光样品腔和载物台系统（图3）来完成步骤4.1–4.10。该载物台的详细规格和说明可参见 Jun et al.15。

  1. 至少在开始冷冻荧光显微成像前2小时，用液氮填充自加压液氮杜瓦瓶（见图3a）。
  2. 将自制的冷冻荧光样品台15（图3）安装到倒置荧光显微镜上，例如Olympus IX 71。
  3. 将冷冻样品台的液氮入口连接至自加压杜瓦瓶，并将液氮溢流保护出口置于合适的容器中。将干燥氮气管线连接至套在物镜外的套管，以保持镜头温暖并防止结霜。
  4. 将铜块平台（图3b中的黑色箭头）放入冷冻样品台腔体内，用于装载冷冻水合样品载网。通过自加压杜瓦瓶的进液管线向冷冻样品台的铜腔内注入液氮，使其冷却并充满。
  5. 当冷冻样品台达到液氮温度（约4–6分钟）后，将载网储存盒（步骤3.5）转移至冷冻样品台。
  6. 将冷冻水合样品载网放入铜块平台上的电镜样品 cartridge 中，并使用C形环固定载网（若使用Polara显微镜cartridge）；或在上方放置一个预冷的铜环（图3d中的黑色箭头指示），以固定载网并便于在完成冷冻荧光成像后轻松取出载网（适用于非Polara冷冻电镜系统）。
  7. 将步骤4.6中的cartridge放入冷冻样品台的内腔中（图3b中的白色箭头指示）。
  8. 根据活细胞成像数据，搜索并定位相同的病毒颗粒。由于电镜载网具有索引标记，可在活细胞图像和冷冻荧光图像中直接定位同一颗粒。
  9. 在冷冻条件下，使用配备长工作距离（2.7–4 mm）物镜的光学显微镜，在已定位的位置采集冷冻微分干涉差（DIC）和GFP图像。在冷冻荧光成像过程中，需定期检查冷冻样品台中的液氮液位，并根据需要补充，以确保样品台温度始终低于-170 °C。
  10. 完成冷冻荧光成像后，小心地将样品cartridge放回铜块平台，并将其存入液氮杜瓦瓶中，以备后续使用Polara系统进行冷冻电子断层扫描（cryoET）分析。若使用非Polara冷冻电镜系统，则需取下铜环，取出样品载网，将其放入载网储存盒中，并将样品保存于液氮杜瓦瓶中，直至进行cryoET检测。
  11. 进行数据分析时，叠加步骤4.9中获得的冷冻DIC和GFP图像（见图4b），并将冷冻荧光图像中GFP信号的位置与活细胞成像序列中的位置进行关联比对。

5. 冷冻电子断层扫描技术

  1. 将样品载网插入配备场发射枪的电子显微镜（如 Polara G2 显微镜）的冷冻转移站中。
  2. 在低剂量搜索模式下，以 140 倍放大倍数识别并保存相关网格区域（来自步骤 4.11）至一个载台文件中。
  3. 在低剂量搜索模式下，以 3,500 倍放大倍数插入 100 μm 的物镜光阑，搜索并保存所有与 GFP 信号相关的位置至第二个载台文件中。
  4. 在低剂量曝光模式下，寻找空白区域，通过在含数个金颗粒的非关键碳膜区域烧蚀冰层，利用载台 Y 功能调节电子束强度至 1 或 2 e-/Å2 的剂量，并校准倾斜轴。
  5. 在低剂量对焦模式下，将对焦距离调节至约 3 μm，并调节角度，使对焦方向与倾斜轴平行。
  6. 在低剂量搜索模式下，调用已保存的位置（来自步骤 5.3），调节样品的等中心高度，并检查感兴趣区域的倾斜范围。在曝光模式下，以极低电子剂量（约 1 e-/Å2）和 8 至 10 μm 的离焦量获取投影图像，以确认适用于冷冻电子断层成像的相关病毒颗粒。
  7. 切换至低剂量对焦模式。在透射电镜自动功能菜单中，依次执行自动等中心高度和对焦功能，作用于对焦区域。
  8. 设置获取倾斜系列图像的参数。本论文中的 图 4 采用 ±70° 的倾斜角度范围，在 ±45° 以下和以上分别以 3° 和 2° 的倾斜增量进行采集，离焦量为 6 μm，总剂量约为 70 e-/Å2。
  9. 对所有已保存的位置重复执行步骤 5.7 和 5.8。可使用批量断层成像软件实现多个位置的自动化数据采集，以提高通量。

6. 使用 IMOD17 进行三维重建

  1. 检查原始倾斜系列图像，调整最小和最大密度值，并判断是否存在因图像位移过大而需要排除的视图。
  2. 启动 eTomo 并使用轴类型、像素大小、标志物直径设置断层图面板， 等等然后创建 com 脚本。
  3. 配置主窗口，以便可同时调整和跟踪断层图计算的多个阶段。修改各处理步骤所需的参数，并执行相应的特定程序（参见 eTomo 教程， http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html).
  4. 在最后阶段，生成一个完全对齐的堆栈（平均残差误差小于0.6），并使用IMOD中的加权反投影算法重构断层图像。
  5. 使用 IMOD 中实现的三维非线性各向异性扩散边缘增强程序，选择适当参数对潜在感兴趣区域进行去噪处理，以增强对比度和清晰度。

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结果

为了表征病毒颗粒的动态行为，采用高速共聚焦活细胞显微镜对感染了 HIV-1 的 HeLa 细胞进行成像，并通过自动化的三维颗粒追踪技术分析颗粒的运动（图 1）。为了避免在采集最后一张共聚焦活细胞图像与投入冷冻之间可能发生的数分钟时间延迟（该延迟可能导致相关 HIV-1 颗粒的丢失），设计并构建了一种用于冷冻荧光光学显微镜的样品台（图 3），以便在光学显微镜下对保存于冷冻电镜样品盒中的玻璃态水合样品进行成像15。此外，添加了铜块平台（图 3b，黑色箭头）和铜环（图 3d，箭头所示），以适配非 Polara 型电子显微镜的使用。共聚焦活细胞成像、冷冻荧光光学显微镜与冷冻电子断层扫描之间的关联，通过索引金标 Quantifoil 载网和 0.2 μm 荧光乳胶微球实现（图 2）。综上所述，图 4 展示了结合先进的相关联活细胞显微技术与冷冻电子断层扫描技术，用于可视化荧光标记的 HIV-1 颗粒与宿主 HeLa 细胞相互作...

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讨论

我们提出了一套简明的实验方案，用于建立一种先进的关联分析方法，以通过共聚焦延时成像、活细胞荧光成像结合冷冻电子断层扫描（cryoET）来分析动态的细胞事件。我们将三维活细胞成像与高分辨率 cryoET 相关联的方法学发展，对于研究诸多具有挑战性的生物学问题至关重要，例如可视化稀有的、动态的（而非先前报道的静态的）、受衍射极限限制的病毒颗粒及其与宿主细胞的相互作用。通过活细胞分析，可表征特定颗粒在活细胞内的时空行为，并进一步探究在特定感染阶段病毒与细胞相互作用的结构细节。本研究采用自制的冷冻光学显微镜载台，以实现活细胞荧光光学图像与冷冻电镜（cryoEM）所获取图像之间的直接关联。

为了获得最佳的数据采集与分析效果，需要注意以下几个关键点。首先，在为共聚焦活细胞延时成像选择多个位置时，所选位置应位于EM载网中心0.5 mm范围内，因为载网边缘会影响冷冻电子断层扫描（cryoET）中倾转系列图像的视野。此外，用于分析的细胞应处于两次有丝分裂之间的间期阶段，此时细胞铺展最充分且形态扁平，因而适合cryoET分析的细胞薄区也处于最大程度伸展的状态。为了使培养中的大多数细胞处于相同的间期阶...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者感谢匹兹堡大学细胞生物学与生理学系的 Travis Wheeler 及其机械加工车间在低温荧光样品台构建方面的帮助，感谢中国科学技术大学的 Changlu Tao 和 Cheng Xu 提供的技术支持，感谢 Teresa Brosenitsch 博士对稿件的审阅。本研究由美国国立卫生研究院（GM082251 和 GM085043）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
DMEM 4.5 g/L 葡萄糖，含 L-谷氨酰胺Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA12-604F
纤连蛋白Sigma, St. Louis, MOF1141-1MG用于 EM 载网上培养 HeLa 细胞
细胞示踪剂Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAC34552红色 CMTPX
蛋白 A 金标偶联物Ted Pella, Inc., Redding, CA15822-1直径 15 nm
0.2 μm 荧光微球Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAF8811黄绿色荧光
热灭活胎牛血清Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA10082-139
青霉素-链霉素Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA15140-122
玻璃底培养皿MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
金质 Quantifoil 定位 EM 载网Quantifoil Micro Tools, Jena, GermanyR2/2 Au NH2 200 mesh
PBSInvitrogen Corporation, Carlsbad, CA70011-044
设备
辉光放电仪 100XEMS, Hatfield, PA
配备场发射枪的 Tecnai Polara G2 透射电子显微镜FEI, Hillsboro, OR300 keV
Vitrobot Mark IIIFEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 显微镜Olympus America Inc., Center Valley, PALUCPlanFLN 40X/0.6 NA（工作距离 2.7–4 mm）物镜
Nikon TiE 显微镜Nikon Instruments, Melville, NY使用 60X/1.35 NA 油浸物镜
扫描场共聚焦显微镜Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit 活细胞培养腔Tokyo, Japan
冷冻荧光样品台自制由机加工车间自制，设计参见参考文献15。

参考文献

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