联合5/6肾切除术、高盐饮食及一氧化氮合酶抑制在Lewis大鼠中诱导慢性肾脏病

摘要

介绍了一种通过手术切除Lewis大鼠5/6肾质量来建立慢性肾脏病（CKD）的两阶段方法。结合手术操作、一氧化氮合酶（NOS）抑制和高盐饮食，可建立模拟人类慢性肾脏病的动物模型，用于研究其致病机制并开发新的治疗干预手段。

摘要

慢性肾病（CKD）是一个全球性问题，延缓CKD的进展是重要的公共卫生优先事项。由于CKD以复杂的内环境稳态紊乱为特征，因此需要整合性的动物模型来研究其发生和发展。为了研究CKD的发生机制以及CKD中新型治疗干预措施，我们采用5/6肾切除消融模型，这是一种广为人知的进行性肾病实验模型，其在多个方面模拟了人类CKD的表现。肾脏质量的显著减少导致进行性肾小球和肾小管间质损伤、残余肾单位的丧失以及全身性和肾小球性高血压的发展。该模型还伴随肾内毛细血管进行性丢失、炎症反应及肾小球硬化。CKD的风险因素无一例外地影响内皮功能。为了模拟这一情况，我们将5/6肾质量切除与一氧化氮（NO）耗竭及高盐饮食相结合。动物到达实验室并经过适应期后，开始在饮水中添加NO合酶抑制剂（NG-硝基-L-精氨酸）（L-NNA，20 mg/L），持续4周，随后进行右侧单侧肾切除术。一周后，对左侧肾脏实施次全肾切除术（SNX）。SNX术后，动物恢复两天，然后继续在饮水中给予L-NNA（20 mg/L）达4周。在整个实验期间持续给予高盐饮食（6%），添加于粉碎饲料中（见时间线图1）。通过定期检测血浆尿素、收缩压和蛋白尿来监测肾功能衰竭的进展。在SNX术后六周时，已发展出肾功能衰竭。采用“金标准”的菊粉和对氨基马尿酸（PAH）清除率技术测定肾功能。该CKD模型表现为肾小球滤过率（GFR）和有效肾血浆流量（ERPF）降低、高血压（收缩压>150 mmHg）、蛋白尿（>50 mg/24 hr）以及轻度尿毒症（>10 mM）。组织学特征包括由炎症、肾小管萎缩和纤维化所反映的肾小管间质损伤，以及局灶性肾小球硬化，导致残余肾单位中健康肾小球数量大幅减少（<10%）。随访至SNX术后12周显示CKD进一步进展。

引言

由于其渐进性发展、导致终末期肾病以及相关的心血管疾病发病率和死亡率，慢性肾病（CKD）正成为日益严重的公共卫生问题¹因此，延缓慢性肾病（CKD）的进展是一项重要的健康优先事项。由于CKD的特征是体内稳态的复杂紊乱，因此需要整合型动物模型来研究CKD的发生和发展。肾脏由多种不同类型的细胞组成，这些细胞之间相互作用。这种复杂性无法被模拟 体外.

为了研究慢性肾病（CKD）中的新型治疗干预措施，我们采用五分之六肾切除消融模型，这是一种广为人知的进行性肾病实验模型，可模拟人类CKD的多个方面。^2,3肾脏质量的显著减少导致肾小球和肾小管间质损伤进行性加重、残余肾单位丢失以及全身性和肾小球内高血压的发展。该过程伴随肾内毛细血管进行性减少。⁴、炎症和肾小球硬化。慢性肾脏病的风险因素 invariably 影响内皮功能⁵我们采用了一种对慢性肾病（CKD）发展相对具有抵抗性的大鼠品系（Lewis），因此结合了切除5/6肾质量与一氧化氮（NO）耗竭的方法^{6, 7, 8} 高盐饮食⁹动物到达并适应环境后，通过饮水补充一氧化氮合酶抑制剂（L-NNA，20 mg/L），持续4周，随后进行右侧单侧肾切除术（UNX），并在术后两天继续给予L-NNA。一周后，行次全肾切除术（SNX）。 即 左侧进行三分之二肾组织切除术。单侧肾切除（SNX）术后....

方案

所有实验均按照乌得勒支实验动物委员会的动物实验伦理指南进行。本方案在作者所在机构的动物护理与使用委员会的指导和批准下实施。

在8周龄的雄性近交系Lewis大鼠（Charles River，德国Sulzfeld）中诱导慢性肾病（CKD）。大鼠饲养在光照、温度和湿度受控的标准环境中。

1. 手术准备

1. 对以下外科手术器械进行灭菌：
   • 1 把学生用组织镊，1-2 齿，12 cm
   • 1 把学生用标准型镊子
   • 2 把Semken镊
   • 1 把Mayo剪刀
   • 1 把学生用虹膜剪刀
   • 1 把Olsen-Hegar持针钳（带剪刀）
   • 毯子
2. 核对物品清单：
   • 带加热垫和照明灯的手术台
   • O₂、异氟烷
   • 纱布巾
   • 剃毛器
   • 电子天平
   • 无菌手术包
   • 无菌纱布 5x5 和 10x10
   • 70% 酒精
   • 0.9% NaCl 溶液
   • 1 ml 注射器
   • 针头（25G）
   • 明胶海绵片....

结果

次全肾切除术后，大约保留了总肾质量的1/6。图4展示了在之前两次实验中切除的右肾部分的重量，包括平均值和标准差。需要注意的是，在单侧肾切除（UNX）术后第一周，左侧肾脏会发生代偿性肥大；因此，根据右肾重量计算需切除的肾质量，总会导致实际切除量略少于原肾质量的5/6。然而，由于在手术过程中无法确定左侧肾脏的重量，此方法仍是切除约原肾质量5/6的最准确方式。

随着时间推移，慢性肾病（CKD）大鼠会出现高血压、尿毒症、贫血、蛋白尿以及肾小球滤过率（GFR）和有效肾血浆流量（ERPF）的显著下降。6周后，CKD已稳定建立，是测试干预治疗效果的合适时间点。随着时间发展，高血压和蛋白尿明显进展，而血细胞比容及肾功能（GFR和ERPF）仅呈现轻度恶化（图5）。其他在本实验中未重点关注的症状包括钙磷代谢和脂质代谢紊乱等。根据大鼠品系的不同，CKD的发展过程可能存在显著差异^{14, 15, 2}。我们通过添加高盐饮食和一氧化氮（NO）抑制剂来诱导高血压和内皮功能障碍。

讨论

在Lewis大鼠中通过手术切除5/6的肾组织，结合高盐饮食和暂时性NOS抑制，可建立一种类似于人类慢性肾病（CKD）的模型，可用于研究CKD的致病机制以及治疗干预措施的有效性。

五分之六肾切除模型是慢性肾脏病（CKD）研究中一个广为人知且被广泛描述的模型。然而，单纯切除五分之六的肾组织并不足以在所有大鼠品系中立即引发肾功能衰竭。我们采用Lewis大鼠研究基于细胞的疗法对CKD的影响，因为GFP+ Lewis大鼠²¹的存在使得能够在受体（非GFP⁺）大鼠中追踪所给予的供体细胞。Lewis大鼠对肾损伤的发生具有相对较强的抵抗性，其CKD的发展速度也较其他品系缓慢^{22, 15}。因此，我们将五分之六肾切除术与一氧化氮（NO）耗竭及高盐饮食相结合，因为这种组合更接近人类CKD的多种特征，例如高盐摄入和内皮功能障碍。读者应注意，是否需要将五分之六肾切除术与高盐饮食和/或NO耗竭联合使用，取决于实验所用大鼠品系。

我们采用两步法而非一步法进行5/6肾切除术，因为两步法对动物的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
			试剂
L-NNA	Sigma-aldrich	N5501
Spongostan 牙科用凝胶泡沫垫 1×1×1 cm	Johnson&Johnson	Ms0005
Ethicon Vicryl FS-2S 针 4/0 V392H 每包 36 根	Ethicon	V303H
Ethicon Vicryl RB-1+ 针 5/0 V303H 每包 36 根	Ethicon	V392H
布托啡诺（0.3 mg/ml）	由 Reckitt Benckiser 制药公司委托本地药房提供	未知
			设备
学生用组织镊 - 1×2 齿，12 cm	Fine Science Tools (FST)	91121-12
学生用标准型镊子	FST	91100-12
梅奥剪刀	FST	14010-15
2X Semken 镊子	FST	11008-13
学生用虹膜剪刀	FST	91460-11
Olsen-Hegar 持针器	FST	12002-14